孫勝枚

（廣東省江門(mén)市李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東 江門(mén) 529100）

高效液相色譜法測(cè)定辣椒制品中的辣椒素類(lèi)物質(zhì)

孫勝枚

（廣東省江門(mén)市李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東 江門(mén) 529100）

該研究采用了高效液相色譜法對(duì)辣椒制品中的辣椒素類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其提取條件和檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。以乙醇∶水= 70∶30（V∶V）作為提取液，采用直接萃取法提取樣品中的辣椒素和二氫辣椒素，以0.3%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（62：38，V：V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離。結(jié)果表明，辣椒素和二氫辣椒素在20～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍線(xiàn)性關(guān)系良好（R12=0.999 8，R22=0.999 9），檢出限為0.001 g/kg，加標(biāo)回收率分別為93%～104%和86%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5%。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，可有效排除香辛料物質(zhì)的雜峰干擾，適合各類(lèi)辣椒制品中辣椒素類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)。

高效液相色譜；辣椒素類(lèi)物質(zhì)；測(cè)定

日常所食用的辣椒制品中的辣味主要來(lái)源于辣椒當(dāng)中的辣椒素類(lèi)物質(zhì)。辣椒素類(lèi)物質(zhì)主要包含有以下5種：辣椒素（capsaicin，CAP）、二氫辣椒素（dihydrocapsaicin，DCAP）、高辣椒素（homocapsaicin）、高二氫辣椒素（homodihydrocapsaicin）、降二氫辣椒素（nordihydrocapsaicin）［1-2］。其中辣椒類(lèi)制品辣感的主要來(lái)源是辣椒素和二氫辣椒素，占辣椒素類(lèi)物質(zhì)總含量90%以上［3］，因此這兩種辣椒素類(lèi)物質(zhì)也是辣味水平研究的主要對(duì)象［4-5］。

目前對(duì)于辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量的檢測(cè)主要方法有：比色法、薄層色譜法、紫外分光光度法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［6-9］。其中高效液相色譜法的應(yīng)用最為廣泛。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素類(lèi)物質(zhì)測(cè)定及辣度表示方法》中所采用的方法也是采用高效液相色譜法。

國(guó)標(biāo)方法中選取的提取液是甲醇-四氫呋喃溶液。而甲醇［10］、四氫呋喃［11］的毒性較大，對(duì)操作人員有一定的健康危害。本研究發(fā)現(xiàn)采作低毒的乙醇-純水溶液同樣可達(dá)到有效提取辣椒素和二氫辣椒素的效果，同時(shí)減少了對(duì)操作人員的危害，在實(shí)際應(yīng)用中更為合適。

為了提高各類(lèi)辣椒制品的辣椒素類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)高效液相色譜條件進(jìn)行了研究。根據(jù)樣品中雜質(zhì)的極性特點(diǎn)，調(diào)整色譜流動(dòng)相極性，有效地排除香辛料對(duì)辣椒素和二氫辣椒素的雜峰干擾，使雜峰與目標(biāo)峰有效分離。定量更準(zhǔn)確，進(jìn)一步優(yōu)化了高效液相色譜法測(cè)定辣椒制品中的辣椒素類(lèi)物質(zhì)的方法。

1　材料與方法

1.1試劑與樣品

辣椒油、咸紅望都辣椒胚、涮涮辣辣椒干、20目辣椒粉、桂林辣椒醬、涮涮辣特辣醬、四川風(fēng)味麻辣醬、麻辣醬、花椒辣油：市售。

乙醇、丙酮、磷酸二氫鉀（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司；辣椒素（純度≥95%）、二氫辣椒素（純度≥90%）：美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Macherey-NagelNucleosil120-5C18色譜柱（4.6mm×250mm，5 μm）；0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾器（尼龍66）：天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BS224S電子天平：德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；S300H超聲波清洗器：德國(guó)Elma公司；Synergy純水機(jī)：德國(guó)Millipore公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱(chēng)取0.050 0 g辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)乙醇溶解后定容至50 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液（辣椒素和二氫辣椒素的質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL）。以標(biāo)準(zhǔn)貯備液為基礎(chǔ)，分別吸取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液至50 mL容量瓶中，并用乙醇［12-13］定容，分別配制成質(zhì)量濃度為20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100 μg/mL的辣椒素和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，待HPLC進(jìn)樣檢測(cè)分析。

以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。辣椒素、二氫辣椒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程分別為y1=10.4428x1+0.0293（R12=0.9998）、y2=8.5614x2+0.0129（R22=0.999 9），均在20～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，辣椒素、二氫辣椒素的檢出限為0.001 g/kg。

1.3.2樣品前處理?xiàng)l件

（1）干椒樣品/新鮮辣椒

用粉碎機(jī)把辣椒樣品粉碎、研磨后，精確稱(chēng)取2.000 0 g干椒樣品（或新鮮辣椒20.000 0 g）于100 mL的容量瓶中，用乙醇∶水=70∶30（V/V）的溶液定容，用力搖勻，室溫放置2 h，并不停振蕩。用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液收集于2 mL的樣品瓶，待HPLC分析。

（2）含油脂類(lèi)辣椒樣品

用攪拌器將油脂類(lèi)辣椒樣品攪拌均勻，精確稱(chēng)取2.000 0 g樣品于100 mL的容量瓶中，加入5 mL丙酮［14］，并搖勻，使油性物質(zhì)被完全溶解在丙酮中。分3次加乙醇∶水= 70∶30（V/V）的溶液，每次加3～5 mL，并搖勻，使油性物質(zhì)溶解在乙醇水溶液中，再用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液定容，并搖勻，室溫放置2 h，并不停振蕩，用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液收集于2 mL的樣品瓶，待HPLC分析。

1.3.3色譜條件

色譜條件：Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30℃，流動(dòng)相：0.3%磷酸二氫鉀水溶液-乙腈（62∶38，V/V），流速：1.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm，進(jìn)樣量：10 μL，運(yùn)行時(shí)間：45 min。

1.3.4定性定量方法

分別吸取相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品提取液10 μL注入高效液相色譜儀，以1.3.3的色譜條件進(jìn)行分析。用辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間定性，用外標(biāo)多點(diǎn)校準(zhǔn)法，以峰面積定量。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

國(guó)標(biāo)方法中選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。在紫外光范圍內(nèi)，對(duì)辣椒素及二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描光譜分析，得出230nm波長(zhǎng)具有最大吸收波長(zhǎng)，且230nm比280 nm的吸收峰值高且峰型平緩，且230 nm檢測(cè)波長(zhǎng)更靈敏、更穩(wěn)定。因此本研究選用了230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2色譜流動(dòng)相的選擇

國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法所用的流動(dòng)相是甲醇∶純水=65∶35（V/V），本研究在檢測(cè)含量香辛料的辣椒制品時(shí)，根據(jù)樣品中雜質(zhì)的極性特點(diǎn)，調(diào)整色譜流動(dòng)相為0.3%磷酸二氫鉀溶液∶乙腈=62∶38（V/V），能有效地排除對(duì)辣椒素和二氫辣椒素的出峰干擾，使雜峰與目標(biāo)峰有效分離，使定量更準(zhǔn)確，進(jìn)一步優(yōu)化了高效液相色譜法測(cè)定辣椒制品中的辣椒素類(lèi)物質(zhì)的方法。

在此優(yōu)化的色譜條件下，采用HPLC法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和三種辣椒樣品進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品和三種辣椒樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)品（A）和樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram of the standard substance（A）and the sample（B）

由圖1可知，辣椒素及二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間分別是16.477 min和25.414 min。樣品中辣椒素和二氫辣椒素的出峰時(shí)間16.631 min和25.251 min，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖對(duì)照，樣品中的待測(cè)組分與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖匹配性良好，對(duì)于含較多香辛料的辣椒制品（a-麻辣醬，b-花椒辣油，c-四川風(fēng)味麻辣醬），雜峰與目標(biāo)峰已完全分開(kāi)，滿(mǎn)足分析檢測(cè)要求。

2.2烘干步驟必要性的選擇

國(guó)標(biāo)方法中針對(duì)新鮮辣椒或含水量＞15%的辣椒制品，必須用烘箱在50℃烘至含水量≤15%。但實(shí)際上，對(duì)于部分含水量＞15%的辣椒制品，也含有較多的油分。對(duì)于這些樣品，由于油分的存在，使得樣品不容易烘干，烘干時(shí)間較難把握，有的會(huì)長(zhǎng)達(dá)7～8 h。因此，為驗(yàn)證烘干步驟在前處理中的必要性，本研究對(duì)含水量＞15%的辣椒制品進(jìn)行50℃烘干處理，直至樣品含水量≤15%。最后采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，并與未烘干處理樣品進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，比較3種基質(zhì)樣品經(jīng)烘干處理后的結(jié)果與未經(jīng)烘干處理的結(jié)果，可以看出對(duì)于同一樣品，是否經(jīng)烘干處理，其最終的辣椒素類(lèi)物質(zhì)結(jié)果基本一致。樣品中的水分對(duì)于辣椒素類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果基本無(wú)影響，可省去烘干這個(gè)過(guò)程，從而大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，提高分析效率。

表1　烘干與未烘干處理樣品中辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量的比較Table 1 Comparison of the content of capsaicinoids in dried and undried samples

2.3樣品提取條件的選擇

2.3.1提取溶劑的選擇

結(jié)合辣椒素及二氫辣椒素的化學(xué)特性，針對(duì)不同的辣椒樣品，進(jìn)行了提取溶劑的選擇試驗(yàn)［2-5，15］。試驗(yàn)選取了甲醇、乙醇、乙醇-水（70∶30，V/V）溶液和四氫呋喃-甲醇（1∶1，V/V）混合溶液4種不同的提取溶劑提取各樣品中的辣椒素類(lèi)物質(zhì)，并進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。

表2　提取溶劑對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響Table 2 Effect of extraction solvents on extraction capsaicinoids

由表2可知，4種提取液中，乙醇的提取效率最低，而其余3種提取液的提取效率比較接近。對(duì)于辣椒油、辣椒干和辣椒粉，使用乙醇-水溶液作提取液，其提取效率比四氫呋喃-甲醇的稍好。而乙醇的毒性遠(yuǎn)低于甲醇、四氫呋喃，價(jià)格也比較便宜，因此，選取乙醇∶水=70∶30（V/V）作為提取溶劑。

2.3.2提取方式的選擇

在充分的粉碎和均質(zhì)樣品后，采用直接浸提萃取和超聲萃取。直接浸提萃取：直接稱(chēng)樣于100 mL容量瓶，用乙醇∶水=70∶30（V/V）的溶液定容至刻度，搖勻，室溫放置2 h，并不停振蕩搖勻。超聲萃?。?-2，10］：稱(chēng)樣于100 mL燒杯中，加入25mLV乙醇∶水=70∶30（V/V）溶液，用保鮮膜封口，在保鮮膜上用針扎幾個(gè)小孔，60℃水浴超聲提取30 min，把濾液收集于100 mL容量瓶，重復(fù)以上提取2次，合并提取液，用乙醇∶水=70∶30（V/V）溶液定容至刻度。采用HPLC法對(duì)兩種提取方法所獲得的提取液進(jìn)行辣椒素類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。

表3　提取方式對(duì)辣椒素類(lèi)物質(zhì)提取效果的影響Table 3 Effect of extraction methods on extraction capsaicinoids

由表3可知，超聲萃取方法的中間轉(zhuǎn)移步驟較多，容易造成最終辣椒素類(lèi)物質(zhì)結(jié)果的定量損失，直接浸提萃取與超聲萃取相比，萃取效果較好，且操作更為簡(jiǎn)單，可節(jié)省大量提取時(shí)間。

2.4加標(biāo)回收率試驗(yàn)

按照上述樣品前處理方法和色譜分析條件進(jìn)行分析，分別取辣椒樣品，添加0.049 g/kg、0.098 g/kg、0.147 g/kg三個(gè)質(zhì)量濃度的辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.051 g/kg、0.102 g/kg、0.153g/kg的二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行了加標(biāo)回收率試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　辣椒樣品中辣椒素和二氫辣椒素的加標(biāo)回收率Table 4 Adding standard recovery rate of capsaicine and dihydrocapsaicin in capsicum samples

由表4可知，辣椒素和二氫辣椒素的加標(biāo)回收率分別為93%～104%和86%～103%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性好，能滿(mǎn)足辣椒樣品中辣椒素和二氫辣椒素的分析要求。

2.5精密度試驗(yàn)

取同一批四川風(fēng)味麻辣醬樣品共6份，按照上述測(cè)定方法對(duì)樣品中辣椒素和二氫辣椒素的含量進(jìn)行精密度試驗(yàn)。結(jié)果表明，辣椒素的含量分別為0.092g/kg、0.089g/kg、0.091 g/kg、0.093 g/kg、0.090 g/kg、0.094 g/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.04%；二氫辣椒素的含量分別為0.033 g/kg、0.031 g/kg、0.032 g/kg、0.034 g/kg、0.033g/kg、0.032g/kg，RSD為3.23%。表明此方法精密度良好。

3　結(jié)論

本研究針對(duì)辣椒制品的特點(diǎn)，采用了高效液相色譜法對(duì)辣椒制品中的辣椒素和二氫辣椒素進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)提取條件和檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，采用毒性低、價(jià)格便宜的試劑乙醇-水（70∶30，V/V）溶液作為提取液，在樣品充分粉碎均質(zhì)的前提下，采用更為簡(jiǎn)便有效的直接浸提萃取的方式，大大縮短提取時(shí)間。研究表明，對(duì)于水分含量＞15%的鮮辣椒或辣椒制品，樣品中的水分不會(huì)影響辣椒素和二氫辣椒素的定量檢測(cè)，可省去烘干這個(gè)過(guò)程，提高了分析效率。根據(jù)樣品中雜質(zhì)的極性特點(diǎn)，調(diào)整色譜流動(dòng)相極性，選用0.3%磷酸二氫鉀溶液-乙腈（62∶38，V∶V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，能有效地排除香辛料雜峰對(duì)辣椒素和二氫辣椒素的干擾，使雜峰與目標(biāo)峰有效分離，使定量更準(zhǔn)確，進(jìn)一步優(yōu)化了高效液相色譜法測(cè)定辣椒制品中的辣椒素類(lèi)物質(zhì)的方法。

辣椒素和二氫辣椒素加標(biāo)回收率分別在93%～104%和86%～103%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5%。改良后的方法更為簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確，適合各類(lèi)辣椒制品中辣椒素類(lèi)物質(zhì)的批量檢測(cè)，值得推廣。

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Determination of capsaicinoids in capsicum products by HPLC

SUN Shengmei
（Lee Kum Kee（Xin Hui）Food Co.，Ltd.，Jiangmen 529100，China）

The capsaicinoids in capsicum products was detected by HPLC，and the extraction conditions and detection method were researched.Using ethyl alcohol：water=70：30（V：V）as extracting solution，the capsaicin and dihydro capsaicin were extracted by direct extraction method，and separated by Macherey-Nagel Nucleosil120-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），using the 0.3%monopotassium phosphate solution-acetonitrile（62：38，V：V）as mobile phase and the detection wavelength of 230 nm.The results showed that the linear relationship of capsaicin and dihydro capsaicin were good in the range of 20-100 μg/ml（R=0.999 8，R=0.999 9），the limit of detection was 0.001 g/kg，and the recovery rate of capsaicin and dihydro capsaicin were 93%-104%and 86%-103%，respectively.The relative standard deviation was less than 5%.The proposed method was simple，fast，with good accuracy and precision.The method can eliminate the impurity peak interference of spices materials effectively，and it was suitable for determination of capsaicinoids in all kinds of capsicum products.

HPLC；capsaicinoids；determination

TS262.5

0254-5071（2016）03-0148-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.034

2015-12-23

孫勝枚（1964-），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)橘|(zhì)量管理和法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。