徐理華，李 璽，譚 獲廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，廣東 廣州 5030；中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲乳外科，廣東 廣州 50630

基礎(chǔ)研究

PRDM1基因?qū)Ψ腔羝娼鹆馨土黾?xì)胞增殖能力的影響

徐理華1，李 璽2，譚 獲1
1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510230；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲乳外科，廣東 廣州 510630

目的 觀察PRDM1對(duì)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4增殖能力的影響。方法 通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法在低表達(dá)PRDM1的SUDHL-4細(xì)胞中過表達(dá)PRDM1基因，通過MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析檢測(cè)SUDHL-4生物學(xué)行為的變化。結(jié)果過表達(dá)PRDM1的SUDHL-4細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯下降，細(xì)胞G0/G1比例、S期比例下降；G2/M期比例升高，細(xì)胞阻滯于G2/M期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 PRDM1基因表達(dá)缺失可能在非霍奇金淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可能成為判斷非霍奇金淋巴瘤預(yù)后的分子標(biāo)志物及臨床治療的靶點(diǎn)。

非霍奇金淋巴瘤；PRDM1；SUDHL-4細(xì)胞

淋巴瘤是最常見的淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)，多發(fā)生于淋巴結(jié)和（或）結(jié)外淋巴組織，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。世界衛(wèi)生組織將淋巴瘤分為兩類，霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL），其中HL僅占10.9%，NHL占89.1%。

NHL起源于B細(xì)胞和T細(xì)胞/NK（自然殺傷）細(xì)胞，是一組異質(zhì)性極高的疾病，在病理、病程、治療反應(yīng)等方面均存在極大差異。根據(jù)不同的細(xì)胞形態(tài)、免疫標(biāo)記、遺傳學(xué)指標(biāo)等可進(jìn)一步分為70多種不同的亞型。近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到惡性淋巴瘤是一個(gè)涉及多重基因事件的復(fù)雜過程。研究人員致力于探尋非霍奇金淋巴瘤發(fā)生的分子機(jī)制，進(jìn)而為早期診斷及制定特定的靶向治療方案提供理論依據(jù)。

1991年，Keller等［2］發(fā)現(xiàn)一種β干擾素分泌抑制因子，將其命名為PRDM1。PRDM1是一種轉(zhuǎn)錄抑制子，對(duì)哺乳動(dòng)物的組織發(fā)育和分化起著關(guān)鍵的作用。其在成熟B細(xì)胞的終末分化中的作用已得到廣泛共識(shí)。目前有關(guān)microRNA對(duì)PRDM1的調(diào)控的研究已漸漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。PRDM1在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的腫瘤抑制作用已有很多報(bào)道。Mandelbaum等［3］在約53%的DLBCL中發(fā)現(xiàn)了組成型活化BCL-6所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，從而證實(shí)了PRDM1的抑癌作用。PRDM1的失活阻斷了細(xì)胞的終末分化，而促使DLBCL的發(fā)生。

PRDM1基因突變及其表達(dá)對(duì)于各種類型淋巴瘤的發(fā)生和預(yù)后都有著重要意義。但關(guān)于PRDM1對(duì)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞行為的影響，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。本研究通過在非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4中過表達(dá)PRDM1基因的方法來觀察該基因?qū)ζ湓鲋衬芰Φ挠绊?，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SUDHL-4細(xì)胞株購(gòu)買于ATCC（美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco；pcDNA3.1（+）-PRDM1表達(dá)載體由上海吉?jiǎng)P基因科技公司構(gòu)建；鼠抗人PRDM1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz。兔抗人多克隆抗β-肌動(dòng)蛋白 抗體用作內(nèi)參，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technolog，羊抗兔和兔抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清、100 U/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶常規(guī)消化和傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且細(xì)胞活力良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，加入pcDNA3.1（+）-PRDM1載體的為SUDHL-4-PRDM1組，加入空白質(zhì)粒的為SUDHL-4-vector組，不做處理的為空白對(duì)照組。

1.2.2電穿孔法轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染當(dāng)天配制電穿孔緩沖液［3］，置于冰箱預(yù)冷。每個(gè)樣本取2×107細(xì)胞，加40 μg載體。電穿孔條件：電壓160 mV，電阻∞；電容：950 uF，電擊1次。電穿孔后，加DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，24～48 h后加入puromycin 2 μg/mL進(jìn)行篩選；每周換液3次，培養(yǎng)4周。將篩選出的細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)在含1.0 μg/mL puromycin、30%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。用于蛋白質(zhì)提取、檢測(cè)細(xì)胞活性和細(xì)胞周期等。

1.2.3Western-blotting法檢測(cè)PRDM1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對(duì)照組SUDHL-4細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后，4℃下靜置1 h低溫高速離心（4℃，12 000 r/min，30 min），提取上清即為總蛋白。經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，抗β-actin（1∶500）和抗PRDM1（1∶50）4℃下孵育過夜；二抗室溫下孵育2 h，ECL顯色，經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測(cè)細(xì)胞活性分別將5×103個(gè)/孔SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對(duì)照組SUDHL-4細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)，分別于第1～7天加入5 mg/mL的甲基噻唑基四唑（MTT法）工作液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液，于微量震蕩器震蕩15 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm的吸光度值，試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)觀察點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔，取均值進(jìn)行計(jì)算。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A490值為縱坐標(biāo)作圖，觀察細(xì)胞的增殖情況。

1.2.5細(xì)胞周期測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對(duì)照組SUDHL-4細(xì)胞，離心去上清，用冷PBS（4℃）洗滌細(xì)胞后，800 r/min離心5 min，共洗滌2次。用含有10%胎牛血清的PBS溶液300 μL重懸3組細(xì)胞，加入700 μL無(wú)水乙醇固定30 min。冷PBS（4℃）洗滌后，300 r/min離心5 min后，加入5 μg/L碘化丙啶染色20～30 min。室溫下避光放置15 min待測(cè)。記錄細(xì)胞周期的分布并計(jì)算細(xì)胞凋亡比率。全部數(shù)據(jù)經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CELLQuest軟件獲取。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組建比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4中PRDM1蛋白表達(dá)情況

以β-actin為對(duì)照，非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-PRDM1、pcDNA3.1（+）及不做處理后PRDM1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.76±0.04，0.46± 0.01，0.38±0.02。與空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-PRDM1后非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4中PRDM1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯上升（t= 4.365，P＜0.05；t=4.319，P＜0.05，圖1）。

2.2MTT檢測(cè)結(jié)果

通過MTT法繪制SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對(duì)照組SUDHL-4細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線以研究PRDM1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。與空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染PRDM1的SUDHL-4細(xì)胞其生長(zhǎng)速度明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.3細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果

SUDHL-4-PRDM1、SUDHL-4-vector，及空白對(duì)照組SUDHL-4細(xì)胞的G0/G1比例、S期比例，G2/M期比例見表1，SUDHL-4-PRDM1組的G0/G1比例、S期比例，低于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組；G2/M期比例高于空質(zhì)粒組及空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

3　討論

1991年，Keller等［2］發(fā)現(xiàn)一種β干擾素分泌抑制因子，該蛋白可特異性結(jié)合β干擾素基因的啟動(dòng)子陽(yáng)性調(diào)控區(qū)I，遂將其命名為PRDM1。Turner等［5］發(fā)現(xiàn)IL-2和IL-5可以誘導(dǎo)小鼠淋巴瘤細(xì)胞株BCL-1中Blimp1表達(dá)，而過表達(dá)Blimp1可促使B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化。后續(xù)的研究顯示，小鼠的Blimp1蛋白與人類的PRDM1蛋白具有高度同源性［4］。

人PRDM1基因定位于染色體6q21-22.1，而該區(qū)域在多種惡性腫瘤中均存在缺失突變，故此推測(cè)PRDM1基因是抑癌基因［6］。PRDM1基因有2種轉(zhuǎn)錄本：PRDM1α和PRDM1β。PRDM1α由PRDM1基因的正常啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼，含789個(gè)氨基酸，由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即氨基端酸性區(qū)、PR結(jié)構(gòu)域、脯氨酸富集區(qū)、5個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和羧基端酸性區(qū)［7］。PRDM1β缺失了1～3號(hào)外顯子，由4號(hào)外顯子上游的新啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼，含687個(gè)氨基酸。由于PRDM1β的功能缺陷，喪失了對(duì)多個(gè)靶基因的調(diào)控作用［8］，因此可能具有與PRDM1α相反的功能。而傳統(tǒng)意義上PRDM1蛋白指的是PRDM1α。

表1　細(xì)胞周期分析結(jié)果（%）

PRDM1對(duì)哺乳動(dòng)物的組織發(fā)育和分化起著關(guān)鍵的作用。在小鼠的胚胎發(fā)育過程中，多種組織中都可以檢測(cè)到Blimp1蛋白表達(dá)，如胎盤、心臟、前肢和感覺器官和等。但在Blimp1基因敲除小鼠的胚胎中，妊娠10.5 d后胚胎即死亡，且胎盤、支氣管不能正常發(fā)育，血管結(jié)構(gòu)也不完整［9］。PRDM1在B細(xì)胞終末分化中所發(fā)揮的重要作用已經(jīng)被多個(gè)研究證實(shí)。已知有4種轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因與B細(xì)胞分化密切相關(guān)，分別是PRDM1、BCL-6、PAX5和XBP-1。在成熟B細(xì)胞階段，PRDM1表達(dá)被BCL-6抑制；到生發(fā)中心后期，BCL-6的表達(dá)下調(diào)，而PRDM1表達(dá)增強(qiáng)，并可通過抑制PAX5，誘導(dǎo)XBP-1表達(dá)，以促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化［10-11］。目前關(guān)于microRNA對(duì)PRDM1的調(diào)控的研究已漸漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

PRDM1在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的腫瘤抑制作用已有很多報(bào)道，近年來的多個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該理論提供了新的依據(jù)。Tam等［12］對(duì)DLBCL細(xì)胞系進(jìn)行了PRDM1基因的分析，發(fā)現(xiàn)了一些集中于第2外顯子/第2內(nèi)含子處剪接供體位點(diǎn)的點(diǎn)突變，從而導(dǎo)致剪接錯(cuò)誤，致使野生型PRDM1α和PRDM1β均表達(dá)缺失。Mandelbaum等［3］發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致PRDM1基因失活的機(jī)制包括了純合子缺失、截短或錯(cuò)義突變，并且在約53%的DLBCL中發(fā)現(xiàn)了組成型活化BCL-6所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，從而證實(shí)了PRDM1的抑癌作用。PRDM1的失活阻斷了細(xì)胞的終末分化，而促使DLBCL的發(fā)生。但關(guān)于PRDM1對(duì)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞行為的影響，國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。

為了研究PRDM1基因在非霍奇金淋巴瘤中的作用，我們采用在非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞SUDHL-4中過表達(dá)PRDM1基因的方法來觀察該基因?qū)ζ湓鲋衬芰凹?xì)胞周期的影響，研究結(jié)果顯示，SUDHL-4細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRDM1后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較空載體組及空白對(duì)照組明顯下降，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染PRDM1的SUDHL-4細(xì)胞G0/G1比例、S期比例，低于空載體組；G2/M期比例高于空載體組，細(xì)胞阻滯于G2/M期，由此推測(cè)PRDM1基因過表達(dá)引起SUDHL-4細(xì)胞細(xì)胞周期分布改變可能是影響細(xì)胞增殖及凋亡的重要原因之一，與Tam及Mandelbaum報(bào)道的PRDM1在DLBCL中表達(dá)缺失及PRDM1可發(fā)揮抑癌作用相一致，并進(jìn)一步闡明了其發(fā)揮抑癌作用的可能機(jī)制，對(duì)明確非霍奇金淋巴瘤的生物學(xué)行為具有重要意義，有助于了解非霍奇金淋巴瘤的生物學(xué)特性，預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，為針對(duì)PRDM1的靶向治療提供理論依據(jù)。

針對(duì)PRDM1表達(dá)缺失引起的非霍奇金淋巴瘤發(fā)生發(fā)展而設(shè)計(jì)的特異靶向藥物具有重要的治療價(jià)值，不僅有助于非霍奇金淋巴瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，且也為腫瘤的治療提供了有希望的靶點(diǎn)。但其調(diào)控細(xì)胞增殖能力的確切機(jī)制和路徑仍有待于進(jìn)一步研究。

［1］Grund EM，Muise-Helmericks RC.Cost efficient and effective gene transfer into the human natural killer cell line，NK92［J］.J Immunol Methods，2005，296（1/2）:31-6.

［2］Keller AD，Maniatis T.Identification and characterization of a novel repressor of beta-interferon gene expression［J］.Genes Dev，1991，5（5）:868-79.

［3］Mandelbaum J，Bhagat G，Tang HY，et al.Blimp1 is a tumor suppressor gene frequently disrupted in activated B cell-like diffuse large B cell lymphoma［J］.Cancer Cell，2010，18（6）:568-79.

［4］Grund EM，Muise-Helmericks RC.Cost efficient and effective gene transfer into the human natural killer cell line，NK92［J］.J Immunol Methods，2005，296（1/2）:31-6.

［5］Turner CJ，Mack DH，Davis MM.Blimp-1，a novel Zinc fingercontaining protein that can drive the maturation of B lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells［J］.Cell，1994，77（2）:297-306.

［6］HuangS.Blimp-1isthemurinehomologofthehuman transcriptional repressor PRDI-BF1［J］.Cell，1994，78（1）:9-13.

［7］Mock BA，Liu L，Lepaslier D，et al.The B-lymphocyte maturation promoting transcription factor Blimp1/PRDI-BF1maps to D6S447 on human chromosome 6q21-q22.1 and the syntenic region of mouse chromosome 10［J］.Genomics，1996，37（1）:24-8.

［8］Gyory I，Wu J，F(xiàn)ejer G，et al.PRDI-BF1 recruits the histone H3 methyltransferase G9a in transcriptional silencing［J］.Nat Immunol，2004，5（3）:299-308.

［9］Gyory I，F(xiàn)ejer G，Ghosh N，et al.Identification of a functionally impaired positive regulatory domain I binding factor 1 transcription repressor in myeloma cell lines［J］.J Immunol，2003，170（6）: 3125-33.

［10］Lin J，Lwin T，Zhao JJ，et al.Follicular dendritic cellinduced microRNA-mediated upregulation of PRDM1 and downregulation of BCL-6 in non-Hodgkin's B-cell lymphomas［J］.Leukemia，2011，25（1）:145-52.

［11］Calame K.Activation-dependent induction of Blimp-1［J］.Curr Opin Immunol，2008，20（3）:259-64.

［12］Tam W，Gomez M，Chadburn A，et al.Mutational analysis of PRDM1 indicates a tumor-suppressor role in diffuse large B-cell lymphomas［J］.Blood，2006，107（10）:4090-100.

Effects of PRDM1gene expression on the reproductive ability of non-Hodgkin lymphoma cells

XU Lihua1，LI Xi2，TAN Huo1
1Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510230，China；2Department of thyroid surgery，the Third Affiliated Hospital of Zhongshan University，Guangzhou 510630，China

Objective To explore the effects of PRDM1gene expression on the reproductive ability of Non-Hodgkin Lymphoma cells SUDHL-4.Methods Non-Hodgkin Lymphoma cells SUDHL-4 was chosed to show the biology behavior changes after overexpressing PRDM1 gene，through the MTT test，and cell cycle analysis.Results After overexpressing PRDM1 gene，the proliferation of SUDHL-4 cell were significantly decreased，and cell cycle arrested at G2/M（P＜0.05）.Conclusion The loss of PRDM1 gene may be related to the occurrence and development of lymphoma，and it may become the molecular diagnostics and new therapy target of lymphoma.

non-Hodgkin lymphoma；PRDM1；SUDHL-4 cell

2016-04-15

徐理華，博士，E-mail:xlhua325@126.com

譚 獲，E-mail:xlhua325@126.com