徐華　杜文靜　車團(tuán)結(jié)

重離子12C6+輻照對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖的影響

徐華杜文靜車團(tuán)結(jié)

目的：探討12C6+射線輻照人肺癌細(xì)胞株H1299細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。方法：以不同劑量的12C6+輻照H1299細(xì)胞，并培養(yǎng)24，48，72小時(shí)收獲細(xì)胞。采用MTT法檢測(cè)H1299細(xì)胞增殖情況。結(jié)果：12C6+輻照H1299細(xì)胞后，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在一定劑量范圍內(nèi)，隨著輻照劑量的增加，H1299細(xì)胞的OD值逐漸減少，與假照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：12C6+輻射在2Gy范圍內(nèi)輻照H1299細(xì)胞，具有明顯抑制其增殖的作用。

12C6+；細(xì)胞增殖；H1299細(xì)胞

原發(fā)性肺癌是我國(guó)高死亡率的惡性腫瘤之一，且有逐年升高趨勢(shì)。放療已成其治療的主要手段［1］。研究表明，傳統(tǒng)的常規(guī)放射治療，射線隨著射程的增加，劑量呈指數(shù)衰減，臨床毒副作用多［2］。而重離子照射能使輻射劑量積聚在腫瘤部位的Bragg峰，有效的殺傷腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)周圍正常組織的損傷［3］，是新型放療的發(fā)展方向。日本研究人員分析了重離子治療111例早期非小肺癌，局部控制率80%-90%，3年生存率73%-76%。結(jié)果優(yōu)于常規(guī)的放療［4］。然而重離子在臨床應(yīng)用上仍屬探索階段，研究表明，放療的抗腫瘤機(jī)制是通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。為了進(jìn)一步確定重離子輻照在促肺癌細(xì)胞凋亡作用中的機(jī)理及安全劑量，本研究以12C6+輻照對(duì)H1299細(xì)胞增殖的影響為例，針對(duì)其輻照時(shí)間及輻照劑量對(duì)肺癌細(xì)胞H1299的不同抑制作用進(jìn)行探討，為重離子放射治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) H1299細(xì)胞來(lái)源中國(guó)科學(xué)院蘭州近代物

理研究所實(shí)驗(yàn)室。常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)。取指數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞，將其接種于含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml。置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁。每2-3天傳代1次。12C6+輻照前一天將指數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞按5×106個(gè)/ml接種到φ35mm的玻璃培養(yǎng)皿中。每次實(shí)驗(yàn)均使用同一批次凍存的細(xì)胞。細(xì)胞于中國(guó)科學(xué)院蘭州近代物理研究所重離子研究裝置的輻照終端進(jìn)行12C6輻照。平均輻照劑量率為2 Gy/min將各組H1299細(xì)胞放置于12C6+離子束的Bragg峰區(qū)進(jìn)行照射。采用1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0Gy劑量照射后，培養(yǎng)24h，48h，72h收集細(xì)胞。70%的冰乙醇固定，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2MTT法測(cè)定經(jīng)不同劑量的12C6+輻照的H1299細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化分離后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，接種于96孔板（Costar，Germay）中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h，48h，72h不同時(shí)段點(diǎn)后，將每孔加入新鮮配制的MTT（5mg/ ml）20μl，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄孔內(nèi)上清液，加入150μl二甲基亞砜（DMSO），在微孔板上充分振蕩混勻10min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（波長(zhǎng)492nm）上測(cè)各孔的吸光度值（OD）值，各劑量組均設(shè)3個(gè)平行孔，獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，記錄結(jié)果繪制量效曲線。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值× 100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

結(jié)果顯示，當(dāng)12C6+劑量為2Gy時(shí)，培養(yǎng)24h后，H1299細(xì)胞的OD值為0.820±0.023，與假照組0.993± 0.012比較，細(xì)胞增殖減弱（P＜0.05），培養(yǎng)24h，48h和72h細(xì)胞存活率分別為82.58%，71.25%和71.23%。當(dāng)12C6+劑量為4Gy時(shí)，培養(yǎng)24h，48h和72h后，H1299細(xì)胞的OD值分別0.516±0.018，0.472±0.0120，232±0.026，與假照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其細(xì)胞存活率分別為51.86%，41.79%和22.79%，與假照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。隨著12C6+輻照劑量的增加，H1299細(xì)胞增殖活性逐漸下降，相同劑量的12C6+輻照隨著培養(yǎng)時(shí)間延遲其細(xì)胞增殖活性逐漸下降。H1299細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變化表明，其生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。5.0Gy以上的照射劑量，則出現(xiàn)較多壞死細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明12C6+輻射在2-4Gy范圍內(nèi)輻照H1299細(xì)胞，具有較好的抑制細(xì)胞增殖的作用。見(jiàn)表1。

表1　不同照射時(shí)間、照射劑量對(duì)H1299細(xì)胞增殖影響（±s,n=3）

表1　不同照射時(shí)間、照射劑量對(duì)H1299細(xì)胞增殖影響（±s,n=3）

注：*與假照組比較P＜0.05，**假照組比較P＜0.01

照射劑量（Gy）0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 72 h 1.008±0.022 0.933±0.025 0.731±0.036** 0.388±0.027** 0.232±0.026** 0.232±0.026** 0.182±0.016** 24 h 0.993±0.012 0.982±0.011 0.820±0.023* 0.620±0.031** 0.516±0.018** 0.515±0.018** 0.415±0.012** 48 h 1.126±0.020 0.986±0.012 0.803±0.023** 0.526±0.025** 0.472±0.012** 0.471±0.022** 0.301±0.021**

圖1　不同劑量12C6輻照H1299后細(xì)胞存活率變化

3　討論

隨著核科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，重離子在物理學(xué)和生物學(xué)上表現(xiàn)出的不同特性受到關(guān)注。重離子束不同于常規(guī)射線特有的倒轉(zhuǎn)深度劑量分布以及相對(duì)高的生物學(xué)效應(yīng)等，使得重離子不僅可以徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，而且對(duì)常規(guī)放射抗拒的腫瘤也能取得良好的療效［6］。Yamamoto等人分析1994-1999年日本采用12C6+治療肺癌病人的分析報(bào)道，采用劑量遞增法確定最佳劑量，取得較好臨床效果［7］。但如何選定重離子體外輻照人非小細(xì)胞肺癌的輻射劑量尚無(wú)實(shí)驗(yàn)報(bào)道。MTT比色實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法之一。本研究中，采用MTT法觀察不同時(shí)間和劑量12C6+輻照H1299細(xì)胞生長(zhǎng)抑制變化，采用劑量遞增法確定適宜劑量，結(jié)果表明當(dāng)12C6+劑量為2Gy時(shí)，H1299細(xì)胞生長(zhǎng)增殖受到抑制，細(xì)胞存活率下降，當(dāng)12C6+劑量為4Gy時(shí)，細(xì)胞增殖率下降明顯，且呈劑量-時(shí)間依賴性，5.0Gy以上的照射，出現(xiàn)較多的壞死細(xì)胞。輻照劑量越大在體外的殺傷腫瘤細(xì)胞的效果越好，但過(guò)高的輻照劑量也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的輻射損傷。實(shí)驗(yàn)表明12C6+輻射在2-4Gy范圍內(nèi)輻照H1299細(xì)胞，具有較好的抑制細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究的重離子輻照人肝癌細(xì)胞SMMC7721細(xì)胞的增殖抑制作用類似［8］。但未進(jìn)行同一實(shí)驗(yàn)的比較，尚不能確定對(duì)哪一類腫瘤細(xì)胞殺傷力更強(qiáng)。

人類作為一個(gè)復(fù)雜的生物體，具有更強(qiáng)的代謝和防御機(jī)制。目前只有日本、中國(guó)、德國(guó)、美國(guó)在研究高能重離子束治療腫瘤，現(xiàn)處于臨床試驗(yàn)階段，治療腫瘤遠(yuǎn)期效果有待于進(jìn)一步跟蹤觀察。本研究將在上述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討如下問(wèn)題：探討重離子輻照肺癌H1299細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控作用，研究H1299細(xì)胞凋亡的線粒體通路調(diào)節(jié)機(jī)制與相關(guān)蛋白的關(guān)系。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)僅能對(duì)重離子促進(jìn)細(xì)胞凋亡提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為臨床治療提供一定的參考，而探討重離子放射治療人體內(nèi)腫瘤的安全劑量尚需進(jìn)一步深入研究。

［1］段紀(jì)俊，陳萬(wàn)青，張思維.中國(guó)惡性腫瘤死亡率的國(guó)際比較［J］.中國(guó)社會(huì)醫(yī)學(xué)雜志2009，6（6）:377-378.

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Effect of12C6+irradiation on human lung cancer cell line H1299 proliferation in vitro

Xu Hua1，Du Wenjing2，CheTuanjie3.

1.Department of Internal Medicine，Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China；3.School of Life Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Objective：To investigate the biological effect of12C6+irradiation in human lung cancer cell line H1299.Methods：Irradiate cell H1299 by12C6+with different dose，after that，continue to foster，and get in the cells at 24，48，72 h.The test of cell proliferation was observed by microculture tetrazolium test（MTT）.Results：After irradiated cell H1299 by12C6+，it showed typical morphological changes.The proliferation rate tended to decrease with the radiation dose increasing.which showed dose-dependent manner.The MTT results showed that OD was significantly decreased，compared with the control group（P＜0.01）.Conclusion：Irradiation of12C6+on cell H1299 could obviously restrain proliferation of cell H1299 within the dose of 2Gy.

12C6+；cell proliferation；H1299

A

1004-2725（2016）01-0007-03

730000甘肅蘭州，蘭州大學(xué)校醫(yī)院內(nèi)科（徐華）；730000甘肅蘭州，甘肅省科學(xué)院生物所（杜文靜）；730000甘肅蘭州，蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（車團(tuán)結(jié)）

徐華，E-mail：765837231@qq.com