郝秋娟，趙士豪*，李　娜，馬同鎖，李　敬，曹芳彥，孫　震

（河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061）

雙酶法水解橡子淀粉工藝研究

郝秋娟，趙士豪*，李娜，馬同鎖，李敬，曹芳彥，孫震

（河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050061）

為掌握中溫α-淀粉酶和糖化酶聯(lián)合水解橡子淀粉的工藝條件，該研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交試驗設(shè)計方法對橡子中的淀粉水解工藝進(jìn)行了研究和優(yōu)化。結(jié)果表明，橡子淀粉最佳液化工藝條件為中溫α-淀粉酶添加量30 U/g，液化溫度70℃，CaCl2添加量0.3%，液化pH 7.5，液化時間120 min，葡萄糖當(dāng)量（DE）值為27.79%；最佳糖化工藝條件為糖化酶添加量300 U/g，糖化溫度50℃，糖化pH 4.5，糖化時間120 min，DE值為48.13%。

橡子淀粉；水解；中溫α-淀粉酶；糖化酶

橡子（acorn），學(xué)名栗繭、蒙古櫟，泛指除大量栽培板栗以外的殼斗科植物種子的總稱［1］。橡子仁營養(yǎng)豐富，含淀粉、單寧、蛋白質(zhì)、脂肪、多種氨基酸、維生素等［2］。韓偉等［3-9］對橡子淀粉性質(zhì)及其加工特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)可利用橡子仁提取淀粉，釀酒［10］、制作豆腐［11］、粉絲、保健品，也可作為飼料等。目前采用雙酶法對米糠淀粉［12］、蕎麥淀粉［13］、小麥芽淀粉［14］、玉米粉［15］等水解工藝研究較多，但利用雙酶法對橡子淀粉水解工藝研究較少。本研究以橡子粉為原料，采用單因素試驗確定了中溫淀粉酶添加量、液化pH、液化溫度、液化時間、CaCl2添加量以及糖化酶添加量、糖化pH、糖化溫度、糖化時間，進(jìn)而采用正交試驗確定了橡子淀粉最佳液化工藝和最佳糖化工藝，為以橡子粉為原料采用液體發(fā)酵制備燃料乙醇提供了理論依據(jù)，為燃料乙醇的制備提供新的原料。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

橡子：采自河南信陽；中溫α-淀粉酶（3 700 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、次甲基藍(lán)、鹽酸等均為分析純：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)公司。

1.2儀器與設(shè)備

ISO 9001電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DGX-9143B-1電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海福馬實驗設(shè)備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1液化工藝條件的確定

（1）單因素試驗

取一定量橡子粉按照料液比1∶5（g∶mL），100℃煮沸30 min；冷卻至70℃，分別添加適量中溫α-淀粉酶、CaCl2，控制適宜用pH值和液化時間，滅酶（100℃、5min），離心（3 000 r/min、15 min），取上清液測定葡萄糖當(dāng)量（dextrose equivalent，DE）值，以確定最佳液化工藝條件。

（2）液化工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以DE值作為考察指標(biāo)，進(jìn)一步設(shè)計L9（34）正交試驗，以確定最佳液化工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1　液化工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for liquefaction technology optimization

1.3.2糖化工藝條件的確定

（1）單因素試驗

分別取一定量的橡子粉液化醪液，添加適量糖化酶，控制適宜的糖化pH、糖化溫度和糖化時間，測定DE值以確定最佳糖化工藝條件。

（2）糖化工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以DE值作為考察指標(biāo)，進(jìn)一步設(shè)計L9（33）正交試驗，以確定最佳糖化工藝條件。正交試驗因素與水平見表2。

表2　糖化工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for saccharification technology optimization

1.3.3檢測分析方法［16］

干物質(zhì)含量測定采用阿貝折光儀測定，還原糖含量測定采用費(fèi)林試劑法。DE值計算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1液化條件的確定

2.1.1中溫α-淀粉酶添加量的確定

取一定量橡子粉按照料液比1∶5（g∶mL），100℃煮沸30 min；冷卻至70℃，分別添加0、10 U/g、20 U/g、30 U/g、40 U/g、50 U/g中溫α-淀粉酶，控制pH 7.0，加入CaCl20.3%，液化60 min，滅酶（100℃、5min），離心（3 000 r/min、15 min）取上清液測定DE值，以確定最佳中溫α-淀粉酶添加量，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著中溫α-淀粉酶的添加量逐漸增大，DE值也逐漸增大。當(dāng)中溫α-淀粉酶添加量＞25 U/g時，再進(jìn)一步增加中溫α-淀粉酶量，DE值增加趨勢變緩。在一定范圍內(nèi)，酶添加量越大，DE值越高，同時增加生產(chǎn)成本。綜合考慮，選擇中溫α-淀粉酶的添加量為25 U/g。

圖1　α-淀粉酶添加量對橡子粉液化的影響Fig.1 Effects of α-amylase addition on acorn starch liquefaction

2.1.2液化溫度的確定

液化溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃，其他條件不變測定DE值，以確定最佳液化溫度，結(jié)果如圖2所示。

圖2　液化溫度對橡子淀粉液化的影響Fig.2 Effects of liquefaction temperature on acorn starch liquefaction

由圖2可知，隨著液化溫度的升高，DE值也逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)70℃時DE值達(dá)到最大值，為16.32%。再繼續(xù)增加溫度，DE開始下降，說明該中溫α-淀粉酶以橡子粉為底物時，其最適液化溫度為70℃。

2.1.3液化時間的確定

圖3　液化時間對橡子淀粉液化的影響Fig.3 Effects of liquefaction time on acorn starch liquefaction

液化時間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，其他條件不變，測定DE值，以確定最佳液化時間，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著液化時間的增加，DE值也逐漸增大，當(dāng)液化時間＞90 min時，DE值增長過緩，綜合考慮生產(chǎn)成本，選擇液化時間90 min。

2.1.4液化pH的確定

分別控制液化pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，其他條件不變，測定DE值，以確定最佳液化pH，結(jié)果如圖4所示。

圖4　pH對橡子淀粉液化的影響Fig.4 Effects of pH on acorn starch liquefaction

由圖4可知，隨著pH的升高，DE值也逐漸增大，但是pH 7.5時，DE值達(dá)到最大值，為20.21%。pH繼續(xù)升高，DE開始下降，故選取液化pH值為7.5。

2.1.5CaCl2添加量的確定

分別添加CaCl20、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，其他條件不變，測定DE值，以確定最佳液化CaCl2添加量，結(jié)果如圖5所示。

圖5　CaCl2添加量對橡子淀粉液化的影響Fig.5 Effects of CaCl2addition on acorn starch liquefaction

由圖5可知，隨著CaCl2添加量的增加，DE值逐漸增大，當(dāng)其添加量為0.2%時達(dá)到最大值，為16.32%。之后隨著CaCl2添加量的增加，轉(zhuǎn)化率開始呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道［17-19］，Ca2+對中溫α-淀粉酶的穩(wěn)定性有保護(hù)作用相一致。故選擇CaCl2添加量為0.2%。

2.1.6液化工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)液化階段的單因素試驗結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計L9（34）正交試驗，以確定最佳液化條件。正交試驗結(jié)果與分析見表3。

表3　液化工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for liquefaction technology optimization

由表3可知，在橡子淀粉液化試驗中，對于DE值影響大小順序依次B＞D＞A＞C，即液化溫度＞CaCl2添加量＞中溫α-淀粉酶添加量＞液化時間，最佳液化工藝條件組合為A3B2C3D3。在此最佳液化工藝條件下進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果表明，采用最佳工藝中溫α-淀粉酶添加量30 U/g、CaCl2添加量0.3%，液化溫度70℃條件下酶解120 min，測定DE值為27.79%。

2.2糖化工藝條件的確定

2.2.1糖化酶添加量的確定

分別取一定量的橡子粉液化醪液，pH 4.5，分別添加糖化酶100 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g、500 U/g，60℃酶解120 min，測定DE值以確定最佳糖化酶添加量，結(jié)果如圖6所示。

圖6　糖化酶添加量對橡子淀粉糖化的影響Fig.6 Effects of glucoamylase addition on acorn starch saccharification

由圖6可知，隨著糖化酶的添加量逐漸增大，DE值也逐漸增大，當(dāng)糖化酶添加量＞300 U/g時，再增加糖化酶用量，DE值增加過緩。綜合考慮生產(chǎn)成本，選擇糖化酶添加量為300 U/g。

2.2.2糖化溫度的確定

其他條件不變，分別于溫度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃條件下糖化，測定DE值以確定最佳糖化溫度，結(jié)果如圖7所示。

圖7　糖化溫度對橡子淀粉糖化的影響Fig.7 Effects of temperature on acorn starch saccharification

由圖7可知，隨著糖化溫度的逐漸升高，DE值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并且在50℃處出現(xiàn)最高值，為44.3%，溫度高于60℃DE呈下降趨勢。故選擇糖化溫度為50℃。

2.2.3糖化時間的確定

其他條件不變，糖化時間分別為30min、60min、90 min、120 min、150 min，測定DE值以確定最佳糖化時間，結(jié)果如圖8所示。

圖8　糖化時間對橡子淀粉糖化的影響Fig.8 Effects of time on acorn starch saccharification

由圖8可知，隨著反應(yīng)時間的逐漸加長，DE值也逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時間到達(dá)90 min時，DE值增加趨勢變緩，時間過長會降低生產(chǎn)效率，故選擇糖化時間為90 min。

2.2.4糖化pH值的確定

其他條件不變，分別控制pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，測定DE值以確定最佳糖化pH，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可知，隨著pH逐漸增大，DE值呈現(xiàn)是先增后減，當(dāng)pH在4.0～4.5時，DE值達(dá)最大，為45.8%，再繼續(xù)增大pH，DE值呈下降趨勢。綜合考慮選擇糖化pH 4.5。

圖9　pH對橡子淀粉糖化的影響Fig.9 Effects of pH on acorn starch saccharification

2.2.5糖化工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)糖化階段的單因素試驗的結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計L9（33）正交試驗，以確定最佳液化條件。正交試驗結(jié)果與分析見表4。

表4　糖化工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for saccharification technology optimization

由表4可知，在橡子粉液化醪液的糖化試驗中，對DE值影響大小順序依次是B＞A＞C，即糖化溫度＞糖化酶添加量＞糖化時間，最佳糖化工藝條件組合為A2B2C3，即糖化酶添加量300 U/g，糖化溫度50℃，糖化時間120 min，此時DE值為47.28%。經(jīng)驗證試驗，最佳工藝條件下水解橡子淀粉DE值達(dá)48.13%。

3　結(jié)論

橡子淀粉最佳的水解工藝為料液比1∶5（g∶mL），100℃煮沸30 min；冷卻至70℃，控制中溫α-淀粉酶添加量為30 U/g，液化溫度為70℃，最佳pH 7.5，液化時間為120 min，CaCl2的添加量為0.3%；控制糖化酶添加量300 U/g，糖化溫度50℃，pH 4.5，糖化時間120 min。在此工藝條件下，DE值達(dá)48.13%。利用中溫α-淀粉酶和糖化酶水解橡子淀粉工藝的確定，為以橡子粉為原料采用液體發(fā)酵制備燃料乙醇提供了理論依據(jù)，為燃料乙醇的制備提供了新的原料，為橡子的深加工提供了新途徑。

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Hydrolysis technology for acorn starch by double enzymes

HAO Qiujuan，ZHAO Shihao*，LI Na，MA Tongsuo，LI Jing，CAO Fangyan，SUN Zhen
（College of Biological Science and Engineering，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China）

In order to perfect hydrolysis of acorn starch with the mesothermal α-amylase and glucoamylase，the hydrolysis conditions were optimized with orthogonal experiment based on single factor tests.The results showed that the optimal liquefaction process conditions were obtained as follows：mesothermal α-amylase addition 30 U/g，liquefaction temperature 70℃，pH 7.5，time 120 min，CaCl2addition 0.3%，the dextrose equivalent（DE）was 27.79%.The optimal saccharification technology conditions were obtained as follows：glucoamylase addition 300 U/g，saccharification temperature 50℃，pH 4.5，time 120 min，and DE was 48.13%.

acorn starch；hydrolysis；mesothermal α-amylase；glucoamylase

TS231

0254-5071（2016）03-0124-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.028

2016-01-08

河北省科技支撐計劃項目（14236802D-2）；河北省社會科學(xué)基金項目（HB13GL036）；河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)2014年大學(xué)生創(chuàng)新實驗項目（201400052）

郝秋娟（1976-），女，講師，碩士，主要從事發(fā)酵工程方向的教學(xué)和研究工作。

趙士豪（1966-），男，教授，碩士，主要從事食品加工技術(shù)方向的教學(xué)和研究工作。