楊靜慧，王 葳，秦艷筠，劉艷軍，張景新，張 超（.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 0084，.天津市薊縣林業(yè)局，天津0900， .天津市朔方綠化科技有限公司，天津 0084）

試驗(yàn)研究

苜蓿鹽誘變愈傷組織的生理生化特性

楊靜慧1，王 葳1，秦艷筠1，劉艷軍1，張景新2，張 超3
（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384，2.天津市薊縣林業(yè)局，天津301900， 3.天津市朔方綠化科技有限公司，天津 300384）

為了了解耐鹽突變體的生理變化，以“青睞”苜蓿耐鹽突變體的愈傷組織為試材，檢測(cè)了該組織的細(xì)胞可溶性糖、丙二醛、可溶性蛋白、游離脯氨酸等的含量，分析了其細(xì)胞膜透性、離子濃度和SOD、POD酶活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比耐鹽突變體細(xì)胞中有更多的可溶性糖、游離脯氨酸，更少的丙二醛、可溶性蛋白和Na+、K+，細(xì)胞膜的透性更高。但其SOD和POD的酶活性的變化規(guī)律不明顯。

苜蓿；愈傷組織；耐鹽；生理指標(biāo)

苜蓿是豆科苜蓿屬的多年生草本植物，是一種全球性栽培、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性廣、適口性?xún)?yōu)良的飼料作物，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱(chēng)[1]。同時(shí)苜蓿也可以作為綠肥、輪作倒茬作物、護(hù)地固地和草坪綠化觀賞植物[2]。然而，50～200 mmol·L-1NaCl脅迫就會(huì)顯著降低苜蓿的產(chǎn)量[3]。目前，全世界的鹽漬地約占陸地面積的30%，而中國(guó)的鹽漬地比例明顯高于世界平均水平，天津東部濱海平原區(qū)土壤鹽漬化尤其嚴(yán)重[4]。如果可以提高苜蓿的耐鹽性，在鹽漬地區(qū)種植苜蓿，既可以改良土壤綠化環(huán)境，還可以創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)對(duì)耐鹽苜蓿突變體愈傷組織的8項(xiàng)生理指標(biāo)的研究，了解突變體在生理生化代謝上的變化規(guī)律，為耐鹽苜蓿的育種提供了理論依據(jù)。

1　材料和方法

試驗(yàn)使用的對(duì)照苜蓿品種“青睞”購(gòu)于中國(guó)農(nóng)科院，耐鹽愈傷組織由天津農(nóng)學(xué)院植物教研室提供，通過(guò)高鹽篩選獲得的突變體細(xì)胞系，方法見(jiàn)劉艷軍和QIN Y J的研究報(bào)道[5-6]。取耐鹽突變體和對(duì)照的子葉進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，方法見(jiàn)QIN Y J的報(bào)道[6]。愈傷組織生理指標(biāo)測(cè)定方法為：可溶性糖含量用蒽酮法、SOD酶活性用氮藍(lán)四唑光化還原法、POD酶活性采用愈創(chuàng)木酚比色法和Lambda35紫外分光光度計(jì)測(cè)定、丙二醛含量用硫代巴比妥酸比色法和用Lambda35紫外分光光度計(jì)測(cè)定、細(xì)胞膜透性用電導(dǎo)率法、可溶性蛋白含量用紫外吸收法、游離脯氨酸含量用茚三酮顯色法、Na+和K+含量用原子分光光度計(jì)測(cè)定（PerkinElmer AAnalyst 400型）。每處理3次重復(fù)。

2　結(jié)果與分析

2.1耐鹽愈傷組織的可溶性糖含量

圖1顯示，耐鹽愈傷組織的可溶性糖含量高于對(duì)照愈傷組織。對(duì)照可溶性糖含量為25.03%，耐鹽愈傷組織含量為27.42%，是對(duì)照的 1.1倍?？扇苄蕴鞘且环N重要的滲透調(diào)節(jié)劑；也是合成有機(jī)物的碳架和能量來(lái)源；對(duì)細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體有穩(wěn)定作用；還可在細(xì)胞內(nèi)無(wú)機(jī)離子含量高時(shí)起保護(hù)酶類(lèi)的作用[7]。耐鹽愈傷組織可溶性糖含量高，說(shuō)明其滲透壓較高，所以在鹽濃度較高的環(huán)境中可以更容易從外界吸收水分來(lái)維持生長(zhǎng)。

圖1　耐鹽愈傷組織的可溶性糖含量

2.2耐鹽愈傷組織的SOD酶活性

圖2顯示，耐鹽愈傷的SOD酶活性低于對(duì)照愈傷組織。對(duì)照的SOD酶活性為3.04 U，耐鹽愈傷的為2.20 U，前者是后者的1.38倍。有關(guān)研究表明，植物體在鹽脅迫下SOD的活性的變化因植物種類(lèi)不同而不同[8-10]。組織中SOD酶活性低的可能表示需要較高的鹽濃度才能造成對(duì)組織的脅迫引起反應(yīng)，也說(shuō)明該組織的耐鹽性強(qiáng)。

圖2　耐鹽愈傷組織的SOD酶活性

2.3耐鹽愈傷的POD酶活性

圖3顯示，耐鹽愈傷組織的POD酶活性高于對(duì)照愈傷組織。對(duì)照的POD酶活性為25.35 U，耐鹽愈傷組織的POD酶活性為34.81 U，后者是前者的1.37倍。POD酶的作用是清除過(guò)氧化氫，以免損傷自身細(xì)胞[11]。有報(bào)道顯示具有較高的POD酶活性的植物，具有較強(qiáng)的耐鹽性；但是，也有相反的報(bào)道[6,9,10.12]。

圖3　耐鹽愈傷組織的POD酶活性

2.4耐鹽愈傷組織的丙二醛含量

圖4顯示，耐鹽愈傷組織的丙二醛含量低于對(duì)照愈傷組織。對(duì)照丙二醛含量為0.79 μ mol· g-1，耐鹽愈傷組織含量為0.45 μ mol·g-1，前者是后者的1.77倍。丙二醛是膜脂過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，其含量高低是顯示膜脂過(guò)氧化強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，其數(shù)值越大，表示質(zhì)膜受到的傷害越大，其耐鹽性也越差[6]。

圖4　耐鹽愈傷組織的丙二醛含量

2.5耐鹽愈傷組織的細(xì)胞膜透性

圖5顯示，愈傷組織中細(xì)胞膜透性都較低（<0.32%），其中耐鹽愈傷組織的細(xì)胞膜透性高于對(duì)照。對(duì)照愈傷組織的細(xì)胞膜透性為0.13%，耐鹽愈傷的細(xì)胞膜透性為0.31%，后者是前者的2.38倍。鹽脅迫以及其他任何環(huán)境脅迫所造成的植物細(xì)胞膜的損壞，會(huì)使細(xì)胞膜的透性增大[13]。但是，本試驗(yàn)高壓篩選出來(lái)的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，無(wú)任何受害癥狀，生理代謝也正常。所以在正常生長(zhǎng)條件下，耐鹽愈傷組織細(xì)胞具有更高的細(xì)胞膜透性。

圖5　耐鹽愈傷組織的細(xì)胞膜透性

2.6耐鹽愈傷組織的可溶性蛋白和游離脯氨酸的含量

圖6和圖7顯示，耐鹽愈傷的可溶性蛋白含量低于對(duì)照愈傷組織，但游離脯氨酸含量高于對(duì)照愈傷組織。對(duì)照愈傷組織中的可溶性蛋白含量為2.25 mg·mL-1，耐鹽愈傷中可溶性蛋白含量為1.91 mg·mL-1，前者是后者的1.18倍；對(duì)照愈傷組織中的游離脯氨酸含量為94.84 μ g·g-1，耐鹽愈傷中的游離脯氨酸含量為599.87 μ g·g-1，后者是前者的6.33倍。邵紅雨等[7]在植物耐鹽生理生化特性的研究中指出，脯氨酸是一種重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是植物蛋白質(zhì)的組分之一，并以游離的狀態(tài)廣泛存在于植物體內(nèi)。植物在鹽脅迫等逆境條件下積累游離脯氨酸是一種比較普遍的現(xiàn)象。游離脯氨酸積累的作用大致有：（1）可以作為細(xì)胞的有效調(diào)節(jié)物質(zhì)；（2）具有保護(hù)酶和膜的作用；（3）可以直接利用的無(wú)毒形式的氮源。所以，上述結(jié)果表明經(jīng)過(guò)高鹽脅迫誘變得到的耐鹽愈傷組織具有將細(xì)胞中大量的可溶性蛋白轉(zhuǎn)化為游離脯氨酸的功能，這應(yīng)是其耐鹽的原因之一。

圖6　耐鹽愈傷組織的可溶性蛋白含量

圖7　耐鹽愈傷組織的游離脯氨酸含量

2.7耐鹽愈傷組織的Na+、K+濃度

圖8顯示，耐鹽愈傷組織的Na+、 K+濃度低于對(duì)照愈傷組織。對(duì)照愈傷組織中Na+含量為5.70 mg·L-1，耐鹽愈傷中Na+含量為2.90 mg· L-1，前者是后者的1.97倍；對(duì)照愈傷組織中的K+含量為4.81 mg·L-1，耐鹽愈傷中的K+含量為4.04 mg·L-1，前者是后者的1.2倍。對(duì)照愈傷組織的K+/ Na+為0.84 ，耐鹽愈傷的K+/ Na+為1.39，后者是前者的1.65倍。耐鹽愈傷中的Na+濃度明顯下降，雖然K+濃度也有所下降，但K+/ Na+較對(duì)照愈傷組織升高許多。這可有效維持生長(zhǎng)發(fā)育所需的K+/ Na+，提高對(duì)Na+脅迫的耐受性[14]。

圖8　耐鹽愈傷組織的K+、Na+離子濃度變化

3　結(jié) 論

綜上所述，與普通愈傷組織相比，耐鹽愈傷組織細(xì)胞中有更多的可溶性糖、游離脯氨酸，更少的丙二醛、可溶性蛋白、Na+、K+離子，更高的細(xì)胞膜透性。其SOD和POD酶活性的變化需要進(jìn)一步論證。

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S551+.703.4

A

1002-0659（2016）04-0001-03

2016-03-22

主要作者簡(jiǎn)介：楊靜慧（1961-），女，教授，博士，主要從事園藝植物栽培、抗逆生理和分子育種研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com