郭芙蓉 黎明江 李莎 夏軍 劉化剛

臨床研究

鋅指轉(zhuǎn)錄因子1與風(fēng)濕性心臟病心房顫動患者心房纖維化的關(guān)系

郭芙蓉 黎明江 李莎 夏軍 劉化剛

目的 探討鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（Snail1）及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）機(jī)制在風(fēng)濕性心臟病心房顫動患者心房纖維化中可能發(fā)揮的作用。方法 選擇2015年9月至2016年3月入住我院心外科并確診為風(fēng)濕性心臟病準(zhǔn)備行換瓣手術(shù)的19例患者，在換瓣術(shù)中取約200 mg的右心房肌肉組織，按術(shù)前心律分為竇律（SR）組9例和房顫（AF）組10例。觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)變化采用HE染色，心房纖維化的程度比較使用Masson染色觀察，western blot和RT-PCR測定心房肌組織中Snail1的表達(dá)水平。結(jié)果 房顫組和竇律組之間性別、年齡、左室射血分?jǐn)?shù)、心功能分級、吸煙情況比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；左心房內(nèi)徑（LAD）竇律組為（44.441±7.13）mm，房顫組為（54.50±5.02）mm，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；心房膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）竇律組為0.123，房顫組為0.407，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Snail1的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平竇律組分別為1.001和0.341，房顫組分別為1.566和0.579，兩者分別比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 風(fēng)濕性心臟病心房顫動患者心房肌組織中Snail1表達(dá)增加，EMT可能被激活，從而促進(jìn)房顫患者的心房纖維化，在房顫的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用。

鋅指轉(zhuǎn)錄因子1； 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 心房顫動； 心肌纖維化

心房顫動（atrial fibrillation，AF）是目前臨床上導(dǎo)致心力衰竭、腦卒中及心源性猝死的心律失常之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。大量的基礎(chǔ)與臨床研究證實(shí)，房顫與心房肌纖維化之間存在著密不可分的聯(lián)系，且房顫的發(fā)生發(fā)展主要取決于兩大機(jī)制——電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而心房成纖維細(xì)胞（CFs）介導(dǎo)的心肌纖維化是心房顫動中心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要機(jī)制[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）機(jī)制是目前學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)之一，即成纖維細(xì)胞的來源除了由局部靜止的成纖維細(xì)胞活化而來外，還可由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等轉(zhuǎn)化而來[2]。研究發(fā)現(xiàn)EMT機(jī)制參與了肺纖維化、腎臟纖維化及心梗后小鼠的心肌纖維化[3-5]。而鋅指轉(zhuǎn)錄因子1（Snail1）作為EMT機(jī)制的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是否參與了風(fēng)濕性心臟病房顫患者的心房纖維化，本研究就此進(jìn)行了探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象 申報(bào)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會并獲批準(zhǔn)后，在入住我院心外科并明確診斷為風(fēng)濕性心臟病準(zhǔn)備行心臟瓣膜置換術(shù)的患者中，選擇年齡在30～60歲，心功能為Ⅱ～Ⅲ級的19例患者為本試驗(yàn)的研究對象。排除既往有明確的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病史，入院心臟彩超提示感染性心內(nèi)膜炎、肺源性心臟病，既往有甲狀腺功能亢進(jìn)或低下病史，肝、腎功能異常病史，惡性腫瘤病史者；同時(shí)若近期服用ACEI、ARB、β受體阻滯劑或醛固酮受體拮抗劑，并處于藥物半衰期內(nèi)的患者也排除在外。制作表格統(tǒng)計(jì)患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、心臟彩超指標(biāo)（左心房內(nèi)徑值、射血分?jǐn)?shù)）、心功能分級（紐約心臟病協(xié)會心功能分級）。每位患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的收集及保存 在心外科心臟換瓣手術(shù)過程中，成功插管建立體外循環(huán)后，在心臟停跳前右心房切開時(shí)鉗取右心房肌組織約200 mg，用4%多聚甲醛清洗掉血液，并用眼科剪及眼科鑷除去脂肪組織并修改組織邊緣后將組織分為兩部分。2/3的組織立即置入液氮罐中，并轉(zhuǎn)至－125℃深低溫冰箱中保存，留作Western blot及RT-PCR檢測用；1/3的組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，留存病理學(xué)分析。

1.2.2 病理學(xué)分析 將4%多聚甲醛溶液中保存的右心房肌組織進(jìn)行石蠟切片，HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化，Masson染色觀察心房心肌纖維化程度。

HE染色：石鈉切片脫鈉后放入Harris氏蘇木素染液染色5～7 min→自來水浸洗返藍(lán)→1%鹽酸乙醇分化2～5 s→自來水浸洗返藍(lán)→1%的水溶性伊紅染液染色約2 min→自來水浸洗30 s→無水乙醇脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片。染色完成后用正置光學(xué)顯微鏡觀察心房肌細(xì)胞的形態(tài)變化。

Masson染色：石蠟切片脫蠟→Weigert鐵蘇木精染液中染核5～7 min→流水沖洗3～5 min→1%鹽酸乙醇分化5～7 s→流水連續(xù)沖洗3 min左右→麗春紅酸性的品紅染液染色3～4 min→流水稍加沖洗→1%磷鉬酸溶液中分化約5 min后甩干→不水洗直接苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min→1%冰醋酸沖洗切片1 min→切片快速水洗→95%乙醇及無水乙醇脫水，二甲苯透明→風(fēng)干后用中性樹膠封片。染色完成后用光學(xué)顯微鏡觀察心房肌纖維化的程度，用Image-pro Plus 6.0軟件計(jì)算Masson染色切片中膠原的面積（切片中膠原纖維呈現(xiàn)為藍(lán)色），每張切片在高倍視野下隨機(jī)選擇6個(gè)視野，測量出每個(gè)視野面積內(nèi)的膠原總面積。膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）=膠原總面積/圖像總面積。取所有視野的平均值[6]。

1.2.3 Western blot技術(shù) Snail1在心房肌組織中的蛋白表達(dá)情況采用Western blot技術(shù)測定。根據(jù)蛋白提取試劑盒（武漢市碧云天生物技術(shù)研究所）提供的操作方法提取出組織的總蛋白（蛋白的濃度由Bradford方法測出，使各組組織樣品的蛋白濃度保持一致）→按50 μg總蛋白/泳道的方法進(jìn)行上樣→統(tǒng)一行SDS-PAGE電泳→電泳結(jié)束后的凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜→含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜→室溫?fù)u床上封閉2 h→洗膜后加 Snail1 抗體（gentex，工作濃度 1∶3000）4℃孵育過夜→HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度1∶50 000）37℃搖床孵育2 h→暗室內(nèi)DAB定影、顯色→晾干膠片，掃描膠片→用BandScan分析膠片灰度值。

1.2.4 RT-PCR技術(shù) 采用RT-PCR技術(shù)測定心房肌組織中Snail1的mRNA表達(dá)水平。使用Trizol（Aidlab）法提取總RNA，并用RT-PCR試劑盒檢測Snail1的表達(dá)。試驗(yàn)中所用引物序列為：Homo Snail1（226 bp）：上游 5′-GCACATCCGAAGCCACA-3′，下游：5′-GGAGAAGGTCCGAGCACA-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料均采用±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床資料 風(fēng)濕性心臟病患者心臟換瓣術(shù)中取得的心房肌組織分為竇律（SR）組9例和房顫（AF）組10例。兩組間性別、年齡、左室射血分?jǐn)?shù)、心功能分級、吸煙情況比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；左心房內(nèi)徑（LAD）竇律組為（44.441±7.13）mm，與房顫組（54.50±5.02）mm 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 心房肌細(xì)胞形態(tài)變化及纖維化程度 HE染色顯微鏡下觀察，房顫組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間距增加，心肌纖維肥大與萎縮并存，伴空泡變性空泡增多（見圖1）。Masson染色顯微鏡下觀察心房纖維化程度，可見房顫組和竇律組均存在不同程度的心肌纖維化，但房顫組纖維化更明顯。竇律組心肌細(xì)胞排列較規(guī)則呈車輪狀或圓盤狀，膠原纖維較少呈散在分布；而房顫組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，心肌間質(zhì)的膠原纖維增粗，呈彌漫性分布，排列紊亂呈網(wǎng)格狀（圖2）。使用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件分析顯示，房顫組膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）較竇律組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

2.3 Snail1的mRNA表達(dá)水平 RT-PCR結(jié)果顯示，與竇律組相比，房顫組 Snail1的mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

2.4 Snail1的Western blot表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示，房顫組Snail1的蛋白表達(dá)水平明顯高于竇律組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

表1 風(fēng)濕性心臟病患者的一般臨床資料（±s）

表1 風(fēng)濕性心臟病患者的一般臨床資料（±s）

注：LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；NYHA：紐約心臟病協(xié)會心功能分級；LAD：左心房內(nèi)徑。與竇律組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) 男/女 年齡（歲） LVEF（%） NYHA（Ⅱ/Ⅲ） 吸煙（是/否） LAD（mm）竇律組 9 5/4 48.44±7.38 54.56±6.65 4/5 2/7 44.44±7.13房顫組 10 5/5 48.40±7.96 52.70±3.56 4/6 2/8 54.50±5.02a

3 討論

本研究中觀察到房顫組心房肌組織中膠原纖維明顯增多、增粗呈彌漫性分布，排列紊亂呈網(wǎng)格狀，膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）比竇律組明顯增加。大量房顫的動物模型及臨床房顫患者的研究[6,7]均證實(shí)，房顫患者存在不同程度的心房纖維化，與本試驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象一致，提示心房肌纖維化是在心房顫動的發(fā)生及維持中發(fā)揮重要作用的因素之一。

各種細(xì)胞外因子刺激心臟成纖維細(xì)胞（CFs）后使其細(xì)胞膜上Ca2+內(nèi)流增加，引起成纖維細(xì)胞的病理性增殖、分化，使膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)合成明顯增加，從而發(fā)生心肌纖維化[8]。目前關(guān)于纖維化的研究已不只局限于原位成纖維細(xì)胞，由上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等轉(zhuǎn)化而來的成纖維細(xì)胞即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制（EMT）已發(fā)展為研究纖維化機(jī)制的新熱點(diǎn)。在一定病理?xiàng)l件（炎癥、組織重構(gòu)等）下上皮細(xì)胞被激活，通過EMT，產(chǎn)生大量的成纖維細(xì)胞，從而使細(xì)胞外基質(zhì)增多，這是器官纖維化發(fā)生的重要病理生理機(jī)制[9]。近年來發(fā)現(xiàn)，多因素誘導(dǎo)的EMT是糖尿病心肌病發(fā)展的重要機(jī)制之一[10]，而內(nèi)皮素1誘導(dǎo)的EMT能夠促進(jìn)糖尿病小鼠心臟纖維化，內(nèi)皮素1在糖尿病小鼠心臟中表達(dá)增加并通過EMT而加快心臟纖維化和心力衰竭[11]。以上研究均提示，EMT可能為房顫心房纖維化的重要機(jī)制之一。

Snail家族在損傷修復(fù)的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮協(xié)同作用。關(guān)于Snail家族中Slug、twist、Snail1的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Snail1因子的活性是EMT事件的特異標(biāo)志[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Snail1在腎臟組織中的表達(dá)增加在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用，Snail1的表達(dá)增加與腎間質(zhì)纖維化明顯相關(guān)[13]。另一項(xiàng)關(guān)于腎移植后患者的研究發(fā)現(xiàn)，Snail1水平與EMT的發(fā)生明顯相關(guān)[14]。同時(shí)Snail1還參與了肝臟和腹膜的纖維化[15,16]。在胚胎發(fā)育過程中，Snail1的激活促進(jìn)了心肌成纖維細(xì)胞、血管平滑肌和心肌細(xì)胞的形成[17]。Zhou等[18]在研究心肌梗死后成年大鼠的心外膜細(xì)胞通過分泌旁分泌因子來調(diào)節(jié)心肌損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，心臟損傷后在心外膜發(fā)現(xiàn)了Snail1 mRNA的再激活。另一項(xiàng)Liu等[12]關(guān)于Snail1在心梗后小鼠中的研究顯示，Snail1在心梗后被激活。心梗后第一天，在冠脈內(nèi)皮細(xì)胞及其周邊區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Snail1的激活，之后，Snail1在梗死區(qū)的間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，但是在心梗的周邊區(qū)域表達(dá)下降，直接反映了小鼠心梗后內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的進(jìn)展，提示Snail1的激活誘導(dǎo)了EMT從而參與小鼠心肌梗死后的心臟纖維化進(jìn)程。體外研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展，而Snail1參與了TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程，且對Snail1基因進(jìn)行沉默后，TGF-β2促進(jìn)EMT的作用減弱了[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，房顫組Snail1的mRNA表達(dá)水平較竇律組明顯增加，且房顫組CVF與竇律組相比也明顯增加，提示Snail1在風(fēng)濕性房顫患者心房纖維化過程中可能發(fā)揮了一定作用，即心房顫動患者Snail1被激活而誘導(dǎo)了EMT機(jī)制從而參與了心房顫動心肌纖維化的過程。而對房顫組Snail1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測同樣發(fā)現(xiàn)，Snail1的蛋白表達(dá)水平明顯高于竇律組，再一次證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。

關(guān)于Snail1誘導(dǎo)EMT機(jī)制從而參與組織或器官纖維化的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制目前仍不十分清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，Snail1誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生可能是因?yàn)槠渲苯右种屏蒜}黏蛋白（E-cadherin）的轉(zhuǎn)錄，而鈣黏蛋白的減少使上皮細(xì)胞間的連接變得松散，從而發(fā)生遷移、轉(zhuǎn)化，具有黏附和極性性質(zhì)的上皮表型的細(xì)胞逐漸變成寬松的、激活的能產(chǎn)生細(xì)胞基質(zhì)參與纖維化的間質(zhì)細(xì)胞[12]。Snail1作為一個(gè)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子是通過哪一條信號通路來誘導(dǎo)EMT從而參與到房顫患者的心肌纖維化中的呢？以往關(guān)于Wnt信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參于調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移及生長、分化、凋亡等過程，且在胚胎的發(fā)育、器官的發(fā)生和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中均發(fā)揮著重要作用[20]。正常機(jī)體腎臟中的Wnt信號是“靜止”的，胞質(zhì)中僅有少量游離態(tài)的βcatenin使同型細(xì)胞黏附在一起，防止細(xì)胞遷移。在腎臟纖維化的動物模型中發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的相關(guān)蛋白及靶基因的表達(dá)均有不同程度的升高，使用相應(yīng)的抑制劑阻斷Wnt通路后蛋白尿和腎臟纖維化程度較前減輕[21]。另有研究證實(shí)了Wnt信號通路在肺纖維化中的重要作用。目前研究比較多的是經(jīng)典的 Wnt-β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路，其通過E-cad/β-cat復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞間的黏附。β-catenin發(fā)生磷酸化時(shí)，E-cad/β-catenin復(fù)合物被破壞分離，細(xì)胞間黏附力下降，細(xì)胞遷移，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[22]。由此我們推測，Snail1很有可能是通過Wnt信號通路來參與心房顫動患者的心肌纖維化。而另一項(xiàng)關(guān)于Wnt1/bcatenin在心臟損傷后變化的研究[23]發(fā)現(xiàn)，Wnt介導(dǎo)的EndMT參與了心肌梗死后組織的修復(fù)過程，抑制Wnt信號激活可通過抑制EndMT減輕損傷后心肌的負(fù)性重構(gòu)。由此我們推測，Snail1可能是通過經(jīng)典型Wnt信號通路來誘導(dǎo)EMT機(jī)制，從而參與風(fēng)濕性心臟病房顫患者心房纖維化進(jìn)程，但仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

（本文圖片后插二）

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Relationship of Snail1 and atrial fibrosis in rheumatic heart disease patients with atrial fibrillation

GUO Fu-rong＊，LI Ming-jiang，LI Sha，et al.＊Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China

Objective To investigate the alteration of the levels of Snail1 in rheumatic heart disease patients with atrial fibrillation and to probe the possible role of Snail1 and epithelial-to-mesenchymal transition（EMT） in atrial fibrosis of atrial fibrillation.Methods About 200 mg right arterial tissue was taken from 19 rheumatic heart disease patients［9 sinus rhythm（SR）10 atrial fibrillation（AF）］during heart valve replacement surgery between September 2015 and March 2016.HE staining was used to observe the Morphological changes of Myocardial cells.Masson staining was used to observe the degree of atrial fibrosis，the expression of Snail1 was measured by Western blot and RT-PCR.Results There was no significant difference between the AF group and the SR group in the sex，age，left ventricular ejection fraction（LVEF），heart function grade of NYHA and smoking.The left atrial diameter of SR group and AF group was respectively（44.441±7.13）mm and（54.50±5.02）mm.The collagen volume fraction of right arterial tissue of SR group and AF group was respectively 0.123 and 0.407.The expression level of Snail1-mRNA and Snail1 protein SR group and AF group were respectively 1.001，0.341，1.566 and 0.579.Compared with that respectively in SR group，the expression of Snail1，the left atrial diameter and the collagen volume fraction of right arterial tissue were significantly increased in AF group（P<0.01）.Conclusion In the right arterial tissue of rheumatic heart disease patients，the increased level of Snail1 may contribute to activate the EMT.It may promote the atrial fibrosis of atrial fibrillation and then play an important role in the occurrence and maintain of atrial fibrillation.

Snail1； Epithelial-to-mesenchymal transition； Atrial fibrillation； Myocardial fibrosis

LI Ming-jiang，E-mail：754851539@qq.com

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：81170085）

430060 湖北省武漢市,武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科（郭芙蓉、黎明江、李莎），心外科（夏軍、劉化剛）

黎明江，E-mail：754851539@qq.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．009

R541.2

A

1672-5301（2016）11-0993-05

2016-06-07）