周　莉，王　永，王法云，朱海華，張立攀（.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 45000；.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 45000）

食品中金黃色葡萄球菌概況及新型檢測技術(shù)研究進(jìn)展

周莉1，王永1，王法云2，朱海華2，張立攀1
（1.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450002；2.河南省食品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002）

金黃色葡萄球菌是食品中常見的食源性致病菌，是引起細(xì)菌性食物中毒最普遍的原因之一，感染后可引起人食物中毒、急性腸胃炎和動(dòng)物腹瀉等疾病，嚴(yán)重危害人類安全及健康。因此研究食品中金黃色葡萄球菌的特性及快速準(zhǔn)確的檢測方法、對(duì)及時(shí)有效控制病原菌傳播、預(yù)防食物中毒，減少食源性疾病事件的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

金黃色葡萄球菌；檢測方法；研究進(jìn)展

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）簡稱金葡菌，無芽胞和鞭毛，大多數(shù)無莢膜，是革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界中，是動(dòng)物和人類化膿性感染中最常見的病原菌［1］。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的機(jī)會(huì)很多。無論在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家，由金葡菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中均占有較大比例。金葡菌污染食品導(dǎo)致食物中毒已經(jīng)是個(gè)世界性衛(wèi)生問題。在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占到45%［2］，該菌主要存在于皮膚、黏膜，特別是鼻咽部，30%～80%的人群為該病原菌的攜帶者。食品中如果存在金黃色葡萄球菌，就可能產(chǎn)生腸毒素，食用該食品將引起食物中毒。因而，對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測有著重要意義。通過檢測食品中的金黃色葡萄球菌可以判定：①食物中毒的引發(fā)者；②引起葡萄球菌食物中毒的潛在來源是食品還是食品成分；③食品是否受到延遲加工或處理的污染。

目前，金黃色葡萄球菌的檢測方法包括傳統(tǒng)平板方法、顯色培養(yǎng)基法和快速測試片法。傳統(tǒng)平板法雖然成本較低，需要5～7 d才能出報(bào)告，耗時(shí)長，操作繁瑣。顯色培養(yǎng)基法雖然不需要增菌，但容易形成假陽性。快速測試片雖然經(jīng)濟(jì)快捷，但菌體含量較多時(shí)不易計(jì)數(shù)。

新型檢測技術(shù)包括以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、核酸探針技術(shù)、環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)以及以免疫學(xué)理論為基礎(chǔ)的免疫磁珠技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）技術(shù)。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)和以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法雖然靈敏性高，檢測所需時(shí)間短，但是檢測費(fèi)用較高，同時(shí)，某些檢測方法對(duì)試驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)人員的操作要求較高，不能得到普及。因此，研究食品中金黃色葡萄球菌的特性及快速準(zhǔn)確的檢測方法旨在探求一種適應(yīng)現(xiàn)代化品質(zhì)管理要求的快速檢測方法，為今后的食品快速檢測方法的研究及應(yīng)用積累經(jīng)驗(yàn)，為食源性疾病的預(yù)防和控制提供更為可靠的信息。

1　金葡菌概述

1.1金葡菌特性

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），是革蘭氏陽性菌的代表，對(duì)培養(yǎng)條件要求不高，普通培養(yǎng)基上就能生長。肉類、水產(chǎn)品、乳品等食品較易污染，耐鹽性較高。葡萄球菌是最常見的化膿性球菌，在特定的生長條件下，會(huì)合成金黃色葡萄球菌腸毒素。但在液體培養(yǎng)基的幼期培養(yǎng)中，常常分散，細(xì)菌細(xì)胞單獨(dú)存在。金黃色葡萄球菌可以分解乳糖、蔗糖、麥芽糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣?？僧a(chǎn)生溶血物質(zhì)，因此培養(yǎng)時(shí)在血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。產(chǎn)生的血漿凝固酶能使血漿產(chǎn)生凝固，這是金黃色葡萄球菌區(qū)別于其他葡萄球菌的主要特性。在非芽孢菌中，金黃色葡萄球菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力較強(qiáng)，80℃加熱30 min才能將其殺死。金黃色葡萄球菌因?yàn)槠浞置诘亩舅睾颓忠u性酶而引起食物中毒，如殺白細(xì)胞素、腸毒素、溶血毒素、血漿凝固酶和脫氧核糖核酸酶都是其分泌的毒素和侵襲性酶［3］。

1.2流行病學(xué)及污染來源

金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的致病菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染［4］。金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有如下特點(diǎn)：季節(jié)分布，多見于春夏季；引起金葡菌食物中毒食品種類主要以各類熟肉制品、乳及乳制品、蛋及蛋制品、各類熟肉制品為主，其次為含有乳制品的冷凍食品，也有個(gè)別的淀粉類食品引起的中毒事件也有報(bào)道［5］。

一般來說，金黃色葡萄球菌可通過以下途徑污染食品：食品加工人員、炊事員或銷售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；熟食制品包裝不密封，運(yùn)輸過程中受到污染；奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r(shí)，對(duì)肉體其他部位的污染。

金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。a.溶血毒素：按抗原性不同，至少有α、β、γ、δ、ε五種，對(duì)人類有致病作用的主要是α溶血素；b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)；d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌；e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C1、C2、C3、D、E及F 8種血清型。腸毒素可耐受100℃煮沸30min而不被破壞，它引起的食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉。

2　金葡菌國內(nèi)外新型檢測技術(shù)

2.1聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

田靜等［5］建立了PCR方法快速檢測牛奶、冰淇淋及肉中的金黃色葡萄球菌，在3種食品中的檢出限均為10CFU/g（mL），全部檢測可在24 h完成。趙芳等［6］對(duì)36株金黃色葡萄球菌的spa基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多態(tài)性分析。李秀娟等［7］利用PCR對(duì)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行特異性檢測，檢出的陽性率為37.5%。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

2010年，程曉艷等［8］建立了蝦白斑綜合癥病毒W(wǎng)SSV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-timefluorescentquantitative-PCR，RTFQ-PCR）檢測體系，特異性較強(qiáng)。蘇明權(quán)等［9］建立金黃色葡萄球菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR的快速檢測方法，結(jié)果表明具有較好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法符合率100%。RAJKOVIC A等［10］采用實(shí)時(shí)免疫定量PCR檢測金黃色葡萄球菌外毒素B，結(jié)果表明，該方法靈敏度較高（＜10 pg/mL）。

2.3核酸探針技術(shù)

高正琴等［11］利用金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因特異性核酸探針，對(duì)421份無特定病原體動(dòng)物（specific pathogen free，SPF）鼠樣品進(jìn)行了檢測，有11份樣品為陽性反應(yīng)結(jié)果，陽性率2.6%。并與核酸斑點(diǎn)雜交方法比對(duì)，符合率為100%。薛力剛等［12］建立快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的核酸探針檢測法，檢出純培養(yǎng)菌落最低限為106CFU/mL，檢測結(jié)果與國標(biāo)法一致。陳彬等［13］應(yīng)用Accuprobe基因探針方法快速檢測食品中金黃色葡萄球菌檢測低限為107CFU/mL，檢測金葡菌的結(jié)果與國標(biāo)法相一致。近年來，有學(xué)者研究檢測金黃色葡萄球菌的DNA探針（Gene-Trak），采用浸染棒比色法，敏感性較高，假陽性率為9.3%，人工感染樣品中沒有假陽性結(jié)果發(fā)生［14］。

2.4免疫磁珠技術(shù)

劉琳琳［15］制備金屬螯合免疫磁性微球，制得的磁性微球用于分離金黃色葡萄球菌A蛋白（staphylococalproteinA，SPA）蛋白、免疫印跡分析，并捕捉金黃色葡萄球菌及其靈敏度實(shí)驗(yàn)，SPA蛋白能夠成功地捕捉到金黃色葡萄球菌，檢測限達(dá)到100 CFU/mL。許會(huì)會(huì)［16］利用免疫磁珠，通過對(duì)感染不同濃度金葡菌的牛奶進(jìn)行檢測，確定了該方法的靈敏度為2.81×102CFU/mL。對(duì)200份奶樣進(jìn)行檢測，結(jié)果與傳統(tǒng)國標(biāo)法陽性率無顯著差異，并且穩(wěn)定、可靠，檢測限為5.0 CFU/mL。CHEN L L等［17］利用免疫磁珠對(duì)目標(biāo)菌行分離，在金黃色葡萄球菌濃度達(dá)到106CFU/mL能檢出。鄧奕等［18］對(duì)免疫磁球捕獲PCR（immunomagnetic separation-PCR，IMS-PCR）檢測牛奶中金黃色葡萄球菌進(jìn)行了研究，可檢測出104CFU/mL的金黃色葡萄球菌。

2.5酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

李紅云等［19］等采用生物素一鏈親素系統(tǒng)放大的雙抗夾心ELISA定量檢測血漿及組織中金黃色葡萄球菌腸毒素B，使敏感度顯著升高，可達(dá)0.078 μg/L。段鴻斌［20］通過制備抗金黃色葡萄球菌B型腸毒素（staphylococcal enterotoxin B，SEB）的特異性抗體，建立了牛奶中SEB污染的酶聯(lián)免疫吸附分析法且靈敏度較高。SCHOTTE U等［21］曾報(bào)道一種改良的ELISA方法-快速免疫色析手工操作法，能夠在15 min之內(nèi)檢測500 pg/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素。

2.6表面等離子共振技術(shù)

ZORDAN M D等［22］采用表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)，并結(jié)合熒光成像技術(shù)，通過混合型微流體芯片進(jìn)行多種致病菌的單細(xì)胞檢測。但本檢測技術(shù)靈敏性較差，且不能高通量。美國SUBRAMANIANA等［23］用表面等離子共振技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌，形成具有捕獲金黃色葡萄球菌能力的自組裝單層膜，能捕獲到金黃色葡萄球菌且最低檢出限為105CFU/mL。

2.7毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)

GAO P等［24］用特異性抗體化的乳膠，并結(jié)合毛細(xì)管區(qū)域電泳，從細(xì)菌混合物中快速分離、檢測金黃色葡萄球菌。最低檢出限為9.0×105CFU/mL。何玲等［25］利用多重PCR-毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的hly基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因、蠟樣芽孢桿菌16S-23SITS基因，所建立的方法可以同時(shí)快速檢測3種食源性致病菌并應(yīng)用食品樣品的檢測。

2.8環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

周義正等［26］采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)從陽性血培養(yǎng)瓶中快速檢測金黃色葡萄球菌，在293份陽性血培養(yǎng)瓶中檢測到22株金黃色葡萄球菌，與傳統(tǒng)方法比較，其檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度和特異度均達(dá)100%。李永剛等［27］利用LAMP技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌的femA基因，在金黃色葡萄球菌為8～9 CFU/mL時(shí)仍能檢出。

2.9焦磷酸測序

房保海等［28］采用焦磷酸測序法（pyrosequencing）對(duì)nuc基因的保守片斷進(jìn)行測序，分別對(duì)36株金黃色葡萄球菌和30株非金黃色葡萄球菌進(jìn)行了特異性和復(fù)現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，能快速（4 h以內(nèi)）可靠地鑒定鑒別金黃色葡萄球菌。趙新等［29］利用此法建立了4種食源性致病菌快速檢測方法靈敏度可達(dá)10 CFU/mL。

2.10新型檢測技術(shù)比較

表1　新型檢測技術(shù)比較Table 1 Comparison of novel detection technologies

由表1可知，新型檢測方法雖然省時(shí)省力，但成本較高，其中PCR技術(shù)為目前研究的最深入最成熟的檢測技術(shù)，該方法已經(jīng)有相應(yīng)的國標(biāo)，隨著各學(xué)科的飛速發(fā)展，各種多功能“自動(dòng)化試劑盒”微生物檢測系統(tǒng)的開發(fā)也將逐步產(chǎn)生，發(fā)展新的快速檢測與鑒定食源性致病菌的方法是及時(shí)有效地控制和預(yù)防致病菌傳播的前提。但是同時(shí)還需要從食品的生產(chǎn)和加工源頭上杜絕致病菌。

3　結(jié)論

作為食品微生物檢驗(yàn)中一項(xiàng)重要的目標(biāo)菌，金黃色葡萄球菌檢測技術(shù)的研究有著重要意義。提高靈敏度，簡化檢測程序、縮短時(shí)間，使食源性致病菌檢測技術(shù)向靈敏度高特異性強(qiáng)、自動(dòng)快速化、簡易經(jīng)濟(jì)等方向不斷發(fā)展。隨著社會(huì)發(fā)展與科技進(jìn)步，新的微生物檢驗(yàn)方法和手段不斷涌現(xiàn)，這些檢測方法能夠快速、可靠的檢測出食品中的金黃色葡萄球菌。因此研究靈敏快速的檢測和鑒定食品中金黃色葡萄球菌的方法對(duì)食品安全檢測技術(shù)的發(fā)展將有很大的推動(dòng)作用。

［1］李慧.金黃色葡萄球菌A型腸毒素單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2007.

［2］楊紅.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP技術(shù)快速檢測食品中金黃色葡萄球菌的研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2011.

［3］張超楠.食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法研究［D］.長春：吉林大學(xué)碩士論文，2012.

［4］楊國興.多重PCR檢測肉及肉制品中四種食源性致病菌的研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2008.

［5］田靜，計(jì)融，楊軍，等.PCR方法快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌［J］.衛(wèi)生研究，2007，36（2）：183-186.

［6］趙芳，洪小柳，萬志剛，等.進(jìn)出口食品中金黃色葡萄球菌spa基因的分型［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2014，5（11）：3462-3466.

［7］李秀娟，徐保紅，田會(huì)方，等.基于PCR的金葡菌準(zhǔn)確檢測方法的建立及應(yīng)用［J］.中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（5）：442-445.

［8］程曉艷，劉慶慧，黃倢.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測對(duì)蝦白斑綜合癥病毒方法的建立［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（26）：14265-14267.

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［16］許會(huì)會(huì).基于免疫磁珠與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的牛奶中金黃色葡萄球菌檢測方法的建立［D］.長春：吉林大學(xué)碩士論文，2011.

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［19］李紅云，姚詠明，施志國.雙單抗夾心ELISA方法檢測血漿及組織中金黃色葡萄球菌腸毒素B［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2002，12（9）：655-659.

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［30］魏玲，武會(huì)娟，李寶明，等.4種食源性致病菌污染情況及其新型檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2011，32（19）：302-306.

Recent advance of general situation and novel detection technologies of Staphylococcus aureus in food

ZHOU Li1，WANG Yong1，WANG Fayun2，ZHU Haihua2，ZHANG Lipan1
（1.Henan Business Research Institute Co.，Ltd.，Zhengzhou 450002，China；2.Food Quality and Safety Control Engineering Technology Research Center of Henan Province，Zhengzhou 450002，China）

Staphylococcus aureusis a common food-borne pathogenic bacterium in food，and it is one of the most common reasons for food poisoning. The infection can cause human food poisoning，acute gastroenteritis，animal diarrhea and so on，which are serious for people's safety and health. Therefore，to study the characteristics ofS.aureus，and to establish a rapid and efficient method forS.aureusdetection are meaningful for effectively controling pathogen transmission，preventing food poisoning，and reducing the occurrence of food borne disease events.

Staphylococcus aureus；detection methods；research progress

Q93

0254-5071（2016）02-0001-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.02.001

2015-06-03

河南省中國科學(xué)院科技成果轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2012114）

周莉（1984-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩芯俊?/p>