劉樹勛，楊航宇，王紹陽，歐陽驍宇，張柏林，朱保慶（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

野生藍莓酒皮渣花色苷及其抗氧化活性研究

劉樹勛，楊航宇，王紹陽，歐陽驍宇，張柏林，朱保慶*
（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

該研究比較了蒸餾前后野生藍莓酒皮渣中的總酚及花色苷含量、花色苷單體的組成和抗氧化活性。結(jié)果表明，藍莓酒皮渣中總花色苷含量為（8.64±0.13）mg/g，總酚含量為（77.24±1.42）mg/g，抗氧化活性為Trolox當(dāng)量濃度（3.59±0.11）μmol/g；單體花色苷含量較多的是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（29.90%）、3′-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（21.31%）和花翠素-3-O-葡萄糖苷（20.44%）。蒸餾后，皮渣中的總酚及花色苷含量分別下降為（68.11±1.20）mg/g和（5.05±0.09）mg/g，其單體降解率變化在21.64%～43.47%。其中，二甲花翠素-3，5-O-二葡萄糖苷穩(wěn)定性最差，降解率為43.47%；花青素-3-O-葡萄糖苷較為穩(wěn)定，降解率為21.64%；Trolox當(dāng)量濃度下降為（3.07±0.07）μmol/g，皮渣抗氧化能力也降低了14.64%。因此，野生藍莓果酒發(fā)酵產(chǎn)生的皮渣具有較高的利用價值，開發(fā)時應(yīng)盡量避免高溫處理。

藍莓酒皮渣；蒸餾；花色苷；抗氧化活性

篤斯越橘（Vaccinium uliginosumL.）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，是生長在大小興安嶺地區(qū)的一種野生藍莓；其果實營養(yǎng)豐富，含有糖、有機酸、氨基酸和維生素等物質(zhì)，還富含多種多酚類和黃酮類成分，特別是花色苷含量極高，具有抗氧化、延緩衰老、抗癌、保護視力等多種生理功能［1-5］。野生藍莓因含糖量低、酸高、果粒小、果皮薄等原因，不宜鮮食，多加工成果干、果醬或果酒等產(chǎn)品消費［6］。野生藍莓釀造加工成為果酒的過程中會產(chǎn)生的皮渣，常通過蒸餾生產(chǎn)皮渣白蘭地。前人對葡萄酒皮渣中殘存的功效成分和開發(fā)利用價值研究較為系統(tǒng)［7-8］，但藍莓酒方面，特別是野生藍莓酒皮渣相關(guān)研究鮮有報道。

本研究對蒸餾處理前后的野生藍莓酒皮渣總酚及花色苷含量進行了測定，分析了藍莓酒皮渣蒸餾前后花色苷單體的組成變化，測定了其抗氧化活性的變化，旨在為野生藍莓酒皮渣綜合利用及獲得更高的經(jīng)濟效益提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

野生藍莓酒蒸餾前后的皮渣：由黑龍江省北域時代生物科技有限公司提供。

甲醇、乙腈、甲酸和乙酸（均為色譜純）：美國Fisher公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-pccryhydrazyl，DPPH）：上海如吉生物科技有限公司；水溶性維生素E（Trolox）：上海惠誠科技有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、濃鹽酸、氯化鉀、醋酸鈉、冰醋酸、沒食子酸、無水碳酸鈉（均為分析純）：北京化學(xué)試劑公司。

1.2儀器與設(shè)備

Milli-Q Academic超純水器：百壹星辰（北京）生物科技有限公司；4802 UV/VIS紫外分光光度計：美國UNICO公司；FA 2004電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；pHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TGL-16G臺式高速離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；RE-52 AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHK-99-II臺式空氣恒溫搖床：北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；Kromasil C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：瑞典EKA Chemicals公司；Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器（DAD）的LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1野生藍莓酒皮渣中多酚及花色苷的提取

參考楊哲等［9］的方法，分別將蒸餾前及蒸餾后的野生藍莓酒皮渣放入-80℃冰箱中預(yù)冷12 h，然后真空冷凍干燥12 h后研磨得到皮渣干粉。精確稱量0.50 g皮渣干粉，加入10 mL 2%甲酸甲醇溶液，超聲萃取10 min后在25℃避光搖床萃取30 min；8 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，重復(fù)提取5次，最后合并上清液，30℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲酸和甲醇，用流動相A∶B=1∶9（流動相A：水∶甲酸∶乙腈=92∶2∶6，V/V；流動相B：水∶甲酸∶乙腈=44∶2∶54，V/V）的定容劑溶解定容至10 mL。樣品用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾后-80℃保存待用。

1.3.2總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定1.2.1提取液中多酚含量，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，藍莓酒皮渣（干質(zhì)量）中的總酚以沒食子酸的當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示。

1.3.3野生藍莓酒皮渣花色苷總量測定

參考孫婧超等［10-11］的方法，采用pH值示差法測定1.3.1提取液中總花色苷的含量。

吸取1.0mL過濾后的樣品，用pH1.0的緩沖液（0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67，V/V）定容至10.0 mL。室溫條件下避光平衡100min后，以蒸餾水為空白，分別在波長521 nm和700 nm處測定吸光度值。

用同樣的方法測樣品在pH 4.5緩沖溶液（0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc=1∶1，V/V）中的吸光度值?？偦ㄉ蘸坑嬎愎饺缦拢?/p>

式中：A=（A521nm-A700nm）pH1.0-（A521nm-A700nm）pH4.5；MW為二甲花翠素色素-3-O-葡萄糖苷分子質(zhì)量，493.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為樣品提取液的定容總體積，L；ε為二甲花翠素色素-3-O-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，28 000 L/（mol·cm）；1為比色皿光程厘米數(shù)；m為藍莓皮渣干粉質(zhì)量，g。

1.3.4藍莓酒皮渣抗氧化活性測定

提取液的自由基清除能力參照CHU Y H等方法［12-14］，稍作改動。將DPPH 12.5 mg用無水乙醇溶解至100 mL，再稀釋5倍，配制成質(zhì)量濃度為25 mg/L的乙醇溶液。向1 mL 1.3.1所得提取液中加入3 mL DPPH乙醇溶液，暗處靜置30 min后于波長517 nm處測定吸光度值（A樣品），對照以乙醇代替樣品（A對照）。結(jié)果以μmol/g Trolox當(dāng)量濃度表示。DPPH自由基清除率計算公式如下：

1.3.5藍莓皮渣花色苷單體組成分析

參考HAN F L等［15］的方法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜（highperformanceliquidchromatography-massspectrometry，HPLC-MS）法檢測分析1.3.1提取液花色苷組成。高效液相色譜條件：KromasilC18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相A：水∶甲酸∶乙腈=92∶2∶6，V/V；流動相B：水∶甲酸∶乙腈=44∶2∶54，V/V；流速1 mL/min；柱溫50℃；檢測波長525 nm；進樣量：30 μL；梯度洗脫程序：0～4 min：6%～10% B，4～12min：10%～25%B，12～13min：25%B，13～20min：25%～40%B，20～35 min：40%～60%B，35～40 min：60%～100%B，40～45 min：100%～6%B。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子模式，離子掃描范圍：100～1500m/z；霧化器壓力：206.85 kPa；干燥器流速：10 L/min；干燥氣溫度：325℃。

1.3.6花色苷單體降解率的測定

單體花色苷降解率計算公式如下：

1.3.7數(shù)據(jù)分析

每個樣品重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示；采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1野生藍莓皮渣花色苷、多酚含量以及抗氧化能力

分別對蒸餾處理前后野生藍莓酒皮渣花色苷、多酚含量及抗氧化能力進行測定，結(jié)果如表1所示。

表1的結(jié)果表明，野生藍莓酒皮渣總花色苷含量為（8.64±0.13）mg/g，明顯高于李亞輝等［16］在最佳工藝條件下對黑莓酒渣花色苷提取量（4.70 mg/g）；與劉晨等［17-18］對種植藍莓釀酒酒渣中的花色苷含量6.09mg/g和6.26mg/g相比，野生藍莓酒皮渣中的花色苷含量更高。經(jīng)過蒸餾，藍莓酒皮渣中花色苷含量由（8.64±0.13）mg/g降為（5.05±0.09）mg/g，下降了41.55%。王秀菊等［18］研究表明，溫度對花色苷的降解速率影響顯著，當(dāng)溫度＜60℃時，藍莓酒皮渣花色苷比較穩(wěn)定，而當(dāng)處理溫度＞80℃時，花色苷的穩(wěn)定性就會急劇下降。前人多項研究也表明高溫引起花色苷分解，會導(dǎo)致花色苷總量降低［19-21］。

表1　野生藍莓酒皮渣中總花色苷含量、總酚含量以及抗氧化活性Table 1 Total anthocyanin content，total phenolic content and antioxidant activity of wild blueberry wine pomace

蒸餾前藍莓酒渣總酚含量為（77.24±1.42）mg/g，顯著高于DENG Q等［22］測定的紅葡萄酒渣（21.4～26.7 mg/g）以及白葡萄酒渣（11.6～15.8mg/g）中的多酚含量；經(jīng)過高溫蒸餾后，藍莓酒皮渣中多酚含量下降至（68.11±1.20）mg/g，較蒸餾前下降了11.82%。顯然，蒸餾過程中的高溫環(huán)境會破壞藍莓多酚成分的結(jié)構(gòu)，使其穩(wěn)定性受到影響，總量降低。

多酚是具有較高抗氧化能力的物質(zhì)，其濃度的變化能夠引起藍莓皮渣抗氧化活性的改變。表1數(shù)據(jù)顯示，藍莓酒皮渣的抗氧化能力蒸餾前后有較大變化：蒸餾處理后其抗氧化性降低，Trolox當(dāng)量濃度由（3.59±0.11）μmol/g下降為（3.07±0.07）μmol/g，抗氧化活性降低了14.62%，與多酚含量下降的比率相近，但明顯低于花色苷含量下降的比率。

2.2野生藍莓皮渣花色苷單體的組成

通過保留時間，分子和離子碎片，并結(jié)合相關(guān)文獻［23-24］，可以利用HPLC-MS法分析野生藍莓皮渣中的花色苷單體，結(jié)果如表2所示，蒸餾對藍莓皮渣中的花色苷單體組成的影響結(jié)果見圖1。

表2　HPLC-MS法分析野生藍莓酒皮渣中花色苷單體Table 2 Analysis of anthocyanins monomers in wild blueberry winepomace by HPLC-MS

由表2可知，野生藍莓酒皮渣中主要的花色苷單體是花翠素-3，5-O-二葡萄糖苷，花翠素-3-O-葡萄糖苷，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷，花青素-3-O-葡萄糖苷，3'-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷，二甲花翠素-3，5-O-二葡萄糖苷甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷等7種。蒸餾前含量較多的單體是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（29.90%）、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（21.31%）和花翠素-3-O-葡萄糖苷（20.44%），這與胡濟美等［25］對大興安嶺野生藍莓果實花色苷成分的研究結(jié)果具有一致性，表明酒精發(fā)酵對野生藍莓果實中葡萄糖苷化的花色苷組成的影響不大；但胡濟美等［25］在篤斯越橘果實中檢測出13種花色苷，本研究在皮渣中僅鑒定出一種（見表2含阿拉伯糖苷的花色素單體，未發(fā)現(xiàn)含半乳糖苷結(jié)構(gòu)的花色素單體；其原因可能是相較于葡萄糖糖基化（X-glu）的單體花色苷，藍莓酒中半乳糖和阿拉伯糖糖基化（X-Gly，X-Ara）的單體花色苷更不穩(wěn)定［26］。此外，值得注意的是，李楊等［27］在葡萄酒皮渣中檢測出含量較高的3種花色苷為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷及其乙?；╩alvidin-3-O-（6-O-acetyl）-glucoside）和反式-香豆?；模╩alvidin-3-O-（trans-6-O-coumaryl）-glucoside）的花色苷，與野生藍莓酒皮渣中花色苷在組分上存在較大差異性，這有助于甄別兩類果酒皮渣的花色苷提取物。

圖1　蒸餾對藍莓酒皮渣花色苷單體組成的影響Fig.1 Effect of distillation on the constituents of anthocyanins monomers in wild blueberry wine pomace

由圖1可知，經(jīng)蒸餾后，野生藍莓酒皮渣中的花色苷單體會進一步降解，降解率在21.64%～43.47%。其中，二甲花翠素-3，5-O-二葡萄糖苷下降比例最大，為43.47%；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷也有較大比例的下降，為34.91%；花青素-3-O-葡萄糖苷下降比例最小，為21.64%。說明不同結(jié)構(gòu)的花色苷熱穩(wěn)定性有較大差異。

3　結(jié)論

對野生藍莓酒皮渣的總酚、花色苷總量和抗氧化活性以及花色苷單體組成測定表明，藍莓酒皮渣總酚含量為（77.24±1.42）mg/g，總花色苷含量可達（8.64±0.13）mg/g，抗氧化活性為Trolox當(dāng)量濃度（3.59±0.11）μmol/g；單體花色苷含量較多的是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（29.90%）、3'-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（21.31%）和花翠素-3-O-葡萄糖苷（20.44%）。蒸餾處理會顯著影響野生藍莓酒皮渣的總酚和花色苷總量，導(dǎo)致單體花色苷降解，抗氧化性下降。因此在綜合利用野生藍莓酒皮渣時，應(yīng)避免高溫處理。

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Anthocyanins of wildblueberry wine pomace and its antioxidant activity

LIU Shuxun，YANG Hangyu，WANG Shaoyang，OUYANG Xiaoyu，ZHANG Bolin，ZHU Baoqing*
（Beijing Key Laboratory of Forestry Food Processing and Safety，School of Biological Science&Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

The contentsof total polyphenols and anthocyanins and the constituents and antioxidant activity of anthocyanins monomers inwild blueberry wine pomace before and after distillation were compared.Results indicated that the total anthocyanin content was（8.64±0.13）mg/g，total polyphenols content was（77.24±1.42）mg/g and its antioxidant activity（expressed as Trolox equivalent concentration）was（3.59±0.11）μmol/g.The major constituents of anthocyanins were dimethyl delphinidin-3-O-glycosidase（29.90%），3′-methyl delphinidin-3-O-glycosidase（21.31%）and delphinidin-3-O-glycosidase（20.44%）.After distillation，the total phenols and anthocyanin contents in pomace decreased to（68.11±1.20）mg/g and（5.05± 0.09）mg/g，respectively，and the changes of degradation rate of its monomers were 21.64%-43.47%.The stability of dimethyl delphinidin-3，5-O-two glycosidase was the worst and its degradation rate was 43.47%.The stability of anthocyanins-3-O-glucoside was the better，and its degradation rate was 21.64%.When Trolox equivalent concentration decreased to（3.07±0.07）μmol/g，the antioxidant ability reduced 14.64%.Therefore，the pomace produced by wild blueberry wine fermentation had higher utilization value，and it should try to avoid high-temperature in the processing.

blueberry wine pomace；distillation；anthocyanin；antioxidant activity

TQ920.9

0254-5071（2016）02-0115-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.026

2015-11-10

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（YX2015-15和2015ZCQ-SW-04）；北京林業(yè)大學(xué)2015年度本科生科技創(chuàng)新計劃項目（XS201511和X201510022031）；國家林業(yè)局“引進國際林業(yè)先進科學(xué)技術(shù)”948項目（2015-4-49）

劉樹勛（1991-），男，碩士研究生，研究方向為果酒釀造與加工。

朱保慶（1982-），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。