潘洪川 劉海燕 張月超 肖大宴 謝清平

臨床研究

長鏈非編碼RNA MEG3在心肌梗死患者血清中的表達及意義

潘洪川 劉海燕 張月超 肖大宴 謝清平

目的 探討檢測長鏈非編碼RNA MEG3（MEG3）在急性心肌梗死（AMI）患者早期血清中的表達及其臨床意義。方法 采用實時熒光定量PCR（Real time PCR）檢測我院收治的48例AIM患者發(fā)病后不同時間點及30名正常對照組人員血清MEG3的表達水平，分析其與血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌鈣蛋白I（cTnI）表達水平的相關(guān)性。結(jié)果健康人血清中CK-MB及cTnI濃度分別為（10.17±2.08）IU/L和（0.69±0.17）ng/L。AMI患者血清CK-MB及cTnI水平顯著升高，胸痛發(fā)作后3 h可以觀察到這種明顯的變化，此后這種改變迅速增大并在12 h達到峰值。正常情況下血清MEG3維持在一個比較低的水平。AMI患者血清MEG3表達水平較正常對照組顯著升高（P<0.05），胸痛發(fā)作后1 h血清MEG3表達即迅速上升達到一個較高水平，此后這種改變迅速增大并在3 h達到峰值，最高可達正常表達值38倍多。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血清MEG3的表達與CK-MB和CTnI呈正相關(guān)（CK-MB r=0.684，P<0.01；cTnI r=0.721，P<0.01）。結(jié)論 AMI患者早期血清MEG3表達水平顯著升高，可能是潛在的AMI早期血清標志物。

長鏈非編碼RNA MEG3； 急性心肌梗死； 血清標志物

急性心肌梗死（acute myocardialinfarction，AMI）是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的心血管疾病，主要是由于持續(xù)的嚴重缺血導致心肌組織急性壞死[1]。近年來的研究表明，非編碼 RNA（noncoding RNA，ncRNAs）在急性心肌梗死的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[2]。其中，有關(guān)微小 RNA（micro RNA，miR）在心血管系統(tǒng)疾病領(lǐng)域的研究最為廣泛。有研究表明，miR-1、miR-499和 miR-208在急性心?；颊哐逯械谋磉_水平均明顯升高，提示其有望成為診斷急性心肌梗死潛在的生物學標志物和治療靶點[3-5]。長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNAs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA，可以在不同層面調(diào)控基因的表達。已有研究表明，血清中的lnc RNA（LIPCAR）可以作為評估心力衰竭預(yù)后的生物學標志物[6,7]。然而，lncRNAs能否作為急性心肌梗死的生物學標志物目前相關(guān)報道甚少。

最近研究發(fā)現(xiàn)的母系表達基因3（materally expressed gene 3，MEG3）是第一個被發(fā)現(xiàn)有腫瘤抑制功能的IncRNA。MEG3表達于多種正常組織中[8,9]。然而一些腫瘤細胞株中MEG3不表達，提示IncRNA具有抑制細胞生長的潛力[10,11]。目前針對MEG3的研究主要集中在腫瘤。研究表明，該基因表達量的增加能有效抑制癌細胞增殖；還有研究報道，在小鼠受損傷的骨骼肌中MEG3的表達增高[12]。但MEG3基因?qū)π募〖毎挠绊戇€沒有相關(guān)報道。本研究通過測定急性心肌梗死患者及正常對照組血清中LncRNA MEG3的表達水平，評價MEG3在急性心肌梗死患者血清中的變化趨勢及意義，判定MEG3在急性心梗診斷及治療中的潛在作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年10月至2015年1月期間相繼在我院心血管內(nèi)科住院的急性心肌梗死患者48例，以及30名健康對照者。急性心梗組按照 AMI發(fā)生后時間分為 0～2 h（5例）、2～6 h（5例）、6～12 h（7 例）、12～24 h（10 例）、24～48 h（10例）、48～72 h（7 例）、72～96 h（4 例）。AMI診斷按照WHO的AMI診斷標準：典型的臨床表現(xiàn)、特征性的ECG改變、血清心肌標志物水平動態(tài)改變，3項中具備2項，特別是后2項即可確診。對照組對象行冠狀動脈造影檢查，排除冠心病的診斷。排除標準：既往心力衰竭、心肌病、房顫等心臟疾病病史，明確的惡性腫瘤，近期內(nèi)接受過外科手術(shù)，近期肌肉損傷史等可能影響肌源性micro RNA以及l(fā)nc RNAs水平的因素。所有入選病例入院后即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集2管靜脈血（5 ml），一管即刻送檢心肌損傷標志物；另一管靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3000 rpm離心15 min，留取上層血清，置于-20℃冰箱備用。所有入選病例入院后24 h內(nèi)行常規(guī)體檢、實驗室檢查（血常規(guī)、血生化）及心電圖、心臟彩超等。同時收集兩組臨床資料，包括性別，年齡，是否患有高血壓、高脂血癥、糖尿病等。兩組的臨床資料比較未見統(tǒng)計學差異（P>0.05）。所有入選者均簽署知情同意書，經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2 血清總RNA提取 將分離所得血清置于冰上融化；取 250 μl血清樣品，加入 750 μl Trizol，振蕩器混勻，靜置5 min；加入200 μl氯仿，振蕩器混勻，靜置10 min；室溫下12 000 rpm離心10 min，留取上清液并測量其體積，轉(zhuǎn)移至另一個無Rnase的EP管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置3 min；室溫下12 000 rpm離心10 min；倒出管內(nèi)液體，加用1 ml 75%乙醇；室溫12 000 rpm離心2 min；倒出乙醇，并用Tip槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入 10 μl無Rnase的ddH2O，以能夠充分溶解RNA；用分光光度計測定總RNA濃度及純度。

1.3 Real-time PCR分析LncRNA MEG3的表達水平 提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20 μl體系中加2 μg總RNA進行cDNA的合成。Real-time PCR采用2xSYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為模板，引物濃度 0.4 μmol/L，15 μl體系進行擴增，每個待測樣本設(shè)置3個平行樣，根據(jù)目標基因設(shè)計合成相應(yīng)上下游引物進行PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)在定量PCR反應(yīng)儀上進行。3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)運用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行分析。

1.4 血清CK-MB和cTnI的檢測 血清CK-MB和cTnI檢測均采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。酶聯(lián)免疫分析試劑盒由上海華壹生物技術(shù)有限公司提供，實驗嚴格按試劑盒說明進行。CK-MB正常參考范圍為 0～25 IU/L，cTnI正常參考范圍為 0～1.5 ng/L。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。血液標本中MEG3、CK-MB及cTnI mRNA的表達差異采用t檢驗或One-way ANOVA方差分析，用±s表示；MEG3與CK-MB及cTnI相關(guān)性分析采用線性回歸法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AIM患者血清CK-MB及cTnI表達情況 健康人血清中CK-MB及cTnI濃度分別為（10.17±2.08）IU/L 和（0.69±0.17）ng/L。AMI患者血清 CKMB及cTnI水平可顯著升高，胸痛發(fā)作后3 h可以觀察到這種明顯的變化，此后這種改變迅速增大并在12 h達到峰值。

正常對照組血清中CK-MB及cTnI水平在正常值范圍內(nèi)，各時間點與AMI組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 AMI患者血清MEG3的表達情況 正常情況下血清MEG3維持在一個比較低的水平。AMI患者血清MEG3表達水平較正常對照組顯著升高（P<0.05），胸痛發(fā)作后1 h血清MEG3表達即迅速上升達到一個較高水平，此后這種改變迅速增大并在3 h達到峰值，最高可達正常表達值38倍多（圖2）。

圖1 不同時間點CK-MB及cTnI的變化

圖2 AMI患者血清MEG3的表達

2.3 血清MEG3與CK-MB及cTnI相關(guān)性分析 線性相關(guān)分析48例患者血清MEG3與CK-MB及cTnI表達的相關(guān)性，結(jié)果提示，MEG3與CK-MB及cTnI的表達呈正相關(guān)（CK-MB r=0.684，P<0.01；cTnI r=0.721，P<0.01）。見圖 3。

3 討論

急性心肌梗死（AMI）是指因持久而嚴重的心肌缺血所致部分心肌急性壞死[13]。在臨床上常有胸痛、急性循環(huán)功能障礙，以及反映心肌損傷、缺血和壞死等一系列特征性的心電圖改變。臨床表現(xiàn)常有持久的胸骨后劇烈疼痛、急性循環(huán)功能障礙、心律失常、心功能衰竭、發(fā)熱、白細胞計數(shù)和血清心肌損傷標記酶升高。臨床上主要根據(jù)癥狀、心電圖和心肌酶學檢查來診斷AMI[14]。傳統(tǒng)的心肌酶學檢查包括CK-MB及cTnI，雖然CK-MB及cTnI對 AMI具有高度的特異性和敏感性，但是AMI患者心肌梗死發(fā)生后3 h血清CK-MB及cTnI會出現(xiàn)升高，然而這種改變在心肌梗死發(fā)生后6～8 h才比較明顯，約12 h達到峰值，因此對早期診斷AMI價值有限。近年來對lncRNA的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有著極為密切的關(guān)系。研究結(jié)果證實，外周血中含有豐富的穩(wěn)定表達的LncRNA[15,16]。新近研究發(fā)現(xiàn)，疾病如惡性腫瘤患者血清中的lnc RNA表達失調(diào)。因此，lncRNA可能是一個理想的基于血液的疾病檢測評估指標及治療靶點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs在心肌組織中有高度的組織表達特異性。全基因組對于心肌梗死后心臟轉(zhuǎn)錄組的分析顯示，大量的心臟特異性lncRNAs對于心肌不良重塑、心肌再生、心功能等具有獨特的監(jiān)管和功能特性，這個發(fā)現(xiàn)意味著心臟特異性LncRNAs有充足的可能性可以作為心臟發(fā)育和與疾病相關(guān)的靶向分子和生物標志物[17,18]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA BC088254在心臟的發(fā)育中起到重要作用，敲除LncRNA 143260導致胚胎干細胞分化中的心肌細胞失去搏動能力，并使心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（Hand2、Myocardin、Nkx2-5、Gata4、Mef2c 等） 失活[19]。 lnc RNA-Ang362的敲除可抑制血管平滑肌細胞的增殖，從而影響血管相關(guān)疾病的進展[20]。LncRNASRA作為核受體信號轉(zhuǎn)導的共激活因子，在斑馬魚中敲低LncRNA-SRA表達后，能引起心室肌收縮功能障礙[21]。這些結(jié)果均提示，ncRNA可作為潛在的治療靶點。尿路上皮癌相關(guān)1（Urothelial carcinoma associated 1，UCA1）是一種最初在膀胱移行細胞癌中確定的lncRNA，整個序列包括3個長度1.4 kb的外顯子。因為它在膀胱移行細胞癌中高表達，可作為診斷膀胱癌潛在的生物標志物。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)lncRNA UCA1可作為新的急性心肌梗死標志物[22]。然而在心臟方面對于lnc RNAs的研究仍處于起步階段，關(guān)于lncRNA MEG3與心肌梗死方面的研究目前尚未見相關(guān)報道。本研究采用實時熒光定量PCR（Real time PCR）檢測我院收治的48例AMI患者發(fā)病后不同時間點及30名正常對照組人員血清MEG3的表達水平，分析其與血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌鈣蛋白I（cTnI）表達水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，正常情況下人血清中l(wèi)ncRNA MEG3表達水平很低，AMI可以導致血清lncRNA MEG3水平迅速升高，胸痛發(fā)作后1 h即可出現(xiàn)明顯改變，并迅速升高，在3 h左右達到峰值，最高可達正常表達值數(shù)十倍。這一試驗結(jié)果證實，血清LncRNA MEG3可以有效評估AMI早期心肌損傷，其反應(yīng)速度要強于CK-MB及cTnI。lncRNA MEG3的表達與CK-MB及cTnI呈正相關(guān)。

圖3 血清MEG3的表達與CK-MB及cTnI的相關(guān)性

綜上所述，lncRNA MEG3有望成為新的早期診斷AMI的血清學指標。在胸痛發(fā)作1 h左右lncRNA MEG3即可升高，可作為AMI早期診斷和鑒別診斷標志物，具有較好的臨床應(yīng)用前景，然而其具體機制仍需進一步深入研究。

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The expression and significance of serum long non encoding RNA MEG3 in patients with acute myocardial infarction

PAN Hong-chuan，LIU Hai-yan，ZHANG Yue-chao，et al.Department of Cardiology，Meishan People′s Hospital，Chengdu 620010，China

Objective To investigate the expression and clinical significance of long non encoding RNAMEG3（MEG3）in serum of patients with acute myocardial infarction（AMI）.Methods The blood samples were collected from 48 cases AMI patients at different times and 30 normal subjects.The serum MEG3，CK-MB and cardiac troponin I（cTnI） expression were measured using real-time fluorescence quantitative PCR（real time PCR）.The relationship between MEG3 with CK-MB and cardiac troponin I（cTnI）were analyzed.Results The concentrations of CK-MB and cTnI in the serum of healthy people were（10.17±2.08）IU/L and （0.69±0.17）ng/L.The serum levels of CK-MB and cTnI were significantly increased in AMI patients，and after 3 h of chest pain could be observed in this kind of changes，and the changes were rapidly increased and reached the peak at 12 h after the onset of chest pain.In normal control group，serum MEG3 was maintained at a relatively low level.The level of serum MEG3 in patients after 1 h AMI attack was significantly higher（P<0.05），and the serum MEG3 could reach the peak after 3 h of AMI attack.Correlation analysis showed that the expression of serum MEG3 positive correlation between CK-MB and cTnI （CK-MB r=0.684，P<0.01，cTnI r=0.721，P<0.01）.Conclusion The expression of serum MEG3 in the early stage of AMI is significantly elevated，which may be a potential marker for early serum AMI.

Long non encoding RNA MEG3； Acute myocardial infarction； Serum marker

PAN Hong-chuan，E-mail：panhongchuanmed@163.com

620010 四川省成都市，眉山市人民醫(yī)院心內(nèi)科

潘洪川，E-mail：panhongchuanmed@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．007

R542.2+2

A

1672-5301（2016）11-0985-05

2016-04-21）