胡 升, 黃 俊, 柯丕余, 趙偉睿, 呂常江, 王進(jìn)波, 尚龍安, 梅樂(lè)和,

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利用熒光光譜法研究脲和鹽酸胍誘導(dǎo)谷氨酸脫羧酶的去折疊

胡 升1, 黃 俊2, 柯丕余3, 趙偉睿3, 呂常江3, 王進(jìn)波1, 尚龍安1, 梅樂(lè)和1,3

(1. 浙江大學(xué) 寧波理工學(xué)院, 浙江 寧波 315100; 2. 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 浙江 杭州 310023; 3. 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州 310027)

利用熒光光譜法研究了鹽酸胍和脲誘導(dǎo)的谷氨酸脫羧酶野生酶和突變酶K413A的去折疊過(guò)程，以探索與酶穩(wěn)定性相關(guān)的構(gòu)效關(guān)系。以鹽酸胍為變性劑時(shí)，野生型酶和突變酶K413A在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm的熒光圖譜中色氨酸的最大發(fā)射峰均發(fā)生紅移，色氨酸熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)；以脲為變性劑時(shí)，兩種酶熒光圖譜中色氨酸的最大發(fā)射峰同樣發(fā)生紅移，但色氨酸熒光強(qiáng)度持續(xù)下降。無(wú)論是以鹽酸胍還是以脲作為變性劑時(shí)，野生型酶和突變酶K413A的去折疊過(guò)程都符合“三態(tài)模型”，說(shuō)明隨著變性劑濃度的增加，野生型酶和突變酶K413A先從天然態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠终郫B中間態(tài)，并最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B狀態(tài)。此外，考察了變性劑對(duì)谷氨酸脫羧酶活力的影響，當(dāng)以鹽酸胍為變性劑時(shí)，野生型酶和突變酶K413A半失活的鹽酸胍濃度分別為0.4 mol×L-1和0.7 mol×L-1，而半失活的脲濃度分別為1 mol×L-1和2 mol×L-1。研究表明，突變酶K413A的熱力學(xué)穩(wěn)定性比野生型酶更強(qiáng)，K413位點(diǎn)與GAD的結(jié)構(gòu)剛性有重要聯(lián)系。

谷氨酸脫羧酶；脲；鹽酸胍；熒光相圖法；蛋白質(zhì)去折疊

1 前 言

谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD: EC 4.1.1.15)廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞中，能專一性催化L-谷氨酸的-羧基脫羧生成-氨基丁酸(-aminobutyric acid, GABA)[1]。GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、利尿、抗驚厥、預(yù)防癲癇、改善睡眠、促進(jìn)激素分泌等多種生理功能[2,3]。GABA不僅可用于生產(chǎn)藥品和保健食品，還可用于生產(chǎn)可降解生物塑料尼龍-4[4]以及N-吡咯烷酮[5]等化工產(chǎn)品，近年來(lái)GABA的制備研究日漸受到重視。由于利用GAD或表達(dá)GAD的工程菌進(jìn)行GABA的生物制備具有生產(chǎn)周期短、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)量高以及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[6]，因此GAD的克隆、表達(dá)和性能改造研究成為GABA生物制備的研究熱點(diǎn)之一。本課題組在前期研究中從一株高產(chǎn)GABA的CGMCC 1306中克隆獲得了GAD野生酶基因[7]，并進(jìn)行了酶的重組表達(dá)和定向進(jìn)化研究，得到了多個(gè)催化性能得到顯著改善的突變酶[8,9]。其中突變酶K413A的熱穩(wěn)定性得到了明顯提高，但該突變酶與野生酶在蛋白質(zhì)折疊特征和抗變性能力上的差異尚不明確。

熒光光譜法是研究蛋白質(zhì)折疊過(guò)程、特別是在變性過(guò)程中折疊過(guò)程特征的一種有效方法[10~12]。該方法通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)在折疊或去折疊過(guò)程中內(nèi)源熒光的變化情況，不僅能直觀地了解蛋白質(zhì)的折疊或去折疊過(guò)程，還可能獲取未被發(fā)現(xiàn)的部分折疊中間態(tài)。本文采用熒光光譜法對(duì)GAD野生型酶和突變酶K413A的去折疊過(guò)程進(jìn)行了研究，并考察了鹽酸胍和脲對(duì)GAD構(gòu)象和活力的影響，擬通過(guò)比較和分析野生酶與突變酶在熱力學(xué)穩(wěn)定性上的差異，深入探索與GAD穩(wěn)定性相關(guān)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)理，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)能有效提高GAD穩(wěn)定性的分子改造方案提供理論指導(dǎo)。

2 材料與方法

2.1 菌種與試劑

表達(dá)宿主菌BL21(DE3)、重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-B以及pET28a-BK413A為浙江大學(xué)生物工程研究所保藏。鹽酸胍(純度99%)、脲(純度99%)、酵母粉、胰蛋白胨、磷酸吡哆醛(pyrodoxal-5’-phosphate，PLP)、硫酸卡那霉素(Kan)、異丙基--D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)、考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(中國(guó))；丹磺酰氯，日本TCI公司； Ni-NTA層析介質(zhì)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司(中國(guó))。

2.2 培養(yǎng)基與溶液配制

LB培養(yǎng)基：10 g×L-1胰蛋白胨，5 g×L-1酵母粉，10 g×L-1氯化鈉。

TB培養(yǎng)基：12 g×L-1胰蛋白胨、24 g×L-1酵母粉、4 mL×L-1甘油、17 mmol×L-1磷酸二氫鉀、72 mmol×L-1磷酸氫二鉀。

破胞緩沖液(pH 7.4)：2 mmol×L-1磷酸二氫鉀、10 mmol×L-1磷酸氫二鈉、2.7 mmol×L-1氯化鉀、1 mmol×L-1苯甲基磺酰氟、137 mmol×L-1氯化鈉。

2.3 野生型酶和突變酶的表達(dá)

分別將表達(dá)野生型酶和突變酶K413A的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，挑取單菌落接種至含有50 μg×mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r×min-1條件下培養(yǎng)過(guò)夜。然后將此過(guò)夜培養(yǎng)物以2%(體積比)的接種量接種至含50 μg×mL-1卡那霉素的100 mL TB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至600值為0.6~0.8時(shí)，加入適量體積的IPTG至終濃度為0.5 mmol×L-1，25 ℃、150 r·min-1條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h后收集菌體。

2.4 野生型酶和突變酶的純化

粗酶液制備：將收集的菌體用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，后用10%發(fā)酵液體積的破胞緩沖液重懸，超聲破碎細(xì)胞，超聲破胞工作條件為：功率300 W，工作3 s，間歇6 s，循環(huán)90次。經(jīng)破碎后的懸液于10 000 r×min-1，4℃條件下離心處理30 min，收集上清液，即粗酶液。

蛋白純化：采用Ni-NTA親和層析對(duì)所得的粗酶液進(jìn)行分離純化，經(jīng)上樣、清洗和洗脫，收集洗脫液，透析去除小分子得到純酶，采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化后的蛋白純度。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純化后的蛋白濃度。

2.5 野生型酶和突變酶K413A的熒光相圖

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純化后的蛋白質(zhì)濃度，并用破胞緩沖液稀釋蛋白濃度至2 mg×mL-1，用相同緩沖液配制10 mol×L-1脲溶液和8 mol×L-1的鹽酸胍溶液，取100 μL樣品酶液置于含有不同濃度的脲或鹽酸胍溶液中，使總體積為1 mL，4℃放置過(guò)夜使其發(fā)生不同程度變性。對(duì)照體系除不含酶液外，其余條件與變性酶溶液完全相同。用Hitachi F-4500型熒光光譜儀測(cè)定內(nèi)源熒光發(fā)射圖。實(shí)驗(yàn)條件為：25℃，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描范圍300~400 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，掃描速度1200 nm×min-1。然后根據(jù)式(1-3)計(jì)算并繪制脲或鹽酸胍誘導(dǎo)GAD野生型酶和突變酶K413A去折疊的熒光相圖。

式中和分別為320和365作圖所得直線的縱截距和斜率，320()和320()分別是發(fā)射波長(zhǎng)為320 nm條件下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)始態(tài)和終態(tài)的熒光強(qiáng)度，365()和365()分別是發(fā)射波長(zhǎng)為365 nm條件下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)始態(tài)和終態(tài)的熒光強(qiáng)度。

2.6 鹽酸胍和脲對(duì)野生型酶和突變酶K413A酶活力的影響

將GAD野生型酶和突變酶K413A按照2.5節(jié)進(jìn)行處理，取處理后的酶液15 μL(0.2 mg×mL-1)，加入400 μL底物溶液(含0.01 mmol×L-1PLP和100 mmol×L-1L-MSG的pH 4.8、0.2 mol×L-1的醋酸-醋酸鈉緩沖液)中，于48℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速放入沸水浴中10 min以終止反應(yīng)，然后將樣品離心，收集上清液，采用高效液相色譜法測(cè)定產(chǎn)物中GABA含量，具體測(cè)定條件參照文獻(xiàn)[6~8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 野生型酶和突變酶K413A表達(dá)及純化

野生型酶和突變酶K413A的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖1，純酶的蛋白質(zhì)分子量大小為56 kDa。

圖1 野生酶和突變酶K413A的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖

3.2 鹽酸胍和脲誘導(dǎo)野生型酶和突變酶K413A去折疊的研究

克隆自CGMCC 1306 的GAD中具有熒光激發(fā)能力的芳香族氨基酸殘基共有53個(gè)：9個(gè)Trp，25個(gè)Tyr，19個(gè)Phe。由于實(shí)驗(yàn)采用280 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，Phe不再被激發(fā)；同時(shí)，在Trp存在的條件下，Tyr吸收的能量常常會(huì)傳遞給Trp并由后者發(fā)出熒光，因此GAD的發(fā)射熒光僅由Trp殘基產(chǎn)生。野生型GAD中共有9個(gè)Trp殘基(1個(gè)暴露于蛋白質(zhì)表面，其余8個(gè)埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部)，由于它們具有不同的最大熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)——埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的非極性區(qū)域時(shí)，Trp殘基的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)約為330~332 nm；位于蛋白質(zhì)表面、但與水的接觸有限時(shí)，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)約為340~342 nm；徹底暴露于水中時(shí)，最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)約為352 nm左右[10]，所以在GAD的去折疊過(guò)程中，隨著蛋白質(zhì)分子內(nèi)部Trp的逐漸暴露，發(fā)射熒光的波峰會(huì)逐漸發(fā)生紅移，熒光強(qiáng)度則會(huì)呈現(xiàn)先增加后減小的現(xiàn)象——一方面，隨著暴露的Trp增多，熒光發(fā)射源增多；另一方面，Trp的咪唑環(huán)暴露于溶液中后會(huì)發(fā)生熒光淬滅，導(dǎo)致熒光發(fā)射強(qiáng)度降低。因此，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)發(fā)射熒光的波峰變化和強(qiáng)度變化研究GAD去折疊過(guò)程中的構(gòu)象變化[13]。

監(jiān)測(cè)結(jié)果表明(圖2)，當(dāng)鹽酸胍濃度為0~1.5 mol×L-1時(shí)，野生型酶的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度隨著鹽酸胍濃度的增大而增強(qiáng)，同時(shí)伴隨著最大發(fā)射峰的紅移；當(dāng)鹽酸胍濃度大于1.5 mol×L-1、小于4.0 mol×L-1時(shí)，野生型酶的熒光強(qiáng)度隨鹽酸胍的增加而逐漸降低，最大發(fā)射峰位持續(xù)紅移，而且存在兩個(gè)快速紅移的階段；當(dāng)鹽酸胍濃度超過(guò)4.5 mol×L-1后，其最大發(fā)射峰位紅移至352 nm。突變酶K413A在去折疊過(guò)程中熒光發(fā)射波長(zhǎng)及強(qiáng)度的變化情況與野生酶的類似，但其最大熒光發(fā)射峰的紅移過(guò)程較為連續(xù)和穩(wěn)定，而且直到鹽酸胍濃度達(dá)到5.5 mol×L-1后，其最大發(fā)射峰才紅移至352 nm(比野生型酶的對(duì)應(yīng)鹽酸胍濃度高 1 mol×L-1)。由于熒光發(fā)射峰的紅移快慢反映了的GAD構(gòu)象的變化速率，故可知突變酶的結(jié)構(gòu)剛性強(qiáng)于野生型酶，對(duì)變性劑的去折疊效應(yīng)具有更高的抗性。這可能是K413A突變?cè)黾恿藲埢g的疏水性相互作用、增強(qiáng)了酶的結(jié)構(gòu)剛性所致。

通過(guò)考察去折疊過(guò)程中酶活力的變化過(guò)程(圖3)發(fā)現(xiàn)，在鹽酸胍濃度為0~0.2 mol×L-1，野生型GAD的酶活力隨著鹽酸胍濃度的增加而增大；當(dāng)鹽酸胍濃度大于0.2 mol×L-1后，酶活力則隨著鹽酸胍的增大而逐漸降低；當(dāng)鹽酸胍濃度為0.8 mol×L-1時(shí)，酶活力完全喪失。這種酶活力先增加后減小的現(xiàn)象表明適當(dāng)濃度的鹽酸胍可以增加酶活性中心區(qū)域的結(jié)構(gòu)柔性、促進(jìn)酶與底物的作用，或者與酶的活性中心發(fā)生相互作用、提高酶的催化活力[14]；但鹽酸胍濃度超過(guò)一個(gè)臨界值后，會(huì)導(dǎo)致酶逐漸喪失維持催化功能所必須的整體三維結(jié)構(gòu)而逐漸失活。突變酶K413A的活力變化過(guò)程與此類似，但鹽酸胍的臨界濃度增大為0.3 mol×L-1，而且酶活力徹底喪失時(shí)對(duì)應(yīng)的鹽酸胍濃度增加至約1.0 mol×L-1。

圖3 不同濃度鹽酸胍處理野生型酶和突變酶K413A的殘余活力

綜合比較去折疊過(guò)程中蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化與活力變化可知，鹽酸胍誘導(dǎo)的野生型酶和突變酶K413A的去折疊過(guò)程表現(xiàn)出“活性喪失快、構(gòu)象變化慢”的特點(diǎn)[15]。這說(shuō)明GAD中與催化活性相關(guān)區(qū)域的剛性弱于酶整體構(gòu)象的剛性，對(duì)去折疊劑的作用更為敏感；而且413位點(diǎn)可能是一個(gè)與催化活性相關(guān)的氨基酸殘基位點(diǎn)，K413A突變不僅提高了酶分子整體構(gòu)象的剛度，而且很可能還提高了活性相關(guān)部位的結(jié)構(gòu)剛度。進(jìn)一步研究野生型酶和突變酶K413A去折疊的熒光相圖(圖4)發(fā)現(xiàn)，它們?cè)邴}酸胍誘導(dǎo)下的去折疊過(guò)程是一個(gè)符合“三態(tài)模型”的序變過(guò)程：隨著鹽酸胍濃度的增加，它們首先從天然態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)部分折疊中間態(tài)(GdmHCl)，當(dāng)鹽酸胍濃度繼續(xù)增加超過(guò)一定的臨界濃度后，它們?cè)儆刹糠终郫B中間態(tài)最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B態(tài)。但是，突變酶K413A的鹽酸胍臨界濃度高于野生型酶，也進(jìn)一步證實(shí)了該突變酶具有更強(qiáng)的抗變性能力。

3.3 脲誘導(dǎo)野生型酶和突變酶K413A去折疊的研究

采用類似方法考察了GAD野生酶和突變酶在脲誘導(dǎo)去折疊過(guò)程中的構(gòu)象變化(圖5)及活力變化(圖6)，發(fā)現(xiàn)了不同于鹽酸胍誘導(dǎo)的變化情況。在280 nm的激發(fā)條件下，當(dāng)脲濃度為0~3.0 mol×L-1時(shí)，野生型酶的熒光光譜最大發(fā)射波長(zhǎng)隨脲濃度的增加而逐漸增大；但當(dāng)脲濃度在3.0~4.5 mol×L-1時(shí)，野生型酶的熒光最大發(fā)射峰位保持不變；當(dāng)脲濃度達(dá)到4.5 mol×L-1后，其最大發(fā)射峰位繼續(xù)紅移至343 nm。整個(gè)過(guò)程中，最大熒光強(qiáng)度則隨著脲濃度的增加而持續(xù)增大，這與鹽酸胍去折疊過(guò)程中先增加后減小的情況顯著不同。產(chǎn)生這種差別的原因可能是脲在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性時(shí)會(huì)裂解形成氰酸鹽，對(duì)蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行不可逆的共價(jià)修飾，使Tyr和Trp殘基在從分子內(nèi)部疏水區(qū)外露過(guò)程中原有的氫鍵斷裂而又不能與尿素配對(duì)形成新的氫鍵，阻止了熒光淬滅，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的持續(xù)增加。

—□— maximum fluorescene emission wavelength —▲— maximum fluorescence emission intensity

圖6 不同濃度脲處理野生型酶和突變酶K413A的殘余活力

與野生型酶不同，當(dāng)脲濃度為0~8.0 mol×L-1的情況下，突變酶K413A的熒光光譜最大發(fā)射峰位總是隨脲的濃度增加而不斷增大，只是增大速率有所變化。相比于鹽酸胍處理，脲對(duì)于GAD的影響更為緩和；但是最大熒光強(qiáng)度的變化并沒(méi)有很強(qiáng)的規(guī)律，僅僅表現(xiàn)為在一個(gè)區(qū)間內(nèi)上下浮動(dòng)。這可能是由于突變酶的疏水相互作用強(qiáng)于野生型酶，使得Trp的暴露過(guò)程不同于野生型酶，但具體原因有待進(jìn)一步研究。

在去折疊過(guò)程中，野生型GAD和突變酶K413A的活力都隨著脲濃度的增加而逐漸降低(圖6)，去折疊過(guò)程中酶活力的損失與構(gòu)象的變化幾乎是同步——與鹽酸胍去折疊出現(xiàn)“活力先增加后減小”的情況顯著不同。這說(shuō)明脲只能增加酶整體結(jié)構(gòu)的柔性，但無(wú)法特異性地增大與底物結(jié)合及催化相關(guān)結(jié)構(gòu)的柔性、提高酶的催化活力[17]。野生酶和突變酶K413A的半失活脲濃度分別為1 mol×L-1和2 mol×L-1，也明顯表明突變酶具有更高的結(jié)構(gòu)剛性，對(duì)變性劑的耐受性更強(qiáng)。從這兩個(gè)酶的脲誘導(dǎo)去折疊過(guò)程的熒光相圖(圖7)也可以看出，雖然它們的去折疊過(guò)程都符合“三態(tài)模型”，但野生酶從部分折疊中間態(tài)最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B態(tài)的臨界脲濃度約為1.8 mol×L-1，而突變酶對(duì)應(yīng)的臨界脲濃度約為2.5 mol×L-1，也證明突變酶具有更高的結(jié)構(gòu)剛度。此外，研究還發(fā)現(xiàn)鹽酸胍的臨界濃度低于脲的臨界濃度，說(shuō)明鹽酸胍對(duì)蛋白質(zhì)的去折疊能力高于脲。這可能與這兩種變性劑的去折疊途徑和機(jī)制的差異有關(guān)：鹽酸胍是一種電解質(zhì)，能通過(guò)正離子(胍離子)效應(yīng)減弱與蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有關(guān)的靜電相互作用；脲是一種非離子型變性劑，并沒(méi)有類似的相互作用[15~17]。

4 結(jié) 論

通過(guò)熒光光譜法考察了鹽酸胍和脲對(duì)野生型酶和突變酶K413A的去折疊過(guò)程，發(fā)現(xiàn)突變酶具有更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)剛性和熱力學(xué)穩(wěn)定性，表明413位點(diǎn)與GAD的結(jié)構(gòu)剛性具有重要聯(lián)系；此外，研究還發(fā)現(xiàn)K413A突變會(huì)影響鹽酸胍對(duì)GAD的激活性質(zhì)，表明413位點(diǎn)可能還與GAD的活性中心區(qū)域存在聯(lián)系。因此，可以選擇413位點(diǎn)及其臨近空間的氨基酸殘基作為后續(xù)酶分子改造的靶點(diǎn)，以進(jìn)一步提高酶的催化活力和穩(wěn)定性。本研究這種通過(guò)研究蛋白質(zhì)去折疊過(guò)程考察氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)和功能效應(yīng)的方法也可以用于其他酶的構(gòu)效關(guān)系研究和分子改造。

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Study on Glutamate Decarboxylase Unfolding Induced by Urea and Guanidine Hydrochloride with Fluorescence Spectroscopy

HU Sheng1, HUANG Jun2, KE Pi-yu3, ZHAO Wei-rui3, Lü Chang-jiang3, WANG Jin-bo1,SHANG Long-an1, MEI Le-he1,3

(1. School of Biotechnology and Chemical Engineering, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo 315100, China; 2. School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology, Hangzhou 310023, China; 3. College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

The unfolding of glutamate decarboxylase (GAD) (wild type and mutant K413A) induced by guanidine hydrochloride (GdmHCl) and urea was studied by fluorescence spectroscopy in order to discover structure-activity relationship that affected GAD stability. When GdmHCl is used as a denaturant, the largest emission peak of tryptophan in both enzymes redshifts under 280 nm excitation, and tryptophan fluorescence intensity increases first and then gradually declines. Meanwhile, the peak also redshifts and the tryptophan fluorescence intensity decreases with urea as a denaturant. With the increase of denaturant concentration, the fluorescence phase diagram shows that both the wild type and mutant K413A GAD have a partially folded intermediate, which follows a three-state model. In addition, the influence of denaturant on GAD catalytic activity was explored. GAD wild type and mutant K413A reach their half inactivation at GdmHCl concentration of 0.4 mol×L-1and 0.7 mol×L-1, respectively, while these values for urea are ~ 1 mol×L-1and 2 mol×L-1, respectively. The thermodynamic stability of mutant K413A is better than that of the wild-type GAD, and the site of 413 has an important link on the rigidity of GAD.

glutamate decarboxylase; urea; guanidine hydrochloride; fluorescence phase diagram; protein unfolding

1003-9015(2016)03-0648-07

Q813.11

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2016.03.021

2015-05-21；

2016-01-07。

國(guó)家自然科學(xué)基金 (21176220, 31240054, 31470793)；浙江省自然科學(xué)基金 (LZ13B060002, LY16B060008)；寧波市自然科學(xué)基金(2013A610087)。

胡升(1977-)，男，四川鹽源人，浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院講師，博士。

梅樂(lè)和，E-mail：meilh@zju.edu.cn