徐華　杜文靜　車團結

重離子12C6+輻照對人肺癌細胞增殖的影響

徐華杜文靜車團結

目的：探討12C6+射線輻照人肺癌細胞株H1299細胞的生物學效應。方法：以不同劑量的12C6+輻照H1299細胞，并培養(yǎng)24，48，72小時收獲細胞。采用MTT法檢測H1299細胞增殖情況。結果：12C6+輻照H1299細胞后，細胞呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，在一定劑量范圍內，隨著輻照劑量的增加，H1299細胞的OD值逐漸減少，與假照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論：12C6+輻射在2Gy范圍內輻照H1299細胞，具有明顯抑制其增殖的作用。

12C6+；細胞增殖；H1299細胞

原發(fā)性肺癌是我國高死亡率的惡性腫瘤之一，且有逐年升高趨勢。放療已成其治療的主要手段［1］。研究表明，傳統(tǒng)的常規(guī)放射治療，射線隨著射程的增加，劑量呈指數(shù)衰減，臨床毒副作用多［2］。而重離子照射能使輻射劑量積聚在腫瘤部位的Bragg峰，有效的殺傷腫瘤細胞，減少對周圍正常組織的損傷［3］，是新型放療的發(fā)展方向。日本研究人員分析了重離子治療111例早期非小肺癌，局部控制率80%-90%，3年生存率73%-76%。結果優(yōu)于常規(guī)的放療［4］。然而重離子在臨床應用上仍屬探索階段，研究表明，放療的抗腫瘤機制是通過不同的信號傳導通路，抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡［5］。為了進一步確定重離子輻照在促肺癌細胞凋亡作用中的機理及安全劑量，本研究以12C6+輻照對H1299細胞增殖的影響為例，針對其輻照時間及輻照劑量對肺癌細胞H1299的不同抑制作用進行探討，為重離子放射治療肺癌提供實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1細胞培養(yǎng) H1299細胞來源中國科學院蘭州近代物

理研究所實驗室。常規(guī)方法復蘇、傳代、培養(yǎng)。取指數(shù)生長期H1299細胞，將其接種于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，內含青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml。置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)至細胞完全貼壁。每2-3天傳代1次。12C6+輻照前一天將指數(shù)生長期的H1299細胞按5×106個/ml接種到φ35mm的玻璃培養(yǎng)皿中。每次實驗均使用同一批次凍存的細胞。細胞于中國科學院蘭州近代物理研究所重離子研究裝置的輻照終端進行12C6輻照。平均輻照劑量率為2 Gy/min將各組H1299細胞放置于12C6+離子束的Bragg峰區(qū)進行照射。采用1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0Gy劑量照射后，培養(yǎng)24h，48h，72h收集細胞。70%的冰乙醇固定，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2MTT法測定經(jīng)不同劑量的12C6+輻照的H1299細胞，經(jīng)胰酶消化分離后，血球計數(shù)板計數(shù)，將細胞濃度調整為5×104個/ml，接種于96孔板（Costar，Germay）中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h，48h，72h不同時段點后，將每孔加入新鮮配制的MTT（5mg/ ml）20μl，37℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄孔內上清液，加入150μl二甲基亞砜（DMSO），在微孔板上充分振蕩混勻10min，酶聯(lián)免疫檢測儀（波長492nm）上測各孔的吸光度值（OD）值，各劑量組均設3個平行孔，獨立重復3次實驗，記錄結果繪制量效曲線。細胞存活率（%）=實驗組平均OD值/對照組平均OD值× 100%。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

結果顯示，當12C6+劑量為2Gy時，培養(yǎng)24h后，H1299細胞的OD值為0.820±0.023，與假照組0.993± 0.012比較，細胞增殖減弱（P＜0.05），培養(yǎng)24h，48h和72h細胞存活率分別為82.58%，71.25%和71.23%。當12C6+劑量為4Gy時，培養(yǎng)24h，48h和72h后，H1299細胞的OD值分別0.516±0.018，0.472±0.0120，232±0.026，與假照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。其細胞存活率分別為51.86%，41.79%和22.79%，與假照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。隨著12C6+輻照劑量的增加，H1299細胞增殖活性逐漸下降，相同劑量的12C6+輻照隨著培養(yǎng)時間延遲其細胞增殖活性逐漸下降。H1299細胞生長曲線變化表明，其生長抑制作用呈時間和劑量依賴性。5.0Gy以上的照射劑量，則出現(xiàn)較多壞死細胞。實驗表明12C6+輻射在2-4Gy范圍內輻照H1299細胞，具有較好的抑制細胞增殖的作用。見表1。

表1　不同照射時間、照射劑量對H1299細胞增殖影響（±s,n=3）

表1　不同照射時間、照射劑量對H1299細胞增殖影響（±s,n=3）

注：*與假照組比較P＜0.05，**假照組比較P＜0.01

照射劑量（Gy）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 72 h 1.008±0.022 0.933±0.025 0.731±0.036** 0.388±0.027** 0.232±0.026** 0.232±0.026** 0.182±0.016** 24 h 0.993±0.012 0.982±0.011 0.820±0.023* 0.620±0.031** 0.516±0.018** 0.515±0.018** 0.415±0.012** 48 h 1.126±0.020 0.986±0.012 0.803±0.023** 0.526±0.025** 0.472±0.012** 0.471±0.022** 0.301±0.021**

圖1　不同劑量12C6輻照H1299后細胞存活率變化

3　討論

隨著核科學技術的進步和發(fā)展，重離子在物理學和生物學上表現(xiàn)出的不同特性受到關注。重離子束不同于常規(guī)射線特有的倒轉深度劑量分布以及相對高的生物學效應等，使得重離子不僅可以徹底殺滅腫瘤細胞，而且對常規(guī)放射抗拒的腫瘤也能取得良好的療效［6］。Yamamoto等人分析1994-1999年日本采用12C6+治療肺癌病人的分析報道，采用劑量遞增法確定最佳劑量，取得較好臨床效果［7］。但如何選定重離子體外輻照人非小細胞肺癌的輻射劑量尚無實驗報道。MTT比色實驗是一種檢測細胞存活和生長的方法之一。本研究中，采用MTT法觀察不同時間和劑量12C6+輻照H1299細胞生長抑制變化，采用劑量遞增法確定適宜劑量，結果表明當12C6+劑量為2Gy時，H1299細胞生長增殖受到抑制，細胞存活率下降，當12C6+劑量為4Gy時，細胞增殖率下降明顯，且呈劑量-時間依賴性，5.0Gy以上的照射，出現(xiàn)較多的壞死細胞。輻照劑量越大在體外的殺傷腫瘤細胞的效果越好，但過高的輻照劑量也會導致嚴重的輻射損傷。實驗表明12C6+輻射在2-4Gy范圍內輻照H1299細胞，具有較好的抑制細胞增殖的作用。本實驗結果與前期研究的重離子輻照人肝癌細胞SMMC7721細胞的增殖抑制作用類似［8］。但未進行同一實驗的比較，尚不能確定對哪一類腫瘤細胞殺傷力更強。

人類作為一個復雜的生物體，具有更強的代謝和防御機制。目前只有日本、中國、德國、美國在研究高能重離子束治療腫瘤，現(xiàn)處于臨床試驗階段，治療腫瘤遠期效果有待于進一步跟蹤觀察。本研究將在上述研究的基礎上，進一步探討如下問題：探討重離子輻照肺癌H1299細胞凋亡和細胞周期的調控作用，研究H1299細胞凋亡的線粒體通路調節(jié)機制與相關蛋白的關系。體外細胞實驗僅能對重離子促進細胞凋亡提供一定的實驗數(shù)據(jù)，為臨床治療提供一定的參考，而探討重離子放射治療人體內腫瘤的安全劑量尚需進一步深入研究。

［1］段紀俊，陳萬青，張思維.中國惡性腫瘤死亡率的國際比較［J］.中國社會醫(yī)學雜志2009，6（6）:377-378.

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［5］Demizu Y，Kagawa K，Ejima Y，et al.Cell biological basis for combina-tion radiotherapy using heavy-ion beams and high-energy X-rays［J］. Radiother Oncol，2004，71（2）:207-211.

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Effect of12C6+irradiation on human lung cancer cell line H1299 proliferation in vitro

Xu Hua1，Du Wenjing2，CheTuanjie3.

1.Department of Internal Medicine，Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China；3.School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Objective：To investigate the biological effect of12C6+irradiation in human lung cancer cell line H1299.Methods：Irradiate cell H1299 by12C6+with different dose，after that，continue to foster，and get in the cells at 24，48，72 h.The test of cell proliferation was observed by microculture tetrazolium test（MTT）.Results：After irradiated cell H1299 by12C6+，it showed typical morphological changes.The proliferation rate tended to decrease with the radiation dose increasing.which showed dose-dependent manner.The MTT results showed that OD was significantly decreased，compared with the control group（P＜0.01）.Conclusion：Irradiation of12C6+on cell H1299 could obviously restrain proliferation of cell H1299 within the dose of 2Gy.

12C6+；cell proliferation；H1299

A

1004-2725（2016）01-0007-03

730000甘肅蘭州，蘭州大學校醫(yī)院內科（徐華）；730000甘肅蘭州，甘肅省科學院生物所（杜文靜）；730000甘肅蘭州，蘭州大學生命科學學院（車團結）

徐華，E-mail：765837231@qq.com