葉聰瑩，黃　倩，馬國興，林高強(qiáng)，曹佳薇，劉小川

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

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水稻端粒長度測(cè)定及其遺傳特性研究

葉聰瑩，黃倩，馬國興，林高強(qiáng)，曹佳薇，劉小川

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

端粒在保護(hù)和維持染色體完整性方面發(fā)揮了重要作用，且與細(xì)胞衰老、癌變密切相關(guān)。由于同一細(xì)胞內(nèi)，不同染色體端粒長度存在差異，研究單個(gè)端粒長度的遺傳特性對(duì)于深入了解端粒的作用，闡明端粒與細(xì)胞周期間的關(guān)系具有重要意義。本研究利用水稻秈亞種和粳亞種之間平均端粒長度存在明顯差異的特點(diǎn)，結(jié)合它們的雜種F1、F2代群體，采用改良的單個(gè)端粒長度測(cè)定技術(shù)(STELA)，對(duì)T02p、T02q、T04q、T09p、T10q、T11p等6個(gè)端粒長度進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:單個(gè)端粒長度與相關(guān)染色體長度存在相關(guān)性，且具有數(shù)量性狀遺傳特征。更重要是F1代與親本之間有5個(gè)端粒沒有顯著差異，僅有T04q一個(gè)端粒呈現(xiàn)出超顯性遺傳效應(yīng),且超過極顯著的水平。因此，推測(cè)調(diào)控細(xì)胞周期的端粒長度并非是整個(gè)細(xì)胞平均端粒長度，而是某些或極少數(shù)關(guān)鍵端粒的長度。

水稻；端粒長度；STELA；遺傳

0　引　言

端粒是真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由富含GC的DNA重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白組成，能維持染色體的穩(wěn)定性，避免染色體末端融合[1]。不同生物有其特定的端粒長度[2]，端粒能與端粒結(jié)合蛋白共同作用在染色體末端形成T-loop、D-loop、G-四鏈體等特殊結(jié)構(gòu)[3-5]，發(fā)揮保護(hù)染色體的作用。

端粒的DNA由兩部分組成，單鏈DNA和雙鏈DNA。雙鏈DNA由幾十到幾千個(gè)堿基組成，單鏈DNA部分包含幾十到上百個(gè)堿基，不同生物差異很大[3, 6]。隨著細(xì)胞的分裂，因DNA末端復(fù)制問題，端粒逐漸縮短[7]，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡。有些細(xì)胞中，端粒酶具有生物活性，能以自身的RNA為模板，在端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化下延長端粒，克服了端粒DNA縮短的問題[8]。正常組織細(xì)胞中，端粒酶活性受到抑制，在一些具有增殖潛能的細(xì)胞中，端粒酶有低水平表達(dá)。但在癌變的細(xì)胞中，端粒酶活性較高[9]，因此端粒酶常被作為腫瘤抑制劑的靶標(biāo)[10]。小鼠的實(shí)驗(yàn)表明，端粒酶的缺失將導(dǎo)致端粒平均長度的縮短[11]，與細(xì)胞的生命周期及生物個(gè)體壽命密切相關(guān)。端粒酶功能障礙會(huì)導(dǎo)致先天性角化不良等退行性疾病[12]。與動(dòng)物不同，植物中端粒酶的活性較高，能夠修復(fù)基因損傷，因此保持端粒酶活性對(duì)植物非常重要[13]。

在端粒酶的作用下，端粒長度得到了延伸，但是同一個(gè)細(xì)胞中具有相同細(xì)胞周期的染色體端粒長度卻有很大差異。顯然，端粒長度受到了除端粒酶以外其它因子的影響。研究表明，端粒長度受到端粒酶活性、端粒相關(guān)蛋白、端粒模板RNA等因素的共同調(diào)控[14]。端粒長度是否受到遺傳因素的影響目前并不十分清楚。

與動(dòng)物相比，植物容易構(gòu)建遺傳群體，且端粒長度較短，適合PCR，因此選擇植物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究更合適。水稻作為模式生物，容易構(gòu)建遺傳群體，且全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，方便獲取基因組信息進(jìn)行分析。

到目前為止，測(cè)定端粒長度的方法已有多種。端粒限制片段分析(telomere restriction fragment analysis，TRF)最早用于測(cè)定端粒平均長度，但是分辨率太低[15]。熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)，包括定量熒光原位雜交技術(shù)(quantitative fluorescence in situ hybridization，Q-FISH)和流式-熒光原位雜交技術(shù)(flow FISH)，通過特異性的熒光標(biāo)記探針與細(xì)胞分裂中期的染色體末端雜交的方式提高了分辨率[16-17]。而單個(gè)端粒長度測(cè)定技術(shù)(single telomere length analysis，STELA)[18]和Q-PCR[19]都是基于特殊的接頭擴(kuò)增端粒重復(fù)序列，與其它方法相比操作簡單方便，且STELA的精確性比Q-PCR更高。因此在本實(shí)驗(yàn)中用了STELA，而且為了克服下游引物在3′懸突的滑動(dòng)問題，本文對(duì)STELA進(jìn)行了改進(jìn)[20]。

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

水稻：從中國水稻研究所獲取兩個(gè)水稻品種，粳稻長粒粳，秈稻粵B，兩者的遺傳背景和端粒的平均長度都有很大差異。

其它實(shí)驗(yàn)材料有:T4 DNA Ligase(350 U/μL，TaKaRa)；T4 DNA Ligase Buffer(TaKaRa)；10×PCR Buffer(Mg2+plus，TaKaRa)；dNTP Mixture(2.5mM，TaKaRa)；rTaq酶(5 U/μL，TaKaRa)；250bp DNA Ladder Marker(TaKaRa)；瓊脂糖凝膠(Agrose HRBTM，Biotech)；液氮；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2儀器

CR22G高速離心機(jī)(天美(上海)貿(mào)易有限公司)；NanoDrop 2000 Spectrophotometer分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)；S1000 PCR儀(BIO-RAD)；Powerpac電泳儀(BIO-RAD)；Tanon-1600凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1水稻遺傳群體的構(gòu)建

取水稻種子，浸種、播種、插秧，開花后，將長粒粳向粵B授粉，成熟后得到F1代。F1代自交，收獲一定數(shù)量F2代的種子。F2代種子播種后得到植株。

1.3.2水稻基因組提取

取兩親本、F1代、F2代植株幼嫩的葉片，用試劑盒(TaKaRa Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取基因組。配置0.8%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)基因組DNA樣品的品質(zhì)，利用NanoDrop2000測(cè)定樣品的濃度。

1.3.3接頭的制備及連接反應(yīng)

由于3′懸突的特殊性，無法正常設(shè)計(jì)端粒下游引物，實(shí)驗(yàn)中制備了特殊的接頭T0(5′ -ACACTCA GGATTCATC-3′)，T1(5′-GATGAATCCTGAG TGTCCCTAAA-3′)。

反應(yīng)體系(40 μL)：10 μL(20 μM)T0；10 μL(20 μM)T1；2 μL 10×接頭Buffer(100 mM Tris-acetate (pH = 7.5)；100 mM Mg-acetate；500 mM K-acetate)；18 μL ddH2O。3000 r/m，離心15 s；94 ℃變性3 min；冷卻至室溫，靜置30 min。重復(fù)后兩個(gè)步驟兩次，制得的接頭于4 ℃保存。

將制得的接頭與水稻端粒末端連接，連接體系(20 μL)：2000 ng基因組DNA；3 μL(5 μM)接頭；2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer；1 μL T4 DNA Ligase(350 U/μL)；加ddH2O補(bǔ)足20 μL。16℃反應(yīng)2h。65 ℃滅活10 min，加ddH2O將連接產(chǎn)物稀釋到200 mL，4 ℃保存。

1.3.4PCR擴(kuò)增端粒

PCR反應(yīng)體系：模板DNA 50 ng；2μL10×PCR Buffer(Mg2+Plus)；1.6 μL dNTP Mixture(2.5 mM)；4μM上游引物(見表1)；4μMT1；0.25 μL rTaq(5 U/μL，TaKaRa)；加ddH2O到2 0μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃，3 min；(94 ℃，30 s；52 ℃，40 s；72 ℃，45 s)×36個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

表1　水稻端粒上游特異性引物

注：引物根據(jù)亞端粒序列設(shè)計(jì)。

1.3.5端粒長度測(cè)定

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離分析。配置1.2%的瓊脂糖凝膠(Agrose HRBTM，Biotech)，0.1%TAE(40 mmol/L Tris堿；20 mmol/L冰醋酸；2 mmol/L EDTA(pH=8))，電泳40 min，在0.1%溴化乙錠中染色30 min，流水中脫色10 min。通過SynGene成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，用Gene Tools分析軟件，對(duì)PCR產(chǎn)物結(jié)果進(jìn)行定量分析。由于端粒長度的差異，PCR產(chǎn)物呈彌散狀，總體呈正態(tài)分布。因此，測(cè)得的平均分子量就可看作單個(gè)端粒的長度。當(dāng)然，實(shí)際的端粒長度還必需減去亞端粒部分的長度，包括上游引物到端粒起始位置的距離、上游引物的長度以及T0的長度。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

端粒能夠維持染色體的穩(wěn)定性，但是在同一細(xì)胞中，不同染色體端粒長度不同。早期研究發(fā)現(xiàn)端粒長度與染色體的長度相關(guān)[21-22]，但這并不能很好解釋端粒長度差異的問題。為了研究這個(gè)問題，需要測(cè)定每條染色體上的端粒長度，并對(duì)其進(jìn)行深入分析。

2.1水稻遺傳群體構(gòu)建

利用水稻長期進(jìn)化過程中形成的秈亞種和粳亞種之間端粒長度顯著差異的特點(diǎn)，構(gòu)建遺傳群體，具體選擇了粵B(母本)和長粒粳(父本)為親本材料雜交獲得F1代，F(xiàn)1代自交得到F2代，將F2代種子播種70 d后，各植株間株高、發(fā)育期、葉片形態(tài)等表型出現(xiàn)了明顯的差異，說明F2代具有很好的性狀分離，構(gòu)建的F2代自交系能滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2水稻端粒長度的測(cè)定

基于之前的報(bào)道，已有多種測(cè)端粒長度的方法[15-17, 19]，但是只有STELA適用于本實(shí)驗(yàn)。此外，為了解決下游引物在3’懸突上滑動(dòng)的問題，設(shè)計(jì)了特殊的接頭，也使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確。在PCR反應(yīng)中，相較于長片段，短片段更容易被擴(kuò)增。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出，實(shí)際測(cè)得的端粒長度比理論值短。但是實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)中，親本、F1代中單個(gè)端粒長度都有相當(dāng)?shù)淖兓?如表2)，因此PCR反應(yīng)中存在的問題并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。

2.3水稻端粒長度遺傳特性

水稻12對(duì)姐妹染色體，有24對(duì)姐妹端粒，每條染色體都有特異的近端粒序列，但是在已知的水稻染色體信息中，只有6對(duì)姐妹近端粒序列是已知的，

基于此，設(shè)計(jì)了6條特異性引物，T02p、T02q、T04q、T09p、T10q和T11p(見表1)，擴(kuò)增了6個(gè)端粒并測(cè)定了長度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，粳稻和秈稻T02p、T02q平均端粒長度無顯著差異；T04q、T09p、T10q、T11p的平均端粒長度秈稻要長于粳稻，且差異較為明顯(見表2)，這與之前報(bào)道的結(jié)果是一致的[23]。

表2　親本與F1代6個(gè)端粒的單個(gè)端粒長度

同一品種中，不同染色體端粒長度相差較大。理論上，同一細(xì)胞中端粒酶活性相同、遺傳背景一致、細(xì)胞周期相同，端粒長度應(yīng)是相近的，差異很可能是進(jìn)化過程中染色體長度的不同導(dǎo)致的。為了深入探討兩者的關(guān)系，從Rice GenomeAnnotation Project和華大基因的數(shù)據(jù)庫中獲取了對(duì)應(yīng)染色體的特性包括染色體的長度、染色體臂的長度、染色體臂上基因的數(shù)量等，然后分析了端粒長度與這些特性之間的相關(guān)性。分析結(jié)果表明，秈稻中染色體的長度與端粒長度的相關(guān)系數(shù)為-0.438，粳稻中的相關(guān)系數(shù)為-0.636(見表3、表4)，表明端粒長度與染色體長度存在相關(guān)性，且呈負(fù)相關(guān)。這可能與染色體螺旋化有關(guān)，需要進(jìn)一步地研究。

表3　秈稻中染色體單個(gè)端粒長度性狀與染色體性狀相關(guān)性分析

表4　粳稻中染色體單個(gè)端粒長度性狀與染色體性狀相關(guān)性分析

對(duì)比F1代與親本染色體的平均端粒長度(圖1)，F(xiàn)1代中T02p、T02q和T09p長度接近兩親本，表現(xiàn)為加性效應(yīng)；T10q、T11p的長度比兩親本都長且更接近親本中端粒長度較長者，表現(xiàn)為顯性效應(yīng)；T04q的長度比兩親本都長，表現(xiàn)為超顯性效應(yīng)。

Male：父本，F(xiàn)1：F1代，F(xiàn)emale：母本圖1　親本與F1代單個(gè)端粒長度比較

F1代6個(gè)端粒長度中，T04q的長度變化最顯著，因此詳細(xì)分析了T04q端粒的遺傳特性(如圖2)。由圖2可知，F(xiàn)1代的平均端粒長度比父本即粳稻品種長34bp，比母本秈稻品種長12bp。F2代70個(gè)個(gè)體T04q的平均端粒長度表現(xiàn)出明顯的性狀分離，且呈連續(xù)分布(如圖3)，說明水稻端粒長度遺傳上表現(xiàn)為一定的數(shù)量性狀特性，且F2代平均長度遠(yuǎn)小于F1代，這可能與姐妹染色體端粒之間的長度改變有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

M：父本，F(xiàn)1：F1代，F(xiàn)：母本，F(xiàn)2：F2代圖2　親本、F1代、F2代T04q端粒長度對(duì)比

圖3　F2代70個(gè)個(gè)體T04q端粒長度

3　討　論

細(xì)胞中端粒長度的差異是一個(gè)很復(fù)雜的問題，端粒酶的活性、染色體及其長度、細(xì)胞周期等多方面原因共同導(dǎo)致了差異的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)用改良的STELA測(cè)定單個(gè)端粒的長度，對(duì)比分析了親本、F1代、F2代端粒長度的關(guān)系，研究了染色體長度、染色體兩臂長度與端粒長度的相關(guān)性,得到以下結(jié)果：

a)水稻染色體端粒長度分析表明，T02p、T02q兩個(gè)端粒平均長度在兩親本中無顯著差異，而T04q、T09p、T10q、T11p的平均端粒長度粵B長于長粒粳，說明秈稻的平均端粒長度比粳稻長。

b)分析染色體信息與端粒長度的關(guān)系可知，與染色體的其他特性相比，染色體的長度與端粒長度呈負(fù)相關(guān)，且端粒長度表現(xiàn)為一定的數(shù)量性狀遺傳特性。

c)對(duì)比親本、F1代平均端粒長度，發(fā)現(xiàn)F1代與親本中5個(gè)端粒長度沒有明顯的差異，僅表現(xiàn)為加性效應(yīng)或顯性效應(yīng)，但是T04q F1代的端粒長度遠(yuǎn)大于親本，表現(xiàn)為超顯性效應(yīng)。因此推測(cè)，染色體端粒長度還受到了某些遺傳因素的調(diào)控。

綜合以上分析，研究認(rèn)為在水稻細(xì)胞中，某些關(guān)鍵端粒的長度影響了整個(gè)細(xì)胞周期。此外，本實(shí)驗(yàn)中T04q的端粒長度在F2代呈連續(xù)分布且有明顯的性狀分離，這為分析定位與水稻端粒長度相關(guān)基因打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也對(duì)進(jìn)一步分析水稻端粒長度遺傳規(guī)律及相關(guān)基因定位研究具有重要意義。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Measurement of Telomeric Length and Hereditary Character of Oryza Sativa

YECongying,HUANGQian,MAGuoxing,LINGaoqiang,CAOJiawei,LIUXiaochuan

(College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

Telomere performs an important function of protecting and maintaining chromosome integrity and is closely related to cell senescence and cancerization. Since there are differences in lengths of different chromosome telomere within a cell, to study the hereditary character of the length of a single telomere in cells could help to further understand telomere functions and illuminates the relation between the telomere and cell cycle. In this study, according to the significantly different average telomere lengths of rice indica and japonica subspecies, in combination with hybrid F1 and F2 generation groups, analyses on the telomere lengths of T02p, T02q, T04q, T09p, T10q and T11p were carried by using the improved single telomere length analysis (STELA). The results show that the single telomere length is correlated to the relevant chromosome length and is characterized by quantitative character inheritance. What’s more, between F1 hybrid and the parents, there was no significant difference in 5 telomeres except T04q, which shows over-dominance inheritance and highly significantly exceeds t he level. Therefore, it is presumed that the telomere length of cell cycle is not the average telomere length of the whole cell but the length of some or very few telomeres are regulated.

rice; telomere length; STELA; inheritance

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.05.024

2015-12-04

葉聰瑩(1991-)，女，浙江紹興人，碩士研究生，主要從事水稻端粒方面的研究。

劉小川，E-mail：xcliu@zstu.edu.cn

Q943

A

1673- 3851 (2016) 03- 0463- 06 引用頁碼： 050706