郭琳娜，王雁萍，湯明威，楊慧曉，趙珊珊，楊逢源

（鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450001）

科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

Lactobacillus plantarumA491的篩選及其在苜蓿青貯中的應(yīng)用研究

郭琳娜，王雁萍*，湯明威，楊慧曉，趙珊珊，楊逢源

（鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450001）

為篩選適合苜蓿青貯用乳酸菌，本研究對64株苜蓿附生乳酸菌進(jìn)行多糖利用能力的考察，結(jié)果顯示有5株乳酸菌能較好利用葡聚糖和木聚糖產(chǎn)酸，進(jìn)一步的抑菌活性試驗(yàn)篩選出對李斯特氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌都有較好抑菌活性的菌株A491。通過生理生化試驗(yàn)、16S rRNA基因序列分析及recA基因擴(kuò)增試驗(yàn)將篩選菌株A491鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。將菌株A491進(jìn)行苜蓿青貯應(yīng)用研究，青貯95 d后，與自然青貯和添加商業(yè)添加劑的處理組相比，添加菌株A491處理組的乳酸含量較高（P＜0.05），而pH較低（4.62）（P＜0.05），有害菌較少，發(fā)酵品質(zhì)較好。表明菌株A491在苜蓿青貯中具有潛在的應(yīng)用價值。

乳酸菌；葡聚糖；木聚糖；抑菌活性；苜蓿；青貯

［Abstract］To screen the lactic acid bacteria for alfalfa silage，64 strains of lactic acid bacteria were isolated from alfalfa and their ability of polysaccharide utilization were measured.The results showed that 5 strains could use glucan and xylan to produce acid，and their antimicrobial activity were measured.A491 was selected by its excellent antimicrobial activity of Listeriosis，Escherichia coli and Salmonella enterica.The physiological and biochemical identification，sequence analysis of 16S rRNA and recA gene amplification experiments indicated that A491 was Lactobacillus plantarum.A491 and commercial inoculants were selected on alfalfa silage as additives.After 95 days，the silages inoculated with strain A491 presented better fermentation quality，with higher contents of lactic acid（P＜0.05）and lower pH values（4.62）（P＜0.05），less harmful bacteria，compared with the control and the silages inoculated with commercial inoculants.A491 showed the potential application value in alfalfa silage.

［Key words］lactic acid bacteria；glucan；xylan；antimicrobial activity；alfalfa；silage

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種大面積種植的經(jīng)濟(jì)飼草，青貯處理可使其具有較高的營養(yǎng)價值。在青貯過程中，乳酸菌將可溶性糖轉(zhuǎn)化為乳酸，降低pH，抑制有害微生物生長（Pang等，2012）。然而，通常苜蓿自然附生的乳酸菌數(shù)量較少，可溶性糖含量低（3.07%～4.56%）（Jones等，1992），雖然胞壁結(jié)構(gòu)性糖（主要是葡聚糖及木聚糖成分）含量豐富，但不易被利用（單春喬等，2009）。傳統(tǒng)的青貯乳酸菌基本屬于利用可溶性糖的乳酸菌，因此，篩選出能夠分解利用植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性糖并具有較好抑菌活性的乳酸菌作為青貯添加劑，可以改善可溶性糖含量低、大量有害菌附生的發(fā)酵狀況，進(jìn)而提高苜蓿青貯的品質(zhì)，具有較高的實(shí)用價值。

苜蓿自然附生乳酸菌對其材料本身具有較好的生長適應(yīng)性。本試驗(yàn)旨在從苜蓿附生乳酸菌中篩選能利用葡聚糖和木聚糖產(chǎn)酸且抑菌效果較好的優(yōu)良菌株，研究其作為添加劑對苜蓿發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值的影響，為青貯應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株和苜蓿材料供試乳酸菌菌株共64株，分離自紫花苜蓿樣品，均為實(shí)驗(yàn)室保存；青貯苜蓿樣品：在河南鄭州收獲的品種為三得利的初花期苜蓿；混合多種乳酸菌，分離自亞芯苜蓿草專用青貯劑（購置于臺灣亞芯生物科技有限公司）。

1.1.2抑菌試驗(yàn)的指示菌株沙門氏菌（Salmonella enterica）、大腸桿菌（Escherichia coli）、李斯特氏菌（Listeriosis），均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3recA基因擴(kuò)增試驗(yàn)用到的標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus（L）.casei JCM 16167T、L.paraplantarum DSM 10667T、L.pentosus JCM 1558T、L.plantarum JCM 1149T、L.argentoratensis JCM 16169T。

1.1.4試劑及培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、CLO培養(yǎng)基、1%葡聚糖溶液 （Dextran MW：10000，BR 99%）、1%木聚糖溶液（Xylan MW：10000，BR 99%）、過氧化氫酶和API 50。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1利用多糖產(chǎn)酸乳酸菌的篩選將菌株分別接種于1%葡聚糖或1%木聚糖溶液中，30°C培養(yǎng)24 h，測定pH，不加菌的1%葡聚糖或1%木聚糖溶液作為對照組。

1.2.2抑菌活性的測定采用牛津杯雙層平板法進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌試驗(yàn)（石金舟，2005）。

1.2.3乳酸菌的鑒定根據(jù)乳酸菌生理生化特性、碳源發(fā)酵特性和16S rRNA的基因序列進(jìn)行初步鑒定（Pang等，2011），根據(jù)recA基因擴(kuò)增產(chǎn)物對乳桿菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定（Torriani等，2001）。

1.2.4苜蓿青貯飼料的制作收割后的初花期苜蓿材料在室溫晾曬至水分在60%左右，將切成2 cm左右長短的100 g苜蓿材料放入青貯袋中，每個青貯袋中加入100 μL乳酸菌菌液，混勻，抽真空后密封，室內(nèi)25°C放置。其中，不加菌的青貯飼料作為對照（Ni等，2015）。

1.2.5微生物分析將10 g飼料樣品加入到90 mL無菌蒸餾水中，振蕩混勻，10倍梯度稀釋，取10-1、10-3和10-5倍稀釋液各20 μL，分別涂布于各培養(yǎng)基。乳酸菌用MRS培養(yǎng)基計數(shù)，霉菌和酵母菌用PDA培養(yǎng)基計數(shù)，大腸桿菌用EMB培養(yǎng)基計數(shù)，好氧菌用NA培養(yǎng)基計數(shù)；取10-1和10-2倍稀釋液各1 mL，于75℃水浴鍋加熱15 min后，取20 μL涂布于CLO培養(yǎng)基，用于梭狀芽孢桿菌計數(shù)。MRS培養(yǎng)基和CLO培養(yǎng)基需放置于厭氧培養(yǎng)裝置，其他培養(yǎng)基放置于普通恒溫培養(yǎng)箱，30℃靜置培養(yǎng)48 h（Ni等，2015）。

1.2.6青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分分析用0.45 μm濾紙過濾10-1稀釋液，通過抽提發(fā)酵產(chǎn)物測定其pH值及有機(jī)酸成分并處理數(shù)據(jù)。將適量的青貯飼料樣品置于65℃烘箱48 h，烘干水分后粉碎，進(jìn)行中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗脂肪、粗灰分和粗蛋白質(zhì)的成分分析并處理數(shù)據(jù)（Ni等，2015）。

2　結(jié)果與分析

2.1利用多糖產(chǎn)酸乳酸菌的篩選從64株供試乳酸菌中篩選到5株菌在僅含1%葡聚糖或1%木聚糖的溶液中產(chǎn)酸較好，結(jié)果如表1所示。這5株菌在兩種溶液中均能產(chǎn)酸降低溶液的pH值。其中在葡聚糖溶液中產(chǎn)酸較好的菌株是A519和A528，在木聚糖溶液中產(chǎn)酸較好菌株的是A491和A500。

表1　乳酸菌在1%葡聚糖或1%木聚糖溶液中發(fā)酵24 h的pH

2.2乳酸菌的抑菌活性在指示菌相同濃度下，篩選的 5株菌中有 3株菌（A491、A502、A528）對李斯特氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制作用，其中對三種指示菌抑制作用最好的菌株是A491（圖1）。

圖1　乳酸菌的抑菌活性

2.3優(yōu)良菌株的菌種鑒定對菌株A491進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。結(jié)果表明，A491是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶反應(yīng)陰性的同型發(fā)酵桿菌；能夠在5～45℃溫度范圍生長，在50℃條件下生長微弱；能夠在NaCl濃度≤6.5%（m/V）的環(huán)境中生長；能夠在pH 3.0～9.0條件下生長。

碳源發(fā)酵結(jié)果表明，A491能夠利用的碳源較廣泛，能夠很好地利用L-阿拉伯糖、核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、α-甲基-D-甘露糖苷、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉靈、柳醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖等，微弱利用赤癬醇、D-阿拉伯糖、D-木糖、山梨糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、菊糖、松三糖、攏牛兒糖、葡萄糖酸鹽。

將菌株A491的16S rRNA（約1500 bp）基因序列在GeneBank中使用Blast程序進(jìn)行比對，結(jié)果表明，菌株A491與多株植物乳桿菌的16S rRNA基因序列相似性達(dá)99%以上。將其序列使用MEGA 5.02軟件，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。

圖2　菌株A491的16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

將菌株A491的rccA基因組擴(kuò)增產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)菌株比對，結(jié)果如圖3所示。菌株A491的擴(kuò)增條帶與標(biāo)準(zhǔn)菌株 Lactobacillus plantarum JCM 1149T一樣擴(kuò)增出318 bp的產(chǎn)物。所以將A491鑒定為Lactobacillus plantarum。

根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特性、碳源發(fā)酵特性、16S rRNA基因序列以及recA基因擴(kuò)增，將篩選的菌株A491鑒定為植物乳桿菌。

2.4苜蓿樣品營養(yǎng)成分及微生物含量分析苜蓿收割后立即進(jìn)行營養(yǎng)成分和微生物含量分析，苜蓿樣品的pH值為5.89，在室內(nèi)晾曬12 h后水分含量約為69.83%。粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、酸性洗滌纖維及中性洗滌纖維含量如表2所示。在該苜蓿樣品中乳酸菌、好氧菌、大腸桿菌、酵母菌含量較豐富，并含有一定量的霉菌。

圖3　菌株A491的recA基因擴(kuò)增產(chǎn)物

表2　青貯前苜蓿樣品的化學(xué)成分及微生物多樣性分析

2.5苜蓿青貯飼料青貯品質(zhì)分析以不加菌的自然青貯作為對照，各組青貯95 d時微生物含量如表3所示。三個處理中的酵母菌和梭狀芽孢桿菌數(shù)量均低于檢測線。除對照的自然青貯中檢測到霉菌，其他處理組中均未檢測到霉菌。與對照組和商業(yè)添加劑處理組相比，A491處理組中乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量較少，未檢測到好氧菌。

表3　青貯95 d各組微生物多樣性分析

青貯95d后各組發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分分析結(jié)果如表4所示。與對照組和商業(yè)添加劑處理組相比，A491處理組的pH值較低（P＜0.05），有機(jī)酸中乳酸含量較高（P＜0.05），乙酸含量差異不顯著（P＞0.05），未檢測到丙酸和丁酸；化學(xué)成分中粗脂肪含量較高（P＜0.05），DM、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量差異不顯著 （P＞0.05）。與對照組和A491處理組相比，商業(yè)添加劑處理組的粗灰分含量較高（P＜0.05）。

表4　青貯95 d各組發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分分析

3　討論

植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)性糖主要成分是纖維素和半纖維素，分別由葡聚糖和木聚糖組成。研究發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶更有利于乳酸菌發(fā)酵（李希茜等，2009），但使用纖維素酶的成本較高。由于生存適應(yīng)性，一些植物附生乳酸菌的糖代謝會發(fā)生相應(yīng)改變，也能分解葡聚糖和木聚糖等植物細(xì)胞壁多糖，有的還能夠利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生乳酸（Siezen等，2008）。因此，篩選能夠利用結(jié)構(gòu)性糖的乳酸菌具有可行性，其應(yīng)用于苜蓿青貯具有使用方便和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。

本研究通過比較發(fā)酵葡聚糖和木聚糖純?nèi)芤盒阅軐┰嚾樗峋M(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)乳酸菌利用葡聚糖和木聚糖產(chǎn)酸能力普遍較弱，但菌株間存在差異，從中篩選到對葡聚糖和木聚糖均有一定利用能力的菌株A491，該菌株發(fā)酵木聚糖純?nèi)芤盒阅茏詈?，這與其在碳源發(fā)酵試驗(yàn)中可利用的碳源較多，包括纖維二糖和D-木糖的結(jié)果相符。

新鮮苜蓿表面附著大量有害菌，尤其是大腸桿菌較多（McGarvey等，2013）。本研究考察了篩選菌株對革蘭氏陽性菌中的李斯特氏菌、革蘭氏陰性菌中的沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌效果。發(fā)現(xiàn)A491對三種指示菌的抑菌活性均最強(qiáng)，應(yīng)用在青貯飼料中有利于降低腐敗的風(fēng)險。

苜蓿青貯結(jié)果顯示，在青貯95 d時，A491處理組、商業(yè)添加劑處理組及自然青貯的對照組與青貯前的苜蓿樣品相比pH均有所降低。與對照組和商業(yè)添加劑處理組相比，A491處理組在青貯95 d時乳酸菌數(shù)量較低，可能與A491處理組在青貯15 d內(nèi)乳酸菌數(shù)量均較高，可利用碳源消耗較大，使得青貯后期用于乳酸菌生長的碳源不足，致使數(shù)量減少有關(guān)（數(shù)據(jù)未給出）。添加A491進(jìn)行苜蓿青貯，青貯飼料pH值較低，大腸桿菌數(shù)量較少，霉菌數(shù)量低于檢測線，能夠有效改善青貯品質(zhì)，這可能與菌株A491具有一定的結(jié)構(gòu)性糖利用能力以及較好的抑菌活性有關(guān)。本研究中，自然青貯95 d開封時也無酸臭氣味，腐敗不明顯，這與檢測到丁酸含量較低的結(jié)果相符，可能與苜蓿材料本身的品質(zhì)和袋裝青貯的厭氧條件控制較好有關(guān)。

4　結(jié)論

從64株苜蓿附生乳酸菌中篩選出能夠利用葡聚糖和木聚糖發(fā)酵產(chǎn)酸并具有較好抑菌活性的乳酸菌菌株A491，其在苜蓿青貯中應(yīng)用發(fā)酵品質(zhì)較好。試驗(yàn)結(jié)果對青貯用乳酸菌的開發(fā)具有一定的參考價值。

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S816.7

A

1004-3314（2016）11-0006-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161102

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項目（152102110045、152102310064）；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項目（162300410131）；鄭州大學(xué)研究生教學(xué)改革項目（YJSJY201407）；鄭州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（2015xjxm165）