高　霄，陳　倩，蔣予箭（浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

大豆酸乳發(fā)酵菌種的馴化及營養(yǎng)因子的研究

高霄，陳倩，蔣予箭*
（浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

選擇保加利亞桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）作為發(fā)酵菌種，通過逐步提高牛奶中豆乳的比例對(duì)菌種進(jìn)行馴化的方法和改變培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的含量，研究大豆酸乳發(fā)酵過程中酸度值和菌落總數(shù)的變化情況。結(jié)果表明，經(jīng)過馴化后的保加利亞桿菌發(fā)酵大豆酸乳過程中，酸度值從37.5°T上升至40.0°T，活菌數(shù)量提高了0.5倍；經(jīng)過馴化后的嗜熱鏈球菌發(fā)酵大豆酸乳過程中，酸度值從35.0°T上升至37.5°T，活菌數(shù)量提高了1.67倍；經(jīng)過馴化后的混合菌種（保加利亞桿菌∶嗜熱鏈球菌比例為1∶1）發(fā)酵大豆酸乳過程中，酸度值從42.5°T升至48.5°T，活菌數(shù)量提高了1.85倍；5種營養(yǎng)因子對(duì)大豆酸乳酸度的提高作用順序?yàn)榇蠖闺模景被幔竞}卜汁＞低聚果糖＞西紅柿汁。

大豆；菌種馴化；營養(yǎng)因子；酸度；菌落總數(shù)

大豆作為我國的主要農(nóng)作物之一，不僅產(chǎn)量高而且營養(yǎng)十分豐富，大豆進(jìn)一步加工而制成的豆?jié){則作為中國傳統(tǒng)飲品，一直受到國人的喜愛，豆?jié){中富含植物蛋白和多種維生素（如維生素B1、B2和煙酸），還含有鐵、鈣等礦物質(zhì)。利用豆?jié){發(fā)酵而成的酸豆乳，其營養(yǎng)成分更有益于人體吸收。豆乳發(fā)酵常用的菌種是保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilic），但是由于豆乳在發(fā)酵過程中容易受到菌種及發(fā)酵機(jī)制等的影響，直接影響酸豆乳產(chǎn)品品質(zhì)，而且豆?jié){中可供發(fā)酵菌種利用的營養(yǎng)物質(zhì)也相對(duì)較少，導(dǎo)致發(fā)酵的大豆酸乳酸度低、活菌數(shù)量較少，嚴(yán)重抑制了酸豆乳發(fā)酵。本研究通過逐步提高牛奶中豆乳的比例對(duì)菌種進(jìn)行馴化的方法和改變培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的含量（添加西紅柿汁、胡蘿卜汁、低聚果糖、氨基酸、大豆肽5種營養(yǎng)因子），使菌種在發(fā)酵過程中逐漸適應(yīng)環(huán)境的變化，為大豆酸乳發(fā)酵的優(yōu)化提供一定的科學(xué)依據(jù)，從而提高酸豆乳產(chǎn)品品質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆?jié){：祖明豆制品有限公司提供；脫脂乳粉、西紅柿、胡蘿卜：市售；大豆肽粉、復(fù)合氨基酸粉（含17種氨基酸）、低聚果糖（食品級(jí)）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilic）：哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司。

M17固體培養(yǎng)基：南京森貝伽生物科技有限公司；酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉（均為分析純）、蔗糖（食品級(jí)）：鄭州瑞恒化工有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

B-HS-900/900U無菌操作臺(tái)：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；ZHG-9070A（S）干燥箱：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZNCL-BS數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：九陽股份有限公司；ZNCL-BS酸度計(jì)：泰州市育才教學(xué)設(shè)備有限公司；XB10200D電子天平：梅特勒-托利多集團(tuán)；44X3生物顯微鏡：上海光學(xué)儀器一廠；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1培養(yǎng)基制備

MRS固體培養(yǎng)基的制備：精確稱取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、檸檬酸二銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g，量取吐溫80 mL、水1 L，121℃滅菌20 min。

脫脂乳培養(yǎng)基的制備：精確稱取脫脂乳粉11 g，加100 mL蒸餾水溶解，112℃滅菌15 min。

菌種馴化培養(yǎng)基的制備：豆?jié){與脫脂牛乳分別按照0∶10、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、0∶10（V/V）的比例進(jìn)行混合，再分裝到50 mL錐形瓶中，112℃滅菌15 min。

1.3.2菌種的活化及復(fù)壯

菌種的活化：首先將干燥菌種進(jìn)行脫脂乳活化，取1 mL脫脂乳梯度稀釋后在平板上進(jìn)行涂布，挑選合適梯度的單菌落進(jìn)行第三代劃線活化，觀察菌落的形態(tài)并制備發(fā)酵劑。然后將第三代平板單菌落接種到脫脂乳中，發(fā)酵至脫脂乳發(fā)生凝固時(shí)即可，此時(shí)的發(fā)酵劑為較好的發(fā)酵劑（酸度≥40°T）。

發(fā)酵劑制作過程：菌種培養(yǎng)物（5 mL脫脂乳/試管）→1%～2%母發(fā)酵劑（100 mL脫脂乳/小三角瓶）。

菌種的復(fù)壯：菌種的活性在馴化和發(fā)酵過程中不斷降低，在此過程中發(fā)酵性能的衰退導(dǎo)致乳清過多析出、酸度持續(xù)降低，而這種現(xiàn)象的消除需要對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，即從發(fā)酵劑中挑取菌種進(jìn)行平板涂布，37℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，再挑取單菌落進(jìn)行染色鏡檢，觀察菌種形態(tài)是否發(fā)生變化。選擇較強(qiáng)壯的單菌落在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，再進(jìn)行平板涂布，挑取單菌落。如此重復(fù)2～3次，從液體培養(yǎng)基中接種適量菌液至脫脂乳培養(yǎng)基中，最后得到母發(fā)酵劑。

1.3.3菌種的馴化

采用增加牛乳中豆?jié){比例和傳代馴化兩種方法交疊對(duì)保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行馴化［3］。在牛奶與豆?jié){體積比10∶0的環(huán)境下接種菌種進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵成品作為菌種再接種至牛奶與豆?jié){體積比9∶1的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。依次調(diào)整牛奶與豆?jié){的體積比為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10，單菌和混合菌均按照牛奶遞減的比例進(jìn)行馴化。

梯度馴化過程中，每個(gè)梯度需要連續(xù)馴化2～3次，以驗(yàn)證菌種連續(xù)傳代活性的強(qiáng)弱，如果菌種活性衰退，則及時(shí)進(jìn)行菌種復(fù)壯。

1.3.4營養(yǎng)因子及大豆酸乳的制備

營養(yǎng)因子制備：分別稱取一定質(zhì)量的氨基酸粉、大豆肽粉、低聚果糖配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、2.0%、 3.0%）的溶液；西紅柿、胡蘿卜軟化、去皮、榨汁過濾，再調(diào)配成固形物含量分別為0.5 °Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx。

大豆酸乳制備：調(diào)整豆?jié){中固形物含量至8%，添加蔗糖和營養(yǎng)因子，于90℃滅菌20 min，冷卻至45℃，分別接種保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌和混合菌種（保加利亞桿菌：嗜熱鏈球菌比例為1∶1），分別于43℃發(fā)酵8 h，4℃后熟14 h，得到大豆酸乳成品。

1.3.5酸度測定及菌落計(jì)數(shù)

酸度測定按照國標(biāo)GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》中方法進(jìn)行，以滴定酸度（°T）表示。保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌及混合菌種菌落計(jì)數(shù)采用國標(biāo)GB 4789.35—2010《乳酸菌檢驗(yàn)》中方法進(jìn)行。

1.3.6數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel、Origin8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種馴化對(duì)發(fā)酵過程大豆酸乳酸度的影響

圖1　保加利亞桿菌（A）、嗜熱鏈球菌（B）及混合菌種（C）發(fā)酵大豆酸乳過程中的酸度變化Fig.1 Changes of acidity in soy yogurt fermented by L.bulgaricus（A），S.thermophilus （B）and double-strains（C）

利用1.3.3法對(duì)發(fā)酵菌種進(jìn)行馴化，進(jìn)而測定大豆酸乳發(fā)酵過程中保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌、以及馴化混合菌種（保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌按照1∶1比例接種）的酸度與對(duì)照組酸豆乳（未經(jīng)過馴化的菌種）的酸度。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中大豆酸乳酸度呈上升趨勢。發(fā)酵前期酸度上升速度較快，菌種利用蔗糖并快速生長，代謝產(chǎn)酸使酸度上升。隨著菌種數(shù)量增多，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少，環(huán)境不利于菌種的生長，因此代謝產(chǎn)酸速度降低，酸度的上升速度變慢。

馴化與未馴化的單菌種與混合菌種發(fā)酵對(duì)大豆酸乳的酸度影響均較大，兩菌種經(jīng)過馴化之后的最終酸度均增加。保加利亞桿菌經(jīng)過馴化后發(fā)酵大豆酸乳的酸度從37.5°T上升至40°T。嗜熱鏈球菌經(jīng)馴化作用后發(fā)酵的大豆酸乳的酸度由35°T上升至37.5°T；經(jīng)馴化后，混合菌種發(fā)酵的大豆酸乳的酸度由42.5°T升至48.5°T。

2.2菌種馴化對(duì)發(fā)酵過程大豆酸乳菌落數(shù)量的影響

利用平板涂布法對(duì)大豆酸乳在發(fā)酵過程中乳酸菌菌落數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，馴化后的單菌種與混合菌種發(fā)酵對(duì)大豆酸乳的菌種數(shù)量均有較明顯的增多。馴化后的嗜熱鏈球菌發(fā)酵大豆酸乳的活菌數(shù)量提高了1.67倍；馴化后的保加利亞桿菌發(fā)酵大豆酸乳的活菌數(shù)量提高了0.5倍；馴化的混合菌種發(fā)酵大豆酸乳的菌種數(shù)量提高了1.85倍，此時(shí)發(fā)酵大豆酸乳的菌落總數(shù)為3.7×109CFU/100 mL。在發(fā)酵初期，菌種利用蔗糖進(jìn)行生長代謝，馴化菌種與未馴化菌種的數(shù)量增加并且增幅相差較小。發(fā)酵后期蔗糖被消耗完，未經(jīng)過馴化的菌種無法很好的適應(yīng)生長環(huán)境，生長減慢，馴化菌種逐漸適應(yīng)了大豆酸乳的生長環(huán)境，因此可以持續(xù)生長增殖。

2.3營養(yǎng)因子對(duì)大豆酸乳發(fā)酵過程中酸度及菌種數(shù)量的影響

按照保加利亞桿菌∶嗜熱鏈球菌比例為1∶1接種，按照

1.3.4方法發(fā)酵大豆酸乳，測定發(fā)酵過程中酸度以及菌落數(shù)量的變化。

2.3.1西紅柿汁、胡蘿卜汁對(duì)大豆酸乳發(fā)酵過程中酸度及菌落總數(shù)的影響

西紅柿汁與胡蘿卜汁（固形物含量分別為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx），于90℃滅菌15 min，在豆?jié){中加入4%促營養(yǎng)因子并接種發(fā)酵，不添加營養(yǎng)因子的大豆酸乳作為空白對(duì)照組。分別在發(fā)酵過程中的2～8 h測定大豆酸乳的酸度及菌落總數(shù)的變化，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖2　保加利亞桿菌（A），嗜熱鏈球菌（B）及混合菌種（C）發(fā)酵大豆酸乳過程中菌落總數(shù)的變化Fig.2 Changes of total bacterial count in soy yogurt fermented by L.bulgaricus（A），S.thermophilus （B）and double-strains（C）

圖3　不同固形物含量的西紅柿汁對(duì)大豆酸乳酸度（A）及菌落總數(shù)（B）的影響Fig.3 Effect of different solid content of tomato juice on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

圖4　不同固形物含量的胡蘿卜汁對(duì)大豆酸乳酸度（A）及菌落總數(shù)（B）的影響Fig.4 Effect of different solid content of carrot juice on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

由圖3A及圖4A可知，加入營養(yǎng)因子后，菌種獲得了生長必需的一些營養(yǎng)因子，因此生長速率加快，代謝產(chǎn)酸能力增強(qiáng)。不同固形物含量的西紅柿汁與胡蘿卜汁對(duì)大豆酸乳的最終酸度均有提高作用。發(fā)酵后期菌種數(shù)量增多，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)開始減少，對(duì)照組的酸度明顯低于添加營養(yǎng)因子的大豆酸乳的酸度，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，對(duì)照組大豆酸乳的酸度為47.5°T。西紅柿汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對(duì)應(yīng)的大豆酸乳的酸度分別50°T、52.5°T、53.5°T、47.5°T；胡蘿卜汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對(duì)應(yīng)的大豆酸乳的酸度分別為49.5°T、53.5°T、57.5°T、51°T。固形物含量不同的營養(yǎng)因子對(duì)大豆酸乳的酸度有不同影響，固形物含量為2°Bx時(shí)的西紅柿汁、胡蘿卜汁對(duì)酸度的提高作用最大，此時(shí)大豆酸乳的酸度分別為53.5°T、57.5°T。

由圖3B及圖4B可知，含有不同含量固形物的營養(yǎng)因子對(duì)菌落總數(shù)均有不同程度的提高作用。大豆酸乳在發(fā)酵過程中，發(fā)酵2h后對(duì)照組的活菌數(shù)量為1.2×108CFU/100 mL。西紅柿汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對(duì)應(yīng)的菌種數(shù)量分別為1.3×108CFU/100mL、1.9×108CFU/100mL、2.76×108CFU/100 mL、1.9×108CFU/100 mL。胡蘿卜汁固形物含量為0.5°Bx、1.0°Bx、2.0°Bx、3.0°Bx對(duì)應(yīng)菌種數(shù)量為2.4×108CFU/100mL、2×108CFU/100mL、7.5×108CFU/100mL、1.95×108CFU/100 mL。不斷發(fā)酵過程中，菌種的生長速度逐漸下降，其中對(duì)照組的菌種生長速度下降最明顯，然而添加營養(yǎng)因子的菌種生長速度下降較慢，甚至還有小幅增長。發(fā)酵終止后，對(duì)照組的活菌數(shù)量為3.7×109CFU/100 mL；西紅柿汁、胡蘿卜汁固形物含量為2°Bx，活菌數(shù)量增加最多，分別為4.3×109CFU/100 mL、5.9×109CFU/100 mL，分別為空白組活菌數(shù)量的1.2倍和1.6倍。

2.3.2氨基酸、大豆肽、低聚果糖對(duì)大豆酸乳的酸度及菌落總數(shù)的影響

分別配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）的氨基酸、大豆肽、低聚果糖溶液，在豆?jié){中加入4%的營養(yǎng)因子溶液，接入菌種發(fā)酵，空白對(duì)照組不添加營養(yǎng)因子。分別在發(fā)酵過程中的2 h、3 h、4 h、6 h、7 h、8 h測定大豆酸乳的酸度變化及活菌數(shù)量，結(jié)果如圖5～圖7所示。

圖5　不同質(zhì)量濃度的氨基酸溶液對(duì)大豆酸乳酸度（A）及菌落總數(shù)（B）的影響Fig.5 Effect of different content of amino acid solution on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

圖6　不同質(zhì)量濃度的大豆肽溶液對(duì)大豆酸乳酸度（A）及菌落總數(shù)（B）的影響Fig.6 Effect of different content of soybean peptide solution on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

圖7　不同質(zhì)量濃度低聚果糖溶液對(duì)大豆酸乳酸度（A）及菌落總數(shù)（B）的影響Fig.7 Effect of different content of fructooligosaccharide solution on the acidity（A）and total bacterial count（B）of soy yogurt

由圖5A～圖7A可知，不同濃度的氨基酸、大豆肽、低聚果糖溶液對(duì)大豆酸乳發(fā)酵的酸度有提高作用。發(fā)酵結(jié)束后對(duì)照組的酸度為47.5°T，當(dāng)添加氨基酸質(zhì)量濃度為1.0%時(shí)，大豆酸乳酸度最高，酸度值為58.5°T；當(dāng)添加大豆肽質(zhì)量濃度為3.0%時(shí)，大豆酸乳酸度最高，酸度值為60°T；當(dāng)添加低聚果糖質(zhì)量濃度為2%時(shí)，大豆酸乳酸度最高，酸度值為55°T。

由圖5B～圖7B可知，3種營養(yǎng)因子的添加對(duì)活菌總數(shù)均有較明顯的提高作用。發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)照組的活菌總數(shù)為3.7×109CFU/100 mL，當(dāng)添加氨基酸質(zhì)量濃度為3.0%時(shí)，大豆酸乳活菌總數(shù)為8×109CFU/100 mL，是對(duì)照組的2.16倍；當(dāng)添加大豆肽質(zhì)量濃度為2.0%時(shí)，大豆酸乳活菌總數(shù)為6.83×109CFU/100mL，是對(duì)照組的1.85倍；當(dāng)添加低聚果糖質(zhì)量濃度為2.0%時(shí)，大豆酸乳活菌總數(shù)為7×109CFU/100mL，是對(duì)照組的1.89倍。

3　結(jié)論

菌種馴化對(duì)單菌、混合菌種發(fā)酵大豆酸乳的酸度及活菌總數(shù)均有明顯的增加作用。經(jīng)過馴化后的保加利亞桿菌發(fā)酵大豆酸乳過程中，酸度值從37.5°T上升至40°T；經(jīng)過馴化后的嗜熱鏈球菌發(fā)酵大豆酸乳過程中，酸度值從35°T上升至37.5°T；經(jīng)過馴化后的混合菌種發(fā)酵大豆酸乳過程中，酸度值從42.5°T升至48.5°T。通過添加西紅柿汁、胡蘿卜汁、低聚果糖、氨基酸、大豆肽這5種營養(yǎng)因子均有效提高了菌種的生長速度，對(duì)發(fā)酵大豆酸乳的酸度、菌種總數(shù)均有所提高，其中這5種營養(yǎng)因子對(duì)大豆酸乳酸度的提高作用順序?yàn)榇蠖闺模景被幔竞}卜汁＞低聚果糖＞西紅柿汁。添加體積分?jǐn)?shù)4.0%含量為3.0%大豆肽對(duì)大豆酸乳的酸度提高作用最為顯著，酸度值由47.5°T上升至60°T，活菌總數(shù)由3.7×109CFU/100 mL增加至6.83×109CFU/100 mL。

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Study on the domestication of fermentation strains and the nutrition factors of soybean yoghurt

GAO Xiao，CHEN Qian，JIANG Yujian*
（College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018，China）

UsingLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophilusas fermentation strains，by gradually increasing the proportion of soybean milk in cow milk to domesticate strains and changing content of nutritional components in culture medium，the changes of acidity and total bacterial count during the fermentation process of soybean yoghurt were researched.The results showed that in the soybean yoghurt fermented by domesticatedL.bulgaricus，the acidity increased from 37.5°T to 40.0°T，the viable count was increased by 0.5 times.In the soybean yoghurt fermented by domesticatedS.thermophilus，the acidity increased from 35.0°T to 40.0°T，the viable count was increased by 1.67 times.In the soybean yoghurt fermented by domesticated mixed strains（L.bulgaricusandS.thermophilusratio1∶1），the acidity increased from 42.5°T to 48.5°T，the viable count was increased by 1.85 times.The improving effect of five kinds of nutritional factors on acidity of soybean yoghurt in order was soy peptide，amino acid，carrot juice，fructooligosaccharide，tomato juice.

soybean；strains domestication；nutritional factors；acidity；total bacterial count

TS252.54

0254-5071（2016）02-0034-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.008

2015-11-27

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY12C20014）

高霄（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代食品加工。

蔣予箭（1963-），男，教授，本科，研究方向?yàn)楝F(xiàn)代食品加工。