葉妍琳，楊子江，楊　濤，張斌愷，付　偲，肖　嘯、2★（.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，云南昆明 65020；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院，云南昆明65003）

昆明動物園火烈鳥糞便細(xì)菌的分離、培養(yǎng)及鑒定

葉妍琳1，楊子江1，楊濤1，張斌愷1，付偲1，肖嘯1、2★
（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院，云南昆明650031）

昆明動物園火烈鳥出現(xiàn)腹瀉、急性死亡的情況，通過研究火烈鳥腸道微生物菌群，對腸道微生態(tài)健康及其調(diào)控作用進(jìn)行評價，從而了解火烈鳥糞便中的細(xì)菌種屬，此舉可有效防治火烈鳥的腸道疾病，加強(qiáng)對火烈鳥的保護(hù)，此次從昆明動物園火烈鳥館取樣火烈鳥糞腹瀉便，經(jīng)過細(xì)菌分離培養(yǎng)，染色鏡檢、生化試驗等，結(jié)果表明該糞便中分離得到細(xì)菌為屎腸球菌、藤黃微球菌、無乳鏈球菌；動物回歸試驗表明屎腸球菌、藤黃微球菌具有致病性。

火烈鳥；分離鑒定；屎腸球菌；藤黃微球菌；無乳鏈球菌

1　引言

隨著人們保護(hù)鳥類意識的增強(qiáng)，鳥與人類的親密度增加，鳥類攜帶病原對人體健康危害的潛在風(fēng)險逐漸增大，了解鳥類攜帶的細(xì)菌病毒，對有效控制鳥類疾病的發(fā)生與流行、防范鳥類疾病傳染給人具有指導(dǎo)作用?；鹆银B，又名紅鸛、紅鶴。為一種大型水鳥，主要分布于非洲、中南美洲，以及印度等部分亞熱帶地區(qū)［1］。

在2014年昆明動物園引進(jìn)了20只世界瀕臨滅絕的珍貴火烈鳥，屬于外來物種的火烈鳥，為了能夠更明確的了解火烈鳥的習(xí)性，其自身腸道所帶的細(xì)菌，是否影響當(dāng)?shù)氐奈锓N，是否有利于火烈鳥在昆明的生長繁殖，作為觀賞鳥類的火烈鳥，與人類密切接觸的鳥類，有必要對其體內(nèi)所帶細(xì)菌進(jìn)行研究，確保其對人體健康無任何危害。動物消化道是微生物賴以生存的理想場所，其內(nèi)定植生存的正常微生物菌群與其宿主在進(jìn)化過程中形成復(fù)雜而又穩(wěn)定的動態(tài)平衡的微生態(tài)區(qū)系［2］。分離和鑒定火烈鳥糞便細(xì)菌，能夠提供一定程度的健康及致病指標(biāo)，為下一步火烈鳥疾病防控奠定基礎(chǔ)。

屎腸球菌（Ent erococcusFaeci um）屬腸球菌屬，是人及動物腸道中正常菌群的一部分，腸球菌為圓形或橢圓形、呈鏈狀排列的革蘭陽性球菌，無芽胞，無鞭毛，為需氧或兼性厭氧菌［3］。用屎腸球菌JT1701與人體腸系有害菌（大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱擬桿菌）和人體腸系益生菌（嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌）分別及共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，腸球球菌對這些菌均有抑制作用。腸球菌感染是新生兒敗血癥的第3位病因，近幾年新生兒和兒童腸球菌敗血癥的發(fā)病率增加了6倍。據(jù)報道腸球菌是內(nèi)源性和外源性醫(yī)院感染的第二大病原菌，檢出率僅次于大腸桿菌。有資料統(tǒng)計，在引起尿路感染的致病菌中，腸球菌感染居第2位；腹腔、盆腔感染，腸球菌居第3位；敗血癥，腸球菌居第3位，病死率12.6%～57%［4］。

藤黃微球菌（M i crococcusl ut eus），為細(xì)菌微球菌科，微球菌屬，一般八個菌體聚在一起，似“疊羅漢”，亦稱為藤黃八疊球菌，也可單個、成雙、四聯(lián)排列或呈立體包裹狀不規(guī)則。菌落直徑一般為1.0～1.5微米，呈金黃色。在所有培養(yǎng)基上均呈堆團(tuán)排列。在肉湯瓊脂平板上的菌落呈黃色，粗糙粒狀，圓形，突起，濕潤，閃光，全緣。在血瓊脂平板上菌落小于葡萄球菌，呈圓形、凸起、光滑、不透明、黃色菌落。在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈黃色。菌體比葡萄糖大。藤黃微球菌分布于空氣、土壤、水以及動植物體表，一般不致病，但可為條件致病菌，引起傷口等局部組織感染，也能引起嚴(yán)重感染，如心內(nèi)膜炎等疾病?？勺骺股販y試菌［5］。

無乳鏈球菌（S.agal act i ae）也稱B族鏈球菌是乳腺炎的病原體，常存在于乳牛的皮膚、乳頭及乳房內(nèi)，通過擠乳人員的手或擠乳機(jī)械以及蠅類的機(jī)械攜帶而傳播。這種鏈球菌引起乳房炎后不產(chǎn)生明顯免疫力，目前尚無可靠的多價菌苗［6］。

本試驗通過對昆明動物園現(xiàn)有的火烈鳥的糞便進(jìn)行取樣觀察，通過試驗分離與鑒定，初步了解火烈鳥整個消化道微生物菌群的結(jié)構(gòu)，以及其與火烈鳥自身的健康關(guān)系。通過對糞便的細(xì)菌的鑒定，不但了解微生物菌群在動物體內(nèi)的分布結(jié)構(gòu)［7］，為火烈鳥能夠健康生長提供了基礎(chǔ)的知識，而且利用研究成果更好的隔離危害人類健康的病原。

2　材料與方法

2.1樣品來源本試驗所使用病料為云南昆明動物園送檢樣品（1份）；樣品包含火烈鳥的火烈鳥腸管、糞便。

2.2試驗培養(yǎng)基普通肉湯培養(yǎng)基、血清普通瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

2.3試劑蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、乳糖均購于杭州天和微生物試劑有限公司，雙蒸水。

2.4主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱、微量生化管、電子顯微鏡、超凈工作臺、立式壓力蒸汽滅菌器、血平板、冰箱、搖床

3　方法

3.1細(xì)菌的富集將受試糞便樣品分別編號，在超凈工作臺里進(jìn)行嚴(yán)格無菌操作，在無菌條件下，稱取單位糞便樣本，接種到已經(jīng)滅菌的普通肉湯培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)（37℃，20or/hl i n）24h。

3.2細(xì)菌的分離在超凈工作臺里進(jìn)行嚴(yán)格無菌操作，（實驗前照紫外）實驗前照紫外15m i n。用接種環(huán)將過夜培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)液在超凈工作臺上分別接種到血清普通瓊脂培養(yǎng)基上，并且標(biāo)明接種的編號。接種完成后將培養(yǎng)皿放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)18h-24h［8］。

3.3細(xì)菌的純化培養(yǎng)在超凈工作臺上挑取培養(yǎng)皿中形態(tài)規(guī)則，色澤鮮明，無污染的3個菌落分別在裝有肉湯的培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)18~ 24 h，之后分別取培養(yǎng)好的細(xì)菌分別接種在3個普通培養(yǎng)皿上，編號1、2、3。把余下的純化菌液分別裝于3只高壓滅菌的試管中，放進(jìn)搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，條件是37℃，200r/m i n，培養(yǎng)24h。

3.4細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察取在瓊脂平板上培養(yǎng)24h的新鮮菌落，進(jìn)行形態(tài)觀察和革蘭氏染色鏡檢，將分離到的細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，通過革蘭氏染色后鏡檢觀察細(xì)菌的形態(tài)。

3.5生化試驗取純培養(yǎng)物3～4個菌落接種到3mL營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18～24h。按姚火春（2002）介紹的方法進(jìn)行生化試驗，取10μL培養(yǎng)物接種腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管，37℃培養(yǎng)，2～3d內(nèi)讀取結(jié)果，根據(jù)伯杰氏（Bergey's）細(xì)菌鑒定手冊作出鑒定（H ol t等，1984）。

3.6動物回歸試驗

3.6.1試驗動物攻毒按麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲瞥?×109 CFU/m L菌懸液。用擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液進(jìn)行小白鼠腹腔注射，選取健康小白鼠40只，分成4組，每組10只，分別腹腔注射以下菌液（注射單位：菌懸液0.2m L/10g），第4組作為對照組（注射單位：0.2m L/l Og滅菌生理鹽水）。攻毒時注意腹腔注射盡量避免把菌液注射到皮下，影響小白鼠發(fā)病以及死亡時間，做好染色標(biāo)記。具體見下表。

菌液　組別　1組　2組　3組　4組屎腸球菌　0.2m l/只藤黃微球菌　0.2 m l/只無乳鏈球菌　0.2 m l/只滅菌生理鹽水　0.2 m l/只

3.6.2試驗動物剖檢及細(xì)菌分離觀察小白鼠攻毒后的精神狀態(tài)和死亡時間，待試驗動物死亡后，采用常規(guī)剖檢方法，觀察各個內(nèi)臟器官的病理變化，取糞便以備細(xì)菌分離所用，剖檢結(jié)束后進(jìn)行細(xì)菌的分離，以上步驟均要求無菌。

3.6.3致病菌的鑒定從死亡的小白鼠肝臟分離的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，對比原始病料中分離的細(xì)菌，最終確定是否為主要致病菌。

4　結(jié)果與分析

通過對受檢糞便樣品的細(xì)菌的培養(yǎng)、分離、染色鏡檢、生化鑒定、動物回歸試驗，最后確定在昆明動物園飼養(yǎng)的火烈鳥糞便中分離培養(yǎng)得到的細(xì)菌為屎腸球菌、藤黃微球菌、無乳鏈球菌。

4.1顯微鏡觀察形態(tài)及染色

4.1.1屎腸球菌在顯微鏡觀察到的結(jié)果革蘭氏陽性菌，為圓形或橢圓形、呈鏈狀排列的球菌，無芽胞，無鞭毛。

4.1.2藤黃微球菌在顯微鏡下觀察到的結(jié)果。革蘭氏陽性菌，八個菌體聚在一起，或者單個、成雙、四聯(lián)排列或呈立體包裹狀不規(guī)則，菌落直徑一般為1.0～1.5微米。

圖1　顯微鏡下觀察到的菌落

圖2　顯微鏡下觀察到的菌落Fi gure2 Col onywasobserved undert hem i croscope

4.1.3無乳鏈球菌在顯微鏡下觀察到的結(jié)果

革蘭氏陽性球菌，單個、成雙、鏈狀排列、長短不一。

圖3　顯微鏡下觀察到的菌落Fi gure3 Col onywasobserved undert hem i croscope

4.2生化鑒定結(jié)果

4.2.11號管生化試驗結(jié)果

注：“+”為陽性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)Not e："+"ast heposi t i vereact i on，"-"ast henegat i vereact i on

理化特性參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］，與判斷標(biāo)準(zhǔn)比較后，分離培養(yǎng)到的1號菌株與屎腸球菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)符合，說明1號菌為屎腸球菌。

4.2.22號管生化試驗結(jié)果

注：“+”為陽性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)Not e："+"ast heposi t i vereact i on，"-"ast henegat i vereact i on

理化特性參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］，與判斷標(biāo)準(zhǔn)比較后，分離培養(yǎng)到的2號菌株與藤黃微球菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)符合，說明2號菌為藤黃微球菌。

4.2.33號管生化試驗結(jié)果

注：“+”表示90%以上為陽性，“V”表示陰性，“-”表示0-9%為陽性。Not e："+"saysm ore t han 90%posi t i ve，"V"sai d negat i ve"-" sai d 0-9%i sposi t i ve理化特性參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］，與判斷標(biāo)準(zhǔn)比較后，分離培養(yǎng)到的3號菌株與無乳鏈球菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)符合，說明3號菌為無乳鏈球菌。

4.3動物回歸試驗結(jié)果

4.3.1試驗動物攻毒將細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)物對小白鼠進(jìn)行腹腔注射后，小白鼠反應(yīng)情況，具體結(jié)果見下表。

試驗動物　攻毒劑量（m l）　對照組（m l）屎腸球菌　藤黃微球菌　無乳鏈球菌　滅菌生理鹽水0.2　0.2　0.2　0.2試驗小鼠（只）　10　10　10　10死亡小鼠（只）8　9　0　0

4.3.2試驗動物病理剖檢及致病菌鑒定通過對死亡小白鼠進(jìn)行病理剖檢發(fā)現(xiàn)，注射屎腸球菌菌液的小白鼠，肉眼觀察到脾腫體積增大，腸壁有大量出血點；注射藤黃微球菌菌液的小白鼠，肝臟腫大壞死，心外膜存在大量出血點；注射無乳鏈球菌菌液的小白鼠不死亡，剖檢無任何變化；對照組不死亡。分別取4組小白鼠的糞便進(jìn)行細(xì)菌分離，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色再鏡檢，再次進(jìn)行生化試驗，注射屎腸球菌菌液的小白鼠均檢測到了屎腸球菌；注射藤黃微球菌菌液的小白鼠均檢測到了藤黃微球菌；注射無乳鏈球菌菌液的小白鼠均檢測到無乳鏈球菌，因此判斷屎腸球菌和藤黃微球菌為該病的主要致病菌。

5　討論

此次從患病火烈鳥糞便內(nèi)檢測到屎腸球菌、藤黃微球菌和無乳鏈球菌，與同為禽類的觀賞鳥類---孔雀作比較，結(jié)果有所不同，在孔雀發(fā)生腹瀉、急性死亡情況下多數(shù)檢測到大腸桿菌，或者是新城疫與大腸桿菌的混合感染［10］，而火烈鳥糞便中卻沒有檢到大腸桿菌。本研究通過對昆明動物園火烈鳥糞便的細(xì)菌檢測，最終在此火烈鳥糞便檢測到三種細(xì)菌。未見其他細(xì)菌，可能和平時養(yǎng)殖過程中使用的抗菌素等藥物有一定關(guān)系。

6　結(jié)論

火列鳥腹瀉糞便中分離得到屎腸球菌、藤黃微球菌、無乳鏈球菌；其中屎腸球菌、藤黃微球菌具有致病性。

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1003-8655（2016）03-0089-03