羅育其，于海濤，區(qū)文弢，董 棟，吳承堂廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 5457；南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 5055

基礎(chǔ)研究

5-FU致小鼠腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷時β-catenin的表達(dá)及其意義

羅育其1，于海濤1，區(qū)文弢1，董 棟1，吳承堂2
1廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 511457；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院普通外科，廣東 廣州 510515

目的 探討與腸上皮干細(xì)胞增殖關(guān)系密切β-catenin蛋白在5-FU致小鼠腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷時的表達(dá)及其意義。方法 取成年C57/BL小鼠70只，采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠隨機(jī)分為對照組（30只）和實驗組（40只）。實驗組予腹腔注射大劑量5-FU［150 mg/（kg·d）×5 d］，分別于注射后1、3、5 d每天剖殺10只小鼠，取所有小鼠中段小腸組織固定，進(jìn)行常規(guī)病理組織學(xué)檢查及免疫化檢查腸黏膜中β-catenin蛋白表達(dá)情況；對照組腹腔注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射5 d，處理方法和檢測指標(biāo)與實驗組相同。結(jié)果 大劑量5-FU作用后，小鼠腸組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，黏膜炎癥、水腫，腸絨毛脫落及腸隱窩消失，隨著時間推移，腸黏膜有少量修復(fù)；與對照組比較，實驗組腸組織β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著增加，隨著時間推移，β-catenin蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞比例逐漸下降。結(jié)論 腸黏膜受到損傷后，β-catenin表達(dá)增加，促進(jìn)腸上皮干細(xì)胞增殖，完成對腸黏膜的損傷修復(fù)。

β-catenin；5-FU；腸上皮干細(xì)胞；腸黏膜

腸黏膜由吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、番氏細(xì)胞及內(nèi)分泌等細(xì)胞組成，發(fā)揮著營養(yǎng)吸收、腸屏障及免疫等功能作用。腸黏膜細(xì)胞更新速度迅速，每3～4 d即可完成細(xì)胞的更新，位于腸隱窩底部的腸上皮干細(xì)胞是腸黏膜不斷更新的原動力，腸黏膜的各種功能細(xì)胞都是由腸上皮干細(xì)胞分裂、分化而來［1］。5-FU是一種細(xì)胞周期依賴化療藥物，主要作用于分裂期細(xì)胞。腸黏膜細(xì)胞作為快速更新細(xì)胞，處于分裂期細(xì)胞比例較大，亦為5-FU作用的靶細(xì)胞。前期實驗已證實，腸上皮干細(xì)胞作為相對靜止期細(xì)胞，5-FU對其損傷作用不明顯，因此亦是腸黏膜損傷修復(fù)的原動力［2］。β-catenin是Wnt通路的核心蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、分化過程中起著重要作用［3］。因此，本研究將制備大劑量5-FU對腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷模型，探討此時β-catenin的表達(dá)變化及其意義。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

成年C57/BL小鼠70只，購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，雌雄不拘，體質(zhì)量24±3 g，采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠隨機(jī)分為實驗組（40只）和對照組（30只），實驗組予腹腔注射大劑量5-FU［150 mg/（kg.d）］，連續(xù)注射5 d，對照組予腹腔注射等體積的生理鹽水。兩組小鼠均在注射結(jié)束后第1、3、5天處死取材，每天處死10只。剩余10只小鼠為備用，補(bǔ)充實驗過程中的死亡小鼠，最終使各個時間點剖殺的小鼠數(shù)量均為10只。

1.2取材及標(biāo)本處里

對照組小鼠于第5天注射結(jié)束后剖殺，取出中段小腸組織，長約2 cm，清洗腸腔后4%多聚甲醛固定；實驗組在上述時間點剖殺處死小鼠，同樣取出中段小腸組織，長約2 cm，清洗腸腔后4%多聚甲醛固定。所有標(biāo)本固定后將用于常規(guī)HE染色和免疫組化檢測。

1.3免疫組化檢測腸黏膜β-catenin蛋白表達(dá)情況

切片常規(guī)脫蠟入水后，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。每張切片加50：l過氧化物阻斷溶液，竄溫孵育10 min，PBS沖洗3次，微波抗原修復(fù)30 min，加BSA封閉液，室溫孵育l0 min；加入一抗兔抗大鼠β-catenin抗體，4℃過夜，PBS洗滌3次后，加入而二抗生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，4℃過夜，PBS洗滌3次后，ABC法染色。結(jié)果判定，細(xì)胞漿著色判定為β-catenin陽性細(xì)胞，在400倍視野下，每張切片隨機(jī)挑選5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，β-catenin陽性細(xì)胞比例=β-catenin陽性細(xì)胞/鏡下細(xì)胞總數(shù)。

1.4統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠一般狀況

對照組小鼠狀態(tài)良好，實驗過程中無死亡。實驗組小鼠一般狀況較差，表現(xiàn)為進(jìn)食量及活動量減少、出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉及體質(zhì)量下降；實驗過程中，注射結(jié)束后第1天有1只小鼠死亡，第3天有3只小鼠死亡，第5天有3只死亡，所有死亡的小鼠由后備小鼠補(bǔ)充，使各時間點剖殺小鼠數(shù)量均為10只。

2.2病理組織改變

對照組小鼠腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸黏膜絨毛排列整齊、規(guī)律，腸隱窩深淺均勻。而實驗組腸組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，肉眼可見腸壁變薄，腸腔積液；鏡下觀察可見注射大劑量5-FU后小鼠腸組織肌層萎縮，腸絨毛、隱窩結(jié)構(gòu)消失，腸腔覆蓋一層單層上皮細(xì)胞。處理后第3天小鼠腸上皮開始修復(fù)，隱窩結(jié)構(gòu)開始形成，絨毛結(jié)構(gòu)仍未形成。處理后第5天小鼠腸黏膜進(jìn)一步修復(fù)，可見短而粗的腸絨毛形成（圖1）。

2.3β-catenin蛋白表達(dá)情況

對照組β-catenin蛋白主要表達(dá)于腸隱窩中上2/3位置，腸絨毛部分幾乎不表達(dá)β-catenin蛋白；受到大劑量5-FU作用后，B組小鼠腸腔中的單層上皮細(xì)胞幾乎都表達(dá)β-catenin蛋白，隨著損傷修復(fù)的進(jìn)行，β-catenin蛋白逐漸往隱窩方向集中（圖2）。與對照組比較，各組小鼠腸黏膜細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)陽性率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，表1）。

3　討論

腸黏膜保持旺盛的自我更新能力，有研究表明，每3～4 d全部腸黏膜功能細(xì)胞完成一次更新，位于腸隱窩底部的腸上皮干細(xì)胞是腸黏膜自我更新的原動力，腸上皮干細(xì)胞通過不對稱分裂產(chǎn)生一個腸上皮干細(xì)胞及過度細(xì)胞（TA），TA不斷分裂、分化，最終產(chǎn)生各種功能細(xì)胞，位于腸絨毛的各種功能細(xì)胞不斷凋亡、脫離，新生細(xì)胞不斷從腸隱窩往腸絨毛方向?qū)⒚撾x細(xì)胞替代［4］。5-FU即氟尿嘧啶，是一種細(xì)胞周期依賴化療藥物，主要作用于快速分裂期細(xì)胞，為結(jié)腸癌化療首選藥物之一，而化療過程中，患者常出現(xiàn)腹瀉，嚴(yán)重者可發(fā)生偽膜性腸炎，表明5-FU對腸黏膜損傷作用明顯。前期實驗表明，腸隱窩中上2/3位置細(xì)胞表達(dá)豐富的PCNA，而“干細(xì)胞區(qū)”的PCNA表達(dá)較弱，表明腸黏膜中TA保持旺盛的分裂能力，是5-FU殺傷的主要對象，TA受損后，導(dǎo)致腸絨毛各種功能細(xì)胞無法補(bǔ)充，最終導(dǎo)致腸絨毛脫落［5-6］。本研究常規(guī)病理證實改變進(jìn)一步證實了上述觀點，大劑量5-FU作用后，腸絨毛脫落，腸腔只剩下一單層上皮細(xì)胞覆蓋，前期實驗亦證實，這些單層上皮細(xì)胞幾乎都表達(dá)腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志物—musashi-1（msi-1），表明這些單層上皮細(xì)胞含有豐富的腸上皮干細(xì)胞，發(fā)揮著腸黏膜損傷修復(fù)作用［6］。隨著修復(fù)的進(jìn)行，腸隱窩逐漸形成，腸上皮干細(xì)胞逐漸往腸隱窩聚集，并逐漸分裂、分化出各種功能細(xì)胞，逐漸形成粗短的腸絨毛。

表1　各個時間點實驗組與對照組腸年黏膜細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)陽性率（n=10）

腸上皮干細(xì)胞的分裂、分化受到一系列復(fù)雜的細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)。β-catenin是一種胞內(nèi)糖蛋白，為Wnt/ β-catenin信號通路核心蛋白，越來越多證據(jù)表明，該通路在維持干細(xì)胞穩(wěn)定及自我更新方面起著重要作用［7］。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路Wnt受體主要為Frizzled或低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）。Wnt與細(xì)胞受結(jié)合后，使LRP5/6磷酸化，磷酸化的LRP5/6與Axin結(jié)合，后者可使β-catenin從結(jié)合體變成游離體，游離的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合TCF轉(zhuǎn)錄因子，最終使Wnt的目標(biāo)基因得到表達(dá)。即細(xì)胞核內(nèi)，形成β-catenin/ Tcf4復(fù)合體，直接上調(diào)c-Myc基因的表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入分裂周期［8-9］。本實驗亦證實，在正常對照組腸黏膜中，β-catenin主要表達(dá)于腸隱窩中上2/3位置，即TA的位置，表明這部分細(xì)胞處于旺盛的分裂期。腸黏膜受到損傷后，腸上皮干細(xì)胞啟動Wnt/β-catenin信號通路，對損傷進(jìn)行修復(fù)。從本實驗可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸黏膜受到大劑量5-FU作用后，注射5-FU完成后第1天剖殺的小鼠小腸腸腔中的單層上皮細(xì)胞幾乎都表達(dá)β-catenin蛋白，前期實驗證實這部分細(xì)胞亦表達(dá)msi-1，表明腸上皮干細(xì)胞啟動細(xì)胞分裂周期，以修復(fù)損傷的腸黏膜，隨著修復(fù)的進(jìn)行，β-catenin蛋白的表達(dá)主要位于新生腸隱窩中，且比例逐漸降低，表明終末功能細(xì)胞不斷生成，干細(xì)胞比例亦隨之降低，最終完成對腸黏膜的重塑。

本實驗證實了在腸黏膜受到大劑量5-FU損傷后，β-catenin蛋白在腸黏膜中表達(dá)顯著升高，表明其在腸黏膜損傷修復(fù)過程中的重要作用，但其調(diào)控腸上皮干細(xì)胞分裂、分化的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

［1］Dorfman T，Pollak Y，Sohotnik R，et al.Enhanced intestinal epithelial cell proliferation in diabetic rats correlates with β-catenin accumulation［J］.J Endocrinol，2015，226（3）:135-43.

［2］Lien WH，F(xiàn)uchs E.Wnt some lose some:transcriptional governance of stem cells by Wnt/β-catenin signaling［J］.Genes Dev，2014，28（14）:1517-32.

［3］Zani A，Cananzi M，F(xiàn)ascetti-Leon F，et al.Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism［J］. Gut，2014，63（2）:300-9.

［4］羅育其，吳承堂，聞英，等.大劑量5-FU致腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷時腸上皮msi-1的表達(dá)及其意義［J］.中華普通外科雜志，2007，22（12）:939-42.

［5］Ogaki S，Shiraki N，Kume K，et al.Wnt and notch signals guide embryonic stem cell differentiation into the intestinal lineages［J］. Stem Cells，2013，31（6）:1086-96.

［6］羅育其，吳承堂，聞英，等.大劑量5-FU致腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷時PCNA的表達(dá)［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，27（12）:1860-2.

［7］Krausova M，Korinek V.Wnt signaling in adult intestinal stem cells and cancer［J］.Cell Signal，2014，26（3）:570-9.

［8］Chen Y，Lee SH，Tsai YH，et al.Ischemic preconditioning increased the intestinal stem cell activities in the intestinal crypts in mice［J］.J Surg Res，2014，187（1）:85-93.

［9］Sancho R，Cremona CA，Behrens A.Stem cell and progenitor fate in the mammalian intestine:Notch and lateral inhibition in homeostasis and disease［J］.EMBO Rep，2015，16（5）:571-81.

Expression of β-catenin in mouse intestinal mucosa siverely dameged by 5-FU

LUO Yuqi1，YU Haitao1，OU Wentao1，DONG Dong1，WU Chengtang2
1Department of General Surgery，Nansha Hospital，Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou 510180，China；2Department of General Surgery，Nanfang Hospital，Southern Medical Univercity，Guangzhou 510515，China

Objective To discusse the expression of β-catenin proten and its significance in mouse intestinal mucosa，and β-catenin was colse related to the proliferation of intestinal stem cells.Methods A total of 70 C57/BL mice were divided two goups randomly，30 of them were in control group（group A），and other 40 mice were in experimental group.The mice in experimental group were treated with introperitoneal injection of large dose of 5-FU（150 mg/kg body weight for 5 consecutive days），the 30 mice were divied 3 groups，10 of them were kill at the 1st the 3rd day and the 5th day after the injection was finished.The middle of intestine from these mice was fixed for HE straining and immunohistochemical techniques.The experession of β-catenin in the intestinal sample was detected by immunohistochemical techniques.The mice in control group were introperitoneal injected saline for five days as control，and them were treated as the mice in experimental group.Results After injectin hight dose of 5-FU，the intestine of the mice suffered severe damage:the mucosa was shown as inflammatory oedema，the villi and cryptes disappared，and the mucosa repaired minimally with time.The expression of β-catenin proten in intestianl mucosa of the mice after injecting hight dose of 5-FU increased significantly comparied with control the mice in control group，and percentage of β-catenin proten positive cells in intestinal mucosa gradually decreased with time in mice of experimental group.Conclusion The expression of β-catenin in intestinal mucosa increased when the mice were injected hight dose of 5-FU，meaning the proten could promote the proliferation of intestinal stem cells and finish the regeneration of intestinal mucosa.

β-catenin；5-FU；intestinal stem cells；intestinal mucosa

2016-05-17

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2014A010009）；廣東省中醫(yī)強(qiáng)省科研項目（20152040）

羅育其，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:henry216@fimmu.com