陳春 戴海鷹

基礎(chǔ)研究

心腦疏通膠囊對心肌缺血的影響及機(jī)制初探

陳春 戴海鷹

目的 探討心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素介導(dǎo)的心肌缺血的保護(hù)作用與其抑制NADPH氧化酶Nox2和Nox4的關(guān)系。方法 觀察心腦舒通膠囊（XNST capsule）對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠心電圖，血清乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、左心室NADPH氧化酶Nox2和Nox4表達(dá)水平的影響。結(jié)果 同對照組比較，異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的模型組大鼠心電圖 ST 位移值（0.27±0.05比 0.01±0.00，P<0.05）和 N-ST（9.63±0.37比 0.47±0.08，P<0.05）顯著增加，血清中 LDH［（1356.0±292.8）U/L 比（640.0±145.3）U/L，P<0.05）］、CK［（978.0±223.5）U/L 比（470.0±113.7）U/L，P<0.05］和 MDA［（9.06±2.17）μmol/L 比（5.40±1.78）μmol/L，P<0.05］的蛋白水平增高，而血清中 SOD 蛋白水平明顯減少［（71.0±12.8）U/ml比（107.0±16.7）U/ml，P<0.05］。與 ISO 模型組比較，心腦舒通膠囊治療顯著降低大鼠心電圖 ST 位移值［0.16±0.04（低劑量組）比 0.27±0.05，P<0.05；0.13±0.03（高劑量組）比 0.27±0.05，P<0.05］和 N-ST［4.70±0.42（低劑量組）比 9.63±0.37，P<0.05；3.83±0.28（高劑量組）比 9.63±0.37，P<0.05］以及血清中 LDH［（938.0±275.9）U/L（低劑量組）比（1356.0±292.8）U/L，P<0.05；（889.0±125.6）U/L（高劑量組）比（1356.0±292.8）U/L］、CK［（607.0±137.2）U/L（低劑量組）比（978.0±223.5）U/L，P<0.05；（579.0±125.6）U/L（高劑量組）比（978.0±223.5）U/L，P<0.05］和 MDA［（6.60±1.92）μmol/L（低劑量組）比（9.06±2.17）μmol/L，P<0.05；（6.20±1.63）μmol/L（高劑量組）比（9.06±2.17）μmol/L，P<0.05］的蛋白表達(dá)水平，而心腦舒通膠囊治療后大鼠血清中SOD蛋白水平升高［（89.0±13.9）U/ml（低劑量組）比（71.0±12.8）U/ml，P<0.05；（94.0±15.3）U/ml（高劑量組）比（71.0±12.8）U/ml，P<0.05］。此外，心腦舒通膠囊可顯著降低異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠左心室中NADPH氧化酶Nox2和Nox4的表達(dá)水平。結(jié)論 心腦舒通膠囊可顯著改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血，其機(jī)制與其抑制NADPH氧化酶Nox2和Nox4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)，為心腦舒通膠囊的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

心腦舒通膠囊； 心肌缺血； Nox2； Nox4； 氧化應(yīng)激

心血管疾病是我國城市和鄉(xiāng)村人群的第一位死亡原因[1]。我國心血管病的流行病學(xué)特征是腦卒中發(fā)病率高，冠心病發(fā)病率較低，但近20年來冠心病的發(fā)病率和死亡率逐漸增加[1]。因此，重視冠心病的防治，降低心血管疾病的死亡率，具有重要的臨床價(jià)值。

適量的活性氧是機(jī)體發(fā)揮正常生理功能的必要條件，但過多的活性氧則會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起組織器官損傷。氧化應(yīng)激可促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展，且氧化的低密度脂蛋白已被認(rèn)為是預(yù)測冠心病發(fā)生發(fā)展的早期標(biāo)志物[2,3]。NADPH氧化酶Nox2和Nox4是心肌中活性氧的主要來源，與心肌損傷密切相關(guān)[4]。心腦舒通膠囊是用于治療冠心病的常用中成藥，但其改善心肌缺血的機(jī)理目前還認(rèn)識不足，尚無研究闡明心腦舒通膠囊對心肌缺血的保護(hù)作用與NADPH氧化酶Nox2和Nox4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。因此，本研究以異丙腎上腺素介導(dǎo)的心肌缺血大鼠模型為研究對象，擬探討NADPH氧化酶Nox2和Nox4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否與心腦舒通膠囊的抗心肌缺血效應(yīng)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材、動物和藥物 多道生理記錄儀（中國），BECKMAN Synchron CX5自動血液生化分析儀（美國），SDS-PAGE電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（中國），實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國）。

清潔級SD大鼠，體重220～240 g，雄性，合格證號：SYXK（粵）2013-0020，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物實(shí)驗(yàn)遵循美國國立研究院（National Institutes of Health，NIH）發(fā)布的實(shí)驗(yàn)動物管理和使用指南，并獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。心腦舒通膠囊（國藥準(zhǔn)字 Z22021965）由吉林敖東洮南藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 制備異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血模型 取雄性SD大鼠48只，用色彩將老鼠標(biāo)記號數(shù)字后，采用數(shù)字表法隨機(jī)分成4組：空白對照組、異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導(dǎo)的模型組、ISO 模型組+心腦舒通低劑量組［XNST（L）］（24.3 mg/kg）和ISO模型組+心腦舒通高劑量組［XNST（H）］（48.6 mg/kg）。方法：參照參考文獻(xiàn)[5,6]，簡要描述如下：連續(xù)給予心腦舒通膠囊28 d，于給藥第26天灌胃30 min后，給藥組和模型組均腹腔注射異丙腎上腺素8 mg/kg誘導(dǎo)心肌缺血，空白對照組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)給藥3 d。

參照劑量—體表面積換算法：大鼠給藥劑量（mg/kg）=人的給藥劑量×大鼠轉(zhuǎn)換系數(shù)/大鼠體重，以70 kg成人每天服用心腦舒通膠囊（45 mg/次，3次/d）為等效劑量，參照換算標(biāo)準(zhǔn)方程進(jìn)行換算，即得大鼠等效劑量分別為12.15 mg/kg。本研究設(shè)心腦舒通膠囊的低、高劑量分別為臨床等效劑量的2倍（24.3 mg/kg）和 4倍（48.6 mg/kg）。藥物濃度均按大鼠1.0 ml/100 g灌胃容量用蒸餾水配制。

1.3 心電圖改變的檢測 心電圖檢測參照參考文獻(xiàn)[7-10]，具體如下：末次給藥后，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將其仰位固定在綁鼠板上，于四肢皮下插入針形電極，并與多道生理記錄儀相接；連續(xù)測量大鼠Ⅱ?qū)?lián)體表心電圖5 min，連續(xù)心電監(jiān)測大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖（紙速50 mm/s，增益l mV=10 mm）。觀察心電圖ST位移值和N-ST（計(jì)算位移高于0.1 mV的數(shù)量）的改變。

1.4 血清中LDH、CK、SOD和MDA含量測定 心電圖檢測后，腹主動脈取血2 ml，1200 g離心5 min后取上清，然后用全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH）、磷酸肌酸激酶（creatine phosphokinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測左心室中Nox4和Nox2的蛋白水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組6只大鼠取出心臟組織，PBS漂洗后去除心房及右室組織后保存于-80℃冰箱中。用強(qiáng)的組織裂解液（RIPA，碧云天）提取左心室的組織蛋白，然后用蛋白質(zhì)免疫印跡（western blotting）檢測左心室組織中Nox4和Nox2的蛋白水平。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測Nox4和Nox2的mRNA水平 取20 mg左心室組織，用手術(shù)剪將組織剪成小塊，加入1 ml Trizol后在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行組織勻漿，按照RNA提取步驟提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后再用實(shí)時(shí)定量PCR檢測Nox4的mRNA 水平。引物序列如下：Nox4：5′-AGCTGCCCACTTGGTGAACGC-3′（forward primer），5′ -TCAGGC CCGGAACAGTTGTGA-3′（reverse primer）；Nox2 引物：5′-GGGAGACTGGACTGAGGGGCT A-3′，5′-GGCGTGACTCCAATCCC AGC TC-3′（reverse primer）；GADPH；5′-ATCAAGAAGG TGGTGAAG －CA-3′（forwardprimer），5′-AAGGTGGA AGAA TGGGAGTTG-3′（reverse primer）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，服從正態(tài)分布，兩樣本統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，多樣本統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠模型的構(gòu)建 臨床實(shí)踐證實(shí)，心電圖ST段改變以及LDH和CK的顯著增加是判斷心肌缺血程度的重要參數(shù)。同對照組比較，異丙腎上腺素處理的大鼠模型中心電圖ST段位移值顯著增加，血清中LDH和CK水平顯著增加（見表1、2）。上述結(jié)果顯示異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠模型已成功構(gòu)建。

2.2 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血的影響 同模型組比較，心腦舒通膠囊的低、高劑量均能顯著抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠的心電圖改變，降低血清中LDH和CK水平（見表1、2）。這提示心腦舒通膠囊可顯著改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血。

2.3 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素介導(dǎo)的心肌缺血大鼠血清中SOD和MDA的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清SOD表達(dá)明顯下降，MDA含量顯著上升；心腦舒通膠囊的低、高劑量均可明顯抑制SOD的下降和MDA的上升。見表3。

表1 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠心電圖改變的影響（±s）

表1 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠心電圖改變的影響（±s）

注：ISO組：異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠模型組；ISO+XNST（L）組：低劑量心腦舒通治療的心肌缺血大鼠模型組；ISO+XNST（H）組：高劑量心腦舒通治療的心肌缺血大鼠模型組；N-ST：位移值高于0.1 mV的數(shù)量。與對照組比較，aP<0.05；與ISO組比較，bP<0.05

組別 例數(shù) ST位移值 N-ST對照組 12 0.01±0.00 0.47±0.08 ISO 組 12 0.27±0.05a9.63±0.37aISO+XNST（L）組 12 0.16±0.04b4.70±0.42bAAC+XNST（H）組 12 0.13±0.03b3.83±0.28b

表2 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠血清中 LDH、CK 水平的影響（±s）

表2 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠血清中 LDH、CK 水平的影響（±s）

注：ISO組：異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠模型組；ISO+XNST（L）組：低劑量心腦舒通治療的心肌缺血大鼠模型組；ISO+XNST（H）組：高劑量心腦舒通治療的心肌缺血大鼠模型組；LDH：乳酸脫氫酶；CK：磷酸肌酸激酶。與對照組比較，aP<0.05；與ISO組比較，bP<0.05

組別 例數(shù) LDH（U/L） CK（U/L）對照組 12 640.0±145.3 473.0±113.7 ISO 組 12 1356.0±292.8a978.0±223.5aISO+XNST（L）組 12 938.0±275.9b607.0±137.2bAAC+XNST（H）組 12 889.0±125.6b579.0±125.6b

表3 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠血清中SOD和MDA表達(dá)的影響（±s）

表3 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠血清中SOD和MDA表達(dá)的影響（±s）

注：ISO組：異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠模型組；ISO+XNST（L）組：低劑量心腦舒通治療的心肌缺血大鼠模型組；ISO+XNST（H）組：高劑量心腦舒通治療的心肌缺血大鼠模型組；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。與對照組比較，aP<0.05；與ISO組比較，bP<0.05

組別 例數(shù) SOD（U/ml） MDA（μmol/L）對照組 12 107.0±16.7 5.40±1.78 ISO 組 12 71.0±12.8a9.06±2.17aISO+XNST（L）組 12 89.0±13.9b6.60±1.92bAAC+XNST（H）組 12 94.0±15.3b6.20±1.63b

2.4 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素介導(dǎo)的心肌缺血大鼠心肌中Nox2和Nox4表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組大鼠左心室中Nox2、Nox4和mRNA水平顯著增加；心腦舒通膠囊的低、高劑量均能抑制異丙腎上腺素介導(dǎo)的Nox2、Nox4表達(dá)上調(diào)。見圖1。

3 討論

本研究可得出以下結(jié)論：①心腦舒通膠囊可顯著改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血。②心腦舒通膠囊可抑制SOD的下降和MDA的上升。③心腦舒通膠囊可降低左心室中Nox2和Nox4的表達(dá)水平。

中醫(yī)理論認(rèn)為，冠心病的病機(jī)為氣滯血瘀、血脈瘀積而造成心血管疾病，將冠心病歸為“胸痹”“心痛”“真心痛”“厥心痛”等范疇，其病理改變主要在于氣滯、血瘀、寒凝，瘀血阻絡(luò)、滯而不通，故而導(dǎo)致疼痛[11]。心腦舒通膠囊是刺蒺藜的全草提取物，其主要有效成分為蒺藜，具有活血化瘀、舒利血脈的功效。上述理論從中醫(yī)的角度闡述了心腦舒通膠囊治療冠心病的機(jī)理。這與我們的研究結(jié)果相符，心腦舒通膠囊能顯著抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠的心電圖改變，降低血清中LDH和CK水平，從而改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血。因此，心腦舒通膠囊可顯著改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血。

圖1 心腦舒通膠囊對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠左心室中Nox2和Nox4表達(dá)的影響

機(jī)體活性氧的平衡取決于活性氧的產(chǎn)生與清除間的平衡，平衡一旦被打破，則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而引起機(jī)體損傷。丙二醛是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，常被作為評估脂質(zhì)過氧化程度的標(biāo)志物。我們的結(jié)果顯示心腦舒通膠囊可降低MDA水平，提示心腦舒通膠囊可減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的氧化損傷。NADPH氧化酶Nox2和Nox4是心肌細(xì)胞中活性氧的主要來源[12,13]。本研究結(jié)果顯示，異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血模型中Nox2和Nox4的表達(dá)顯著增加，而心腦舒通膠囊可降低左心室中Nox2和Nox4的表達(dá)水平。超氧化物歧化酶（SOD）是參與機(jī)體活性氧清除的重要蛋白，SOD的表達(dá)越高，清除的活性氧就越多。本研究結(jié)果顯示，心腦舒通膠囊可通過增加異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血大鼠血清中SOD的表達(dá)促進(jìn)活性氧的清除。上述研究顯示，抑制NADPH氧化酶Nox2和Nox4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是心腦舒通膠囊發(fā)揮抗心肌缺血效應(yīng)的機(jī)制之一。

綜上所述，心腦舒通膠囊可顯著改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血，其機(jī)制與其降低NADPH氧化酶Nox2和Nox4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。這為心腦舒通膠囊的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)，但仍需深入研究以進(jìn)一步揭示其機(jī)理。

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The effect of XNST capsule on cardiac ischemia and preliminarily mechanical studies

CHEN Chun，DAI Hai-ying.Cardiovascular Department of Changsha Central Hospital，Changsha 410000，China

Objective XNST capsule could alleviate cardiac ischemia，however，little is known about the mechanisms.The aim of this research is to explore whether NADPH oxidase Nox2 or Nox4 is involved in the protective action of XNST capsule or not.Methods Myocardial ischemia model induced by isoprenaline was used to test the effect of XNST capsule on electrocardiogram，the concentration of LDH，CK，SOD and MDA in serum，and the expression of NADPH oxidase Nox2 or Nox4 in left ventricular tissues.Results Compared with control group，ST displacement（0.01±0.00 vs 0.27±0.05，P<0.05）and N-ST（0.47±0.08 vs 9.63±0.37，P<0.05）of electrocardiogram were significantly increased in isoproterenol-induced rats，and the protein levels of LDH［（640.0±145.3）U/L vs （1356.0±292.8）U/L，P<0.05］，CK［（470.0±113.7）U/L vs （978.0±223.5）U/L，P<0.05］and MDA［（5.40±1.78）μmol/L vs （9.06±2.17）μmol/L，P<0.05］in plasma were remarkably elevated in these rats，whereas SOD protein level in plasma of isoproterenol-induced rats was notably decreased ［（107.0±16.7）U/ml vs （71.0±12.8）U/ml，P<0.05］.Compared with ISO group，treating with XNST capsule significantly reduced ST displacement［0.27±0.05 vs 0.16±0.04（low dose group），P<0.05，0.27±0.05 vs 0.13±0.03（high dose group），P<0.05］and N-ST［（9.63±0.37 vs 4.70±0.42（low dose group），P<0.05，9.63±0.37 vs 3.83±0.28（highdose group），P<0.05］of electrocardiogram,and the plasma concentration in LDH［（1356.0±292.8）U/L vs（938.0±275.9）U/L （low dose group），P<0.05，（1356.0±292.8）U/L vs （889.0±125.6）U/L （high dose group）］，CK［（978.0±223.5）U/L vs（607.0±137.2）U/L（low dose group），P<0.05，（978.0±223.5）U/L vs（579.0±125.6）U/L（high dose group），P<0.05］and MDA［（9.06±2.17）μmol/L vs（6.60±1.92）μmol/L（low dose group），P<0.05，（9.06±2.17）μmol/L vs（6.20±1.63）μmol/L（high dose group），P<0.05］，whereas there was notable elevation in SOD expression in plasma after treatment with XNST capsule［（71.0±12.8）U/ml vs（89.0±13.9）U/ml（low dose group），P<0.05，（71.0±12.8）U/ml vs（94.0±15.3）U/ml（high dose group），P<0.05］.Moreover，XNST capsule could reduce the expression of Nox2 and Nox4 in left ventricular tissues of isoprenaline-induced rats comparing with ISO group.Conclusion XNST capsule could improve isoprenaline-induced cardiac ischemia via inhibiting the oxidative stress induced by NADPH oxidase Nox2 or Nox4.These results will provide further theoretical and experimental basis for the clinical application of XNST capsule.

XNST capsule； Cardiac ischemia； Nox2； Nox4； Oxidative stress

DAI Hai-ying，E-mail：daihaiying2009@163.com

410000 湖南省長沙市，長沙市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科

戴海鷹，E-mail：daihaiying2009@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2016）11-1048-04

2016-03-30）