李 蕾，金其貫，胡振東，薛 鵬

運(yùn)動對2型糖尿病大鼠血清生物標(biāo)記物時序性特征的代謝組分析*

李 蕾1△，金其貫2，胡振東1，薛 鵬1

（1.淮北師范大學(xué)體育學(xué)院 ，安徽 淮北235000；2.揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院 ，江蘇揚(yáng)州225009）

目的:分析2型糖尿病大鼠在運(yùn)動干預(yù)不同時點(diǎn)的血清生物標(biāo)記物組合特征。方法:100只SD大鼠 ，隨機(jī)選取90只高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，40mg/kg體重腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）造模，穩(wěn)定1周后，71只大鼠成模。最后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)共81只大鼠。實(shí)施三個時點(diǎn)游泳運(yùn)動干預(yù)（2周、4周和8周）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共分8組，具體如下:正常對照組（C0組，n=10）；糖尿病模型對照組（DC0組，n=10）；糖尿病模型對照2周組（DC2組，n=10）；糖尿病模型對照4周組（DC4組，n=10）；糖尿病模型對照8周組（DC8組，n=9）；糖尿病運(yùn)動干預(yù)2周組（DE2組，n=11）；糖尿病運(yùn)動干預(yù)4周組（DE4組 ，n=10）；糖尿病運(yùn)動干預(yù)8周組（DE8組 ，n=11）。采用UPLC/Q-TOFMS技術(shù)對大鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)檢測，分析運(yùn)動干預(yù)三個時點(diǎn)血清生物標(biāo)記物的組合特征。結(jié)果:依據(jù)變化倍數(shù)大小排列組合，形成運(yùn)動干預(yù)三個時點(diǎn)的血清生物標(biāo)記物組合。這些血清生物標(biāo)記物組合中，大部分差異性物質(zhì)在不同時點(diǎn)同時出現(xiàn)，但變化倍數(shù)有明顯不同。2周時點(diǎn)單甘油酸酯的變化倍數(shù)最明顯，4周時點(diǎn)葡糖酸的變化倍數(shù)最明顯，4～8周時點(diǎn)二十碳五烯酸、亞麻酸含量可回歸至正常水平。結(jié)論:2型糖尿病大鼠運(yùn)動干預(yù)不同時點(diǎn)血清生物標(biāo)記物組合呈現(xiàn)出一定特征。二十碳五烯酸、亞麻酸是運(yùn)動干預(yù)三個時點(diǎn)中上調(diào)顯著的共同物質(zhì)，單甘油酸酯、葡糖酸、丙基肉堿、精氨酸、1-磷酸鞘氨醇是三個時點(diǎn)中下調(diào)顯著的共同物質(zhì)。

運(yùn)動干預(yù)；時序性；2型糖尿病；大鼠；生物標(biāo)記物

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.017

我國2型糖尿?。═2DM）患病率高達(dá)9.7%，且仍呈上升趨勢，已成為世界糖尿病第一大國［1］。與藥物干預(yù)機(jī)制不同的是，運(yùn)動干預(yù)呈現(xiàn)“多靶點(diǎn)”、“非特異性”、“密切對話”、“突出整體”等特點(diǎn)。傳統(tǒng)單靶點(diǎn)作用的藥物研究模式不一定適用于運(yùn)動調(diào)節(jié)機(jī)制的研究［2］。而代謝組學(xué)的“全景式”掃描，具有方法學(xué)優(yōu)勢?！斑\(yùn)動代謝組學(xué)”（sportomics）的提出［3，4］，進(jìn)一步啟示我們研究運(yùn)動干預(yù)后代謝物圖譜的時間變化軌跡（生物標(biāo)記物的時序性變化），從而獲得生物體運(yùn)動干預(yù)過程中機(jī)能的完整信息。已有的文獻(xiàn)以急性運(yùn)動偏多［5-14］，慢性運(yùn)動很少［15］。尤其缺少慢性病動物模型的縱向研究。本研究建立2型糖尿病動物模型，基于代謝組學(xué)方法探討運(yùn)動干預(yù)不同時點(diǎn)大鼠血清生物標(biāo)記物組合特征，為認(rèn)識運(yùn)動干預(yù)隨時間推進(jìn)的累積效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號:S0130）和亮氨酸-腦啡肽購自Sigma公司；LC/MS級乙腈購自 Merck公司，UPLC級甲醇購自 Merck公司（Dannstadt，Gennany）；甲酸購自CNW公司；其余試劑為市售分析純。實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent，1290 Infinity UPLC）；質(zhì)譜檢測為四級桿飛行時間質(zhì)譜（6530 UHD and Accurate-MassQ-TOF/MS）；分離色譜柱為C18色譜柱（Agilent，100mm×2.1mm，1.8μm）。FRESCO 17離心機(jī)（ThermoFisher Scientific）；SK5200HP超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Mettler AE240天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；EYEL MG-2200氮吹儀（TOKYO RIKA KIKAL C0LTD）；Tissuelyser-24研磨儀（上海凈信科技）；VORTEX渦旋儀（LABNET）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物造模與取材

100只5周齡雄性SD大鼠（140～160 g），購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，每日光照12 h，室溫（24±0.8）℃，相對濕度60%，自由飲水?dāng)z食。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選取90只大鼠予以高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，之后以40 mg/kg體重實(shí)施腹腔注射STZ造模，觀察大鼠飲食、體重、尿量等生理指標(biāo)，穩(wěn)定1周后剪尾取血測定空腹血糖和隨機(jī)血糖（夜間不禁食，9∶00測隨機(jī)血糖，之后禁食6 h，15∶00測空腹血糖），以空腹血糖≥11.1 mmol/L并結(jié)合隨機(jī)血糖判斷糖尿病大鼠模型造模成功。10只大鼠給予適量生理鹽水腹腔注射對照，作為正常對照組（C0組），普食喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

將造模成功的71只大鼠按血糖水平篩選分層，并匹配不同干預(yù)時點(diǎn)隨機(jī)分為以下7組:糖尿病模型對照組（DC0組，n=10）；糖尿病模型對照2周組（DC2組，n=10）；糖尿病模型對照4周組（DC4組，n =10）；糖尿病模型對照8周組（DC8組，n=9）；糖尿病運(yùn)動干預(yù)2周組（DE2組，n=11）；糖尿病運(yùn)動干預(yù)4周組（DE4組，n=10）；糖尿病運(yùn)動干預(yù)8周組（DE8組，n=11）。所有大鼠普食喂養(yǎng)，運(yùn)動組游泳運(yùn)動干預(yù)，每周訓(xùn)練6 d，休息1 d，訓(xùn)練時間從20～60min不等的逐漸適應(yīng)，到適應(yīng)3 d后90min/d。各組大鼠分別于運(yùn)動2周、4周、8周結(jié)束48 h后取材，取材前各組大鼠均禁食12 h。所有大鼠苯巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，離心取血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 代謝組學(xué)分析

樣本常溫下解凍，取100μl置于1.5ml的離心管，加入0.5 ml低溫甲醇，超聲破碎，低溫離心（15 000 r/min，5 min），吸取上清液；殘?jiān)性俅渭尤?.5ml的低溫甲醇，重復(fù)上述步驟，合并上清液。取200μl上清于進(jìn)樣小瓶中待測。

色譜分離柱溫為40℃；流速0.4ml/min；流動相組成A:水+0.1%甲酸，B:乙腈+0.1%甲酸；進(jìn)樣量為4μl，自動進(jìn)樣器溫度4℃。質(zhì)譜采用正負(fù)離子模式檢測，毛細(xì)管電壓4 kV（負(fù)離子模式3.5 kV）、錐孔電壓35 kV（負(fù)離子模式50 kV）、離子源溫度100℃；脫溶劑氣溫度350℃（負(fù)離子模式300℃）、反向錐孔氣流50 L/h、脫溶劑氣體流量600 L/h（負(fù)離子模式700 L/h）、萃取錐孔4 V。離子掃描時間0. 03 s、掃描時間間隔0.02 s、數(shù)據(jù)采集范圍:50～1 000m/z。亮氨酸-腦啡肽溶液作為鎖定質(zhì)量溶液。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

代謝組學(xué)檢測數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Simca-P軟件，根據(jù)OPLS模型中的變量重要性投影值和峰響應(yīng)強(qiáng)度值的單維t檢驗(yàn)篩選生物標(biāo)記物。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的空腹血糖水平

在運(yùn)動干預(yù)4周時點(diǎn)，DE4組大鼠的空腹血糖水平顯著低于DC4組大鼠（P＜0.05），表明運(yùn)動干預(yù)4周時點(diǎn)，糖尿病大鼠空腹血糖的改善作用最明顯（表1）。

2.2 OPLS-DA模式識別

采用正交-偏最小二乘投影判別分析（OPLSDA）模式識別方法區(qū)分C0組和DC0組，根據(jù)VIP值（VI P＞1），結(jié)合單維 t檢驗(yàn)的P值（P＜0.05），通過搜索在線數(shù)據(jù)庫（http://metlin.scripps.edu/），比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量數(shù)mass，最終對差異性表達(dá)代謝物（生物標(biāo)記物）進(jìn)行定性和鑒定可以看出C0和DC0，兩組明顯被分離開，表明C0組和DC0組之間的內(nèi)源性代謝物存在明顯差異（圖1）。

Tab.1 Serum fasting blood glucose level in every groups（±s，n =9～11）

Tab.1 Serum fasting blood glucose level in every groups（±s，n =9～11）

FPG:Fasting plasma glucose*P＜0.05 vs DC4 group

Group　n　FPG（mmol/L）C0　10　8.1±0.5 DC0　10　14.0±5.5 DC2　10　23.98±5.84 DC4　10　26.2±7.8 DC8　9　11.11±6.96 DE2　11　17.6±8.57 DE4　10　10.41±2.85*DE8　11　9.24±2.81

Fig.1 OPLS-DA score plotof two groups

Tab.2 Fifteen significant differencemetabolites in group DE2 based on fold-change

2.3 基于代謝組學(xué)檢測篩選的干預(yù)組不同時點(diǎn)生物標(biāo)記物組合特征

我們分別鑒定出運(yùn)動干預(yù)三個時點(diǎn)的生物標(biāo)記物，并根據(jù)變化倍數(shù)從大到小的順序再次篩選，取前15位物質(zhì)組成每個時點(diǎn)的生物標(biāo)記物組合作為本文分析討論的物質(zhì)（表2、表3、表4）（除去重復(fù)出現(xiàn)的物質(zhì)，最終篩選出的物質(zhì)總數(shù)是22個）。與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠體內(nèi)的二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、亞麻酸（linolenic acid，LA）、磷酸膽堿（phosphorylcholine，PC）、磷酸膽堿、脯氨酸-甜菜堿（Proline betaine）、雙羥基十八碳烯酸（DiHOME）有顯著性降低，經(jīng)過游泳訓(xùn)練后，運(yùn)動干預(yù)組（2周、4周、8周）大鼠體內(nèi)的這些物質(zhì)均有明顯上調(diào)，上調(diào)程度的先后順序有所不同，但EPA、LA是三個時點(diǎn)中上調(diào)顯著的共同物質(zhì)，其它如脯氨酸-甜菜堿、磷酸膽堿均有不同程度地上調(diào)。

相比于正常對照組大鼠，模型組大鼠體內(nèi)的精氨酸（arginine，Arg）、肉毒堿（carnitine）、單甘油酸酯（monoglyceride，MG）、磷酸膽堿（phosphatidylethanol amines，PE）、丙酰肉毒堿 （propionyl-L-carnitine，PLC）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，SPP）、葡糖酸（gluconic acid）、核糖酸（ribonic acid）有顯著性升高，經(jīng)過游泳訓(xùn)練后，運(yùn)動干預(yù)組（2周、4周、8周）大鼠體內(nèi)的這些物質(zhì)均有明顯下調(diào)，下調(diào)程度的先后順序有所不同，但MG、葡糖酸、PLC、Arg、SPP是三個時點(diǎn)中下調(diào)顯著的共同物質(zhì)，其它如肉毒堿、PE、葡糖酸均有不同程度地下調(diào)。

Tab.3 Fifteen significant differencemetabolites in group DE4 based on fold-change

3 討論

EPA是多不飽和脂肪酸ω-3系列中常見的一種。ω-3系脂肪酸已被證實(shí)能促進(jìn)循環(huán)系統(tǒng)的健康和防止膽固醇及脂肪在動脈壁上積聚。EPA對腎病、2型糖尿病等的治療起到積極的作用。LA是大鼠體內(nèi)的必需脂肪酸，能降低血液膽固醇，預(yù)防動脈粥樣硬化。研究發(fā)現(xiàn)，如果缺乏LA，膽固醇就會與一些飽和脂肪酸結(jié)合，發(fā)生代謝障礙［16］。

1-磷酸鞘氨醇（SPP）是鞘磷脂代謝更新過程中的代謝產(chǎn)物之一。近年來發(fā)現(xiàn)SPP在細(xì)胞增殖、移動、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)方面有重要作用［17］。葡糖酸是在6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸葡糖酸內(nèi)酯的過程中形成的，然后進(jìn)入磷酸戊糖循環(huán)途徑，其產(chǎn)物與糖酵解途徑存在交叉。模型組大鼠體內(nèi)的MG、葡糖酸、PLC、Arg、SPP顯著性升高，運(yùn)動干預(yù)組大鼠體內(nèi)的這些物質(zhì)均有明顯下調(diào)，且MG、葡糖酸、PLC、Arg、SPP是三個時點(diǎn)中下調(diào)顯著的共同物質(zhì)，其它如肉毒堿、磷酸膽堿均有不同程度的下調(diào)。這些下調(diào)的物質(zhì)分別與甘油三酯代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝、葡萄糖代謝、氨基酸代謝以及膽堿代謝相關(guān)。

模型組大鼠體內(nèi)EPA、LA的顯著性降低，而MG、PLC的顯著性升高，表明模型組大鼠體內(nèi)脂類代謝出現(xiàn)紊亂。推測糖尿病大鼠體內(nèi)最先被動員的能量儲備是甘油三酯，脂肪動員加速，大鼠消瘦明顯，2周運(yùn)動刺激加速了這種代謝紊亂（與肝功能低下有關(guān)）。代謝組學(xué)檢測分析結(jié)果可見，2周干預(yù)時點(diǎn)MG的變化倍數(shù)最為明顯。而為盡可能動員脂肪，提高脂肪酸利用率，導(dǎo)致肉毒堿含量較對照組增加，以及隨后的脂肪酸含量的降低，運(yùn)動干預(yù)可以上調(diào)EPA、LA含量接近正常水平，尤其以4～8周效果顯著。模型組大鼠體內(nèi)葡糖酸的顯著性升高，表明模型組大鼠體內(nèi)磷酸戊糖代謝和糖酵解代謝加速，且4周干預(yù)時點(diǎn)葡糖酸的變化倍數(shù)最為明顯。磷酸膽堿可參與磷脂的合成，加速甲基轉(zhuǎn)移，供應(yīng)活化甲基，加速肝細(xì)胞再生，具有保肝、強(qiáng)肝、解毒、促進(jìn)脂質(zhì)代謝和抗脂肪肝的作用［18］。模型組大鼠體內(nèi)磷酸膽堿有不同程度的降低和升高，表明糖尿病大鼠體內(nèi)膽堿代謝紊亂。運(yùn)動干預(yù)2～4周一定程度上加速了組織受損 ，8周時點(diǎn)出現(xiàn)較明顯的改善，總體上對肝腎功能有一定促進(jìn)作用，這與李國立的研究結(jié)果一致［19］。

綜上所述，我們應(yīng)用UPLC/Q-TOFMS技術(shù)檢測鑒定，并依據(jù)變化倍數(shù)大小排列組合，形成運(yùn)動干預(yù)三個時點(diǎn)的生物標(biāo)記物組合（每個組合15個物質(zhì)）。這些不同時點(diǎn)特異的血清生物標(biāo)記物組合中，大部分代謝物在不同時點(diǎn)同時出現(xiàn)，但變化倍數(shù)上有明顯差異。經(jīng)檢索這些生物標(biāo)記物分別與甘油三酯代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝、葡萄糖代謝、氨基酸代謝以及膽堿代謝相關(guān)。

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Metabolom ics analysis on serum biomarkers tim ing characteristics of type 2 diabetic rats intervened by exercise

LILei1△，JINQi-guan2，HU Zhen-dong1，XUE Peng1
（1.Departmentof Physical Education，Huaibei Normal University，Huaibei 235000；2.Department of Physical Education，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

【ABSTRACT】Objective:To analyze the combined featuresof serum biomarkerof exercise-intervened type 2 diabetesmellitus（T2DM）rats at different time point.Methods:Ninety SD rats randomly selected from 100were fedwith high glucose and fatdiet for 4weeks，and then received intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）according to 40mg/kg by weight；aftermodeling for oneweek，Seventy-one ratswere successfullymodeled amongwhich intervenedwith swimming at three different time points（2w，4w and 8w）.Eighty-one ratswere finally divided into 8 groups as below:Normal control group（C0，n=10）；DM model comparison group（DC0，n=10）；DM model comparison 2w group（DC2，n=11）；DM model comparison 4w group（DC4，n=10）；DM model comparison 8w group（DC8，n=9）；DM exercise intervention 2w group（DE2，n=11）；DM exercise intervention 4w group（DE4，n=10）；DM exercise intervention 8w group（DE8，n=11）. The UPLC/Q-TOFMS techniquewas used to conductmetabonomics testof serum of rats to analyze the combined features of serum biomarkers under exercise intervention at different time points.Results:According to fold change，we got the biomarker combinations（with 15 specific substances in each combination）of exercise intervention at three time points.In these serum biomarker combinations thatwere specific atdifferent time points，amajority ofmetabolites appeared simultaneously at different time points butwith obvious difference of fold change.Fold change ofmonoglyceride（24∶6）and gluconic acidweremostevident respectively at 2w and 4w intervention time points，Eicosapentaenoic Acid （EPA）andlinolenic acid（LA）contentsmightapproach the normal levelat4～8 time point.Conclusion:Combined featuresof serum biomarker of exercise-intervened T2DM rats are specific at different time point.Both EPA and LA are common substances significantly up-regulated while MonoglycerideMG（24:6），Gluconic acid，Propionyl-L-carnitine（PLC），Arginine（Arg）and Sphingosine-1-phosphate（SPP）are common substances significantly down-regulated at three time points.

exercise intervention； different time point； T2DM； rats； biomarker

R73-3

A

1000-6834（2016）03-255-05

國家體育總局全民健身研究領(lǐng)域課題（2015B056）；安徽省高校優(yōu)秀青年人才基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2013SQRL032ZD）；淮北市科技人才培育計(jì)劃（20140304）

2015-10-20

2016-02-01

Tel:13909615572；E-mail:Lisulei73@aliyun.com