姜雪鋒, 韓 燁, 楊海軍, 楊忠波, 湯明杰, 王化斌

?

新型原子力顯微鏡技術(shù)在細(xì)胞成像和力學(xué)測(cè)量方面的應(yīng)用

姜雪鋒1,3, 韓 燁1, 楊海軍2, 楊忠波3, 湯明杰3, 王化斌3

(1. 天津大學(xué) 化工學(xué)院, 天津 300072; 2. 中國(guó)科學(xué)院 微觀界面物理與探測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201800;3. 中國(guó)科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院 跨尺度制造技術(shù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400714)

在不同生理狀態(tài)下，細(xì)胞的形態(tài)、彈性和黏附性等物化特性會(huì)發(fā)生改變，這些變化反映細(xì)胞復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)具有原子級(jí)成像分辨率和皮牛級(jí)力學(xué)分辨率，可以在近生理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高分辨形貌成像和力學(xué)性能測(cè)量，因此可以很好地用來(lái)研究細(xì)胞的上述物化特性。文章首先扼要介紹AFM的基本工作原理和基本工作模式，而后對(duì)傳統(tǒng)AFM在細(xì)胞成像和力學(xué)測(cè)量相關(guān)物化性質(zhì)方面的應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)要總結(jié)，最后重點(diǎn)介紹了新型AFM技術(shù)在細(xì)胞成像和力學(xué)測(cè)量方面研究的最新進(jìn)展。

原子力顯微鏡；細(xì)胞；物化特性；形貌；細(xì)胞力學(xué)

1 前 言

細(xì)胞是生命體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，對(duì)生命相關(guān)問(wèn)題的深入認(rèn)識(shí)與細(xì)胞密切相關(guān)，目前對(duì)于細(xì)胞的研究已經(jīng)從細(xì)胞群體和組織層次深入到單細(xì)胞水平。細(xì)胞由細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞骨架以及細(xì)胞膜等構(gòu)成。細(xì)胞膜表面存在許多生物大分子，比如膜蛋白、糖蛋白、糖脂和由質(zhì)膜特化形成的結(jié)構(gòu)(微絨毛、細(xì)胞內(nèi)轍、纖毛和鞭毛等)。細(xì)胞膜上存在許多體現(xiàn)細(xì)胞膜功能的生物大分子，比如快速轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的孔道-水通道蛋白，影響細(xì)胞和細(xì)胞間粘附作用的E-鈣黏蛋白[1]以及與細(xì)胞信號(hào)識(shí)別關(guān)系密切的糖蛋白。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中與維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞形態(tài)可以體現(xiàn)細(xì)胞表面分子和細(xì)胞骨架及細(xì)胞器等信息，反映細(xì)胞的生理狀態(tài)[2]。研究表明，細(xì)胞形態(tài)在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、死亡和腫瘤生長(zhǎng)等諸多生理過(guò)程中與細(xì)胞功能密切相關(guān)[3~6]，比如在癌癥的侵襲過(guò)程中，癌細(xì)胞需要不斷地修改自身的形狀和硬度來(lái)與其周?chē)慕M織結(jié)構(gòu)進(jìn)行反應(yīng)[7]；再比如細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)會(huì)隨著細(xì)胞的性質(zhì)或其所處環(huán)境的不同而發(fā)生改變，能反映細(xì)胞的生理學(xué)特性[8]。因此研究單個(gè)細(xì)胞包括形態(tài)和力學(xué)在內(nèi)的物化特性對(duì)于揭示生命的奧秘具有重要意義。

自1986年發(fā)明以來(lái)，原子力顯微鏡(AFM)在研究生物樣品方面顯現(xiàn)出強(qiáng)大的活力[9~11]。它能夠以超高的成像分辨率(埃級(jí)，10-10米)和力學(xué)分辨率(皮牛級(jí)，10-12牛頓)在近生理環(huán)境下和納米尺度下觀察細(xì)胞形態(tài)和測(cè)量細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)[12,13]。相比較于掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)和透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)，AFM在研究細(xì)胞方面最大的兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)是：(1)可以在生理?xiàng)l件下進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)，從而可以獲得生理活性下關(guān)于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；(2)可以對(duì)樣品進(jìn)行力學(xué)性質(zhì)測(cè)量，因此可以獲得細(xì)胞的機(jī)械性質(zhì)，如黏附性、彈性和塑性等。目前，已有不少關(guān)于利用傳統(tǒng)AFM成像和力學(xué)技術(shù)研究細(xì)胞物化特性的綜述文章[14]。然而，近年來(lái)一些新的AFM成像技術(shù)和應(yīng)用不斷涌現(xiàn)出來(lái)，并在細(xì)胞的物化性質(zhì)測(cè)量方面展現(xiàn)出巨大應(yīng)用前景。為了加快這些新技術(shù)的應(yīng)用，本綜述在對(duì)AFM基本原理和傳統(tǒng)應(yīng)用扼要介紹的基礎(chǔ)上，著重介紹新型AFM測(cè)量技術(shù)[比如峰值力模式(PeakForce)、快掃模式(FastScan)以及將AFM與超高分辨率光學(xué)顯微鏡聯(lián)用]對(duì)包括細(xì)胞成像和力學(xué)測(cè)量在內(nèi)的物化性質(zhì)方面的最新研究進(jìn)展。

2 AFM基本工作原理及傳統(tǒng)工作模式介紹

AFM是一種具有極高成像分辨率和力學(xué)分辨率的先進(jìn)設(shè)備。它的成像掃描范圍可以從幾個(gè) nm × nm到約100 μm × 100 μm，并且可以在生理溶液環(huán)境下工作，是研究細(xì)胞體系的理想工具[15]。利用AFM的成像和力學(xué)測(cè)量功能對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)，可以獲得細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)信息和細(xì)胞的力學(xué)信息(如：黏附力和彈性)[16]。

2.1 AFM基本成像原理及工作模式

AFM基本成像原理：如圖1所示，當(dāng)AFM工作時(shí)，一個(gè)預(yù)設(shè)定的作用力通過(guò)AFM探針作用在樣品上，這個(gè)作用力使得AFM探針的微懸臂發(fā)生一定量的偏折(預(yù)先設(shè)定偏折量)。此偏折量決定了從微懸臂背面反射的激光束(紅色實(shí)線)到達(dá)光電四象限探測(cè)器的位置(實(shí)心紅斑)。當(dāng)樣品在壓電陶瓷掃描管的帶動(dòng)下在X-Y平面(水平面)做光柵模式掃描(raster scan)時(shí)，AFM探針的微懸臂的偏折量會(huì)隨所測(cè)樣品表面形貌變化而瞬時(shí)相應(yīng)偏離設(shè)定偏折量，從而引起到達(dá)光電四象限探測(cè)器的激光斑(空心虛斑)位置發(fā)生瞬時(shí)變化。光電四象限探測(cè)器會(huì)將檢測(cè)的光信號(hào)變化以電信號(hào)的形式傳送給AFM電子控制箱，控制箱將會(huì)控制壓電陶瓷掃描管在Z-方向做相應(yīng)的伸縮變化使微懸臂的偏折恢復(fù)到其預(yù)設(shè)值。在這個(gè)過(guò)程中，將壓電陶瓷掃描管在Z-方向和X-Y平面的位置變化重新構(gòu)建便可以得到掃描區(qū)域樣品的形貌圖。AFM基本的成像模式主要包括：接觸模式(contact mode)和輕敲模式(tapping mode)。在接觸模式中，AFM的針尖始終和樣品表面保持輕微接觸，并且保持恒定的作用力。一般來(lái)講，對(duì)于硬樣品通過(guò)接觸模式成像可以獲得穩(wěn)定、高分辨率的樣品表面形貌圖。但是，如果樣品表面和針尖存在黏附力，使用接觸模式成像則容易使樣品變形甚至發(fā)生損傷而使圖像失真。在輕敲模式中，探針的微懸臂在其共振頻率附近作受迫運(yùn)動(dòng)，探針與樣品間歇時(shí)接觸，它們之間的作用力大小可以通過(guò)控制探針接觸樣品時(shí)微懸臂的振幅/偏折量來(lái)保持恒定。由于輕敲模式中的針尖和樣品的接觸非常短暫且作用力與樣品表面幾乎垂直，因此，可以避免樣品粘附到針尖上和幾乎完全消除剪切力對(duì)樣品的破壞。輕敲模式可以對(duì)柔軟、易變形和黏度較大的樣品進(jìn)行很好地成像觀測(cè)[17]。

圖1 AFM基本工作原理示意圖