李光磊張娟，2方真，2隆明星堵國(guó)成，2陳堅(jiān)

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌角蛋白酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

李光磊1張娟1，2方真1，2隆明星1堵國(guó)成1，2陳堅(jiān)2，3

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122）

將嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌BBE11-1來(lái)源的角蛋白酶基因kerD進(jìn)行畢赤酵母密碼子優(yōu)化，構(gòu)建重組載體pPIC9k-kerD；整合該重組載體到畢赤酵母SMD1168基因組，篩選到Mut+型重組子；對(duì)利用G418抗性篩選到的重組子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，篩選到產(chǎn)酶效果最好的重組菌株。純化和SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)的重組酶，研究重組酶的部分酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，重組酶的最適反應(yīng)pH為10，最適反應(yīng)溫度為60℃。為進(jìn)一步提高目的蛋白的產(chǎn)量，采用甲醇與山梨醇和甘露醇混合流加的策略，優(yōu)化重組菌產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵過(guò)程。結(jié)果表明，甲醇與甘露醇以20∶0.5比例混合流加，發(fā)酵168 h，角蛋白酶的產(chǎn)量2 048 U/mL，比單流加甲醇提高了87.2％。

角蛋白酶；畢赤酵母；酶學(xué)性質(zhì)；雙碳源；發(fā)酵優(yōu)化

角蛋白是自然界中廣泛存在的一種硬性蛋白，是動(dòng)物的毛發(fā)、羽毛、表皮和蹄角的組成成分［1］。角蛋白結(jié)構(gòu)中β折疊結(jié)構(gòu)較多，富含半胱氨酸和二硫鍵，不溶于水、抗分解，通常較難被一般的蛋白酶降解［2］；化學(xué)方法降解角蛋白，不僅效率低，且產(chǎn)生較多下游廢棄物，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染［3］。角蛋白酶能專(zhuān)一性降解角蛋白，細(xì)菌［4］、真菌［5］、放線菌［6］等微生物均可分泌，能有效地將羽毛、羊毛等角蛋白降解成動(dòng)物和人可以利用的氨基酸等產(chǎn)物［7］，在制革、飼料、環(huán)境保護(hù)等工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。目前，產(chǎn)角蛋白酶的原始菌株由于角蛋白酶表達(dá)量不高［8］或菌株本身具有致病性［9］等因素，較少用于角蛋白酶的商業(yè)化生產(chǎn)。在已開(kāi)展的角蛋白酶基因的克隆和異源表達(dá)研究中，以大腸桿菌為角蛋白酶的表達(dá)宿主時(shí)，通常產(chǎn)生包涵體，導(dǎo)致產(chǎn)酶效率不高［10］；利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)角蛋白酶時(shí)，角蛋白酶產(chǎn)量不高，且產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害作用導(dǎo)致細(xì)胞裂解，難以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)［11］。巴斯德畢赤酵母是一種強(qiáng)效真核表達(dá)系統(tǒng)，由于外源基因遺傳穩(wěn)定、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的天然修飾、過(guò)氧化物酶體對(duì)細(xì)胞的保護(hù)、可進(jìn)行高密度培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，目前已有多種外源蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中得到了成功表達(dá)［12-14］。在前期研究中，本團(tuán)隊(duì)篩選到一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌BBE11-1，表達(dá)的角蛋白酶能有效降解羽毛和羊毛，但基于菌株的培養(yǎng)成本及角蛋白酶分泌量等因素，本研究擬將該角蛋白酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，克隆到畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，以期獲得高效表達(dá)的、對(duì)羊毛和羽毛具有特異性降解作用的角蛋白酶重組菌株，旨為角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1）來(lái)源的角蛋白酶基因序列由本實(shí)驗(yàn)室克隆得到，將該基因序列根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，再全基因合成，得到基因序列kerD，由南京金斯瑞公司完成。大腸桿菌（JM109）菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏。巴氏畢赤酵母菌株P(guān)ichia pastoris SMD1168和分泌型表達(dá)載體pPIC9k由Invitrogen公司提供。

1.1.2酶和試劑 EcoR I、Not I和Sac I等限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶（PrimeSTAR HS premix）、DNA連接酶、Ex Taq DNA聚合酶等均購(gòu)自TaKaRa公司，G418、質(zhì)粒提取試劑盒、感受態(tài)制備試劑盒、福林酚試劑均購(gòu)自上海Sangon公司，DNA純化試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自Thermo公司。SDS-PAGE所用的試劑購(gòu)自Life公司，可溶性角蛋白購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，其他常規(guī)試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。

1.1.3引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)kerD基因序列設(shè)計(jì)引物EcoR I-F：5'-CCGGAATTCGCAGGACTTCCAACCAGAGAAC-3'和Not I-R：5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTGAGTTGCCAAAATGGAAACAC-3'，根據(jù)質(zhì)粒pPIC9k設(shè)計(jì)引物5'AOX1：5'-GACTGGTCCAATTGACAAGC-3'和3'AOX1：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'。引物的合成由上海Sangon公司完成。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 大腸桿菌培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，配方及培養(yǎng)條件見(jiàn)pET系統(tǒng)手冊(cè)；酵母培養(yǎng)使用YPD、MD、MM、BMGY、BMMY培養(yǎng)基，配方及培養(yǎng)條件見(jiàn) Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(cè)［15］。

1.2.2重組載體的構(gòu)建 利用引物EcoR I-F、Not I-R，通過(guò)PCR分別在基因兩端添加EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物和載體pPIC9k分別用EcoR I和Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物利用DNA純化試劑盒純化，連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌GM109感受態(tài)細(xì)胞，利用含有卡那霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證，片段大小正確后再進(jìn)行測(cè)序鑒定，最終獲得含有正確序列的重組質(zhì)粒pPIC9kkerD。

1.2.3重組畢赤酵母的構(gòu)建及平板篩選 將重組質(zhì)粒pPIC9k-kerD用Sac I線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化條件為：15 μL質(zhì)粒（500 ng/mL）加入到85 μL的SMD1168感受態(tài)細(xì)胞中，混合后移入預(yù)冷的2 mm的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置10 min。電壓1 500 v，電容25 μF，電阻200 Ω。電擊后加1 mL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液至電轉(zhuǎn)杯，混勻后將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，3 000 r/min離心2 min，去上清。加100 μL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液，涂布MD平板。利用MD平板篩選His+型（組氨酸缺陷回復(fù)突變型）重組菌株，再將得到的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到MM平板上篩選Mut+型（甲醇利用快速型）的重組菌株。將篩選到的Mut+型的重組菌株分別轉(zhuǎn)接到含有1、2、3、4和5 mg/mL的G418 YPD平板上，篩選到含有不同拷貝數(shù)目的基因的重組菌株，最后進(jìn)行特異性菌落PCR（引物EcoR I-F 和3' AOX）驗(yàn)證，篩選得到P. pastoris SMD1168-pPIC9k-kerD。

1.2.4重組畢赤酵母的搖瓶篩選 挑取上述篩選到的重組菌，接種到25 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h，5 000 r/min離心5 min，去上清，用50 mL的BMMY培養(yǎng)基重懸后置于500 mL錐形瓶中30℃，220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)。每24 h向培養(yǎng)基中添加無(wú)水甲醇，使其終濃度維持0.5％，每24 h取樣離心測(cè)定上清液中角蛋白酶的活性，從中篩選到表達(dá)角蛋白酶活性最高的一株重組菌株。

1.2.5角蛋白酶活力的測(cè)定 取兩只1.5 mL EP管，分為樣品組和對(duì)照組，分別加入150 μL pH9.0的50 mmol/L甘氨酸-NaOH緩沖液、50 μL的發(fā)酵上清液，對(duì)照組再加入200 μL的4％的三氯乙酸溶液混勻，都分別再加入100 μL的2.5％的角蛋白溶液，置于50℃金屬浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)20 min，向樣品組中加入200 μL的4％的三氯乙酸溶液混勻。10 000 r/min下離心5 min。分別取200 μL上清液于新的1.5 mL EP管，分別加入1 mL的0.4 mol/L的NaCO3溶液、200 μL的福林酚溶液，50℃金屬浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，冷卻至室溫，利用分光光度計(jì)測(cè)定660 nm處吸光值，以三氯乙酸使酶失活的樣品作對(duì)照，根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算酶活［16］。酶活的定義：50℃，pH9.0條件下，角蛋白酶催化角蛋白反應(yīng)過(guò)程中，1 min生成1 μg的酪氨酸所需的酶量為一個(gè)角蛋白酶酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.6重組角蛋白酶的純化與SDS-PAGE 發(fā)酵液8 000 r/min離心2 min，取上清，在攪拌過(guò)程中緩慢加入30％（質(zhì)量與體積比）的（NH4）2SO4，離心2 min，抽濾上清。使用AKTA PURE純化重組角蛋白酶，純化柱使用Hi Trap Phenyl FF（high sub），1 mL，A流動(dòng)相為1 mol/L（NH4）2SO4溶液，B流動(dòng)相為20 mmol/L pH7.0的Tris-HCl緩沖液，上樣量10 mL，流速1.0 mL /min，12％-100％ B梯度洗脫8 CV，100％ B洗脫5 CV。

使用12％聚丙烯酰胺凝膠預(yù)置膠對(duì)發(fā)酵樣品和純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7醇氧化酶AOX活力的測(cè)定 1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min下離心2 min，去上清，細(xì)胞沉淀用去離子水重懸洗滌兩次，離心，用50 mmol/L pH7.5的PBS溶液重懸，測(cè)定OD600 nm。取300 μL的重懸液于0℃機(jī)械破碎，加入700 μL PBS溶液，混勻，4℃，8 000 r/min 離心10 min，取上清，置于0℃。反應(yīng)體系共3 mL：100 mmol pH6.0的磷酸鉀緩沖液，4.3 μmol的苯酚，200 μmol的甲醇，1 μmol的APP，15 U的辣根過(guò)氧化物酶以及適量待測(cè)酶液。在37℃、500 nm，用UV2450分光光度計(jì)動(dòng)態(tài)測(cè)定無(wú)細(xì)胞酶液吸光度的改變，計(jì)算出醌的增加量，測(cè)定AOX醇氧化酶的活力［17］。酶活力單位定義為：1 mL細(xì)胞重懸液，在OD600=1時(shí)，37℃，pH6.0的條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol的過(guò)氧化氫（H2O2）所需的酶量，以U/mL表示。

1.2.8雙碳源混合流加發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化 將通過(guò)搖瓶篩選到的重組菌株轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD平板，挑取單菌落接種到含有100 mL的YPD培養(yǎng)基的1 L搖瓶中，置于搖床中30℃，220 r/min培養(yǎng)24 h作為種子液。將其接種到含有800 mL的BSM培養(yǎng)基的3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐（LiFlus GM BioTRON，Korea）中。以50％氨水和磷酸溶液控制pH5.5，30℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，通氣量2 vvm；當(dāng)甘油耗盡（DO迅速上升，且DO大于60％時(shí)），開(kāi)始以指數(shù)流加方式流加350 mL的50％（W/V）甘油（含12 mL/L PTM1），維持比生長(zhǎng)速率約0.18/h，并逐漸將攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)到1 000 r/min，通氣量調(diào)節(jié)到4 vvm。待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持體系中基質(zhì)匱乏狀態(tài)約1 h且DO大于60％后，開(kāi)始流加甲醇與山梨醇（甘露醇）（分別以W/W 20∶0.5、20∶1、20∶1.5、20∶2的混合方式），以反饋流加的方式維持培養(yǎng)基中的甲醇濃度在1.8％ （V/V）。從發(fā)酵開(kāi)始每隔12 h取一次樣，7 000 r/min離心1.5 min，分別取上清和菌體，測(cè)定菌體干重和上清酶活。

1.2.9重組角蛋白酶對(duì)羊毛的處理 取兩個(gè)50 mL錐形瓶，分別加入緩沖液3 mL，羊毛0.3 g，樣品組加1 mL純化的酶液，對(duì)照組加1 mL滅活（沸水浴20 min）的酶液，用塑料膜封口，50℃震蕩24 h。將羊毛取出晾干，拍照并做電子顯微鏡掃描。

2　結(jié)果

2.1重組載體構(gòu)建

將kerD基因插入畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPIC9k中，獲得重組載體pPIC9k-kerD。用EcoR I 和Not I雙酶切，得到兩個(gè)片段分別為9.3 kb和1.7 kb（圖1），測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明重組載體構(gòu)建成功。

圖 1 重組載體pPIC9k-kerD酶切驗(yàn)證

2.2重組畢赤酵母的篩選和誘導(dǎo)表達(dá)

先后利用MD、MM和YPD-G418平板，共篩選到14株含有不同拷貝數(shù)目的基因的Mut+型轉(zhuǎn)化子。用引物EcoR I-F和3'AOX1對(duì)這些轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增出的條帶與目的基因大小相符（圖2）。對(duì)這些轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明，誘導(dǎo)144 h時(shí)，從3 mg/mL G418的YPD平板上篩選的一株轉(zhuǎn)化子酶活最高（248 U/mL）。在3 L發(fā)酵罐上，對(duì)該轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)156 h時(shí)，菌體干重達(dá)到133.8 g/L，酶活1 094 U/mL。

圖2　重組子的菌落PCR

2.3重組角蛋白酶的SDS-PAGE及檢測(cè)

發(fā)酵罐72 h，發(fā)酵液上清經(jīng)SDS-PAGE分析，在38-49 kD之間有兩條特異性的條帶（圖3），且隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，分子量較小的條帶越來(lái)越清晰。將兩個(gè)條帶切下來(lái)，經(jīng)過(guò)MALDI-TOFMS/MS和N端測(cè)序分析，分子量較小的為成熟酶，而分子量較大的蛋白的前導(dǎo)肽沒(méi)有被剪切掉。

2.4重組角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

分別配制50 mmol/L pH4、pH5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH6、pH7磷酸緩沖液，pH8 Tris-HCl緩沖液，pH9、pH10、pH11甘氨酸-NaOH緩沖液，在50℃下測(cè)定重組角蛋白酶的最適pH為10（圖4）。將酶分別置于上述不同pH條件下，50℃保存60 min后測(cè)定酶活，以樣品在最適條件下的最高酶活作對(duì)照，分析重組角蛋白酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果（圖5）表明，重組角蛋白酶在pH5-9，經(jīng)過(guò)60 min仍保留40％的比酶活，在pH9條件下保存60 min，仍然有最大酶活的64.5％，pH 大于10后，酶活迅速降低，pH10下保存60 min，酶活只剩余初始酶活的25.5％。

分別在30、40、50、60和70℃下測(cè)定重組角蛋白酶的活性，測(cè)定重組角蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為60℃（圖6）。在pH9的緩沖體系下，將酶分別置于上述不同溫度下，每20 min測(cè)定一次酶活，以不同溫度下最初的酶活作對(duì)照，分析重組角蛋白酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果（圖7）表明重組角蛋白酶在50℃以下經(jīng)過(guò)100 min仍保留60％的比酶活，但當(dāng)溫度超過(guò)60℃時(shí)，比酶活會(huì)在20 min內(nèi)迅速下降到20％。

圖3　重組酵母表達(dá)角蛋白酶的SDS-PAGE

圖4　角蛋白酶的最適pH

圖5　角蛋白酶的pH穩(wěn)定性

圖6　角蛋白酶活性的最適溫度

圖7　角蛋白酶的熱穩(wěn)定性

2.5雙碳源發(fā)酵過(guò)程中醇氧化酶AOX的變化

本研究利用AOX酶（醇氧化酶）基因啟動(dòng)子調(diào)控角蛋白酶基因的表達(dá)，在非甲醇碳源條件（如甘油和葡萄糖）下，AOX啟動(dòng)子處于抑制狀態(tài)，角蛋白酶基因不表達(dá)［18］，而在甲醇做碳源時(shí)，角蛋白酶基因被誘導(dǎo)表達(dá)，AOX酶的變化直接反映了角蛋白酶基因的表達(dá)狀況（圖8）。在重組畢赤酵母表達(dá)角蛋白酶的發(fā)酵過(guò)程中，醇氧化酶的活性在60 h內(nèi)逐漸增加。60 h后，不同碳源混合發(fā)酵過(guò)程分別在不同的時(shí)間達(dá)到最大值，之后又逐漸下降，分別維持在不同的活性值。為了降低甲醇對(duì)細(xì)胞的毒害作用，同時(shí)又不抑制AOX啟動(dòng)子，采用AOX啟動(dòng)子的非抑制性碳源-山梨醇和甘露醇與甲醇混合流加發(fā)酵。甲醇與山梨醇以20∶1混合流加時(shí)，AOX活性最高（62.9 U/mL），比單流加甲醇提高32.2％；60 h后AOX活性最低（33.3 U/mL），比單流加甲醇提高162.2％。甲醇與甘露醇以20∶0.5混合流加時(shí)，AOX活性最高（69.4 U/mL），比單流加甲醇提高46.1％，60 h后AOX活性最低（46.5 U/mL），比單流加甲醇提高266.1％

圖8　甲醇與山梨醇（A）及甘露醇（B）混合流加中AOX酶活性變化

2.6雙碳源混合流加的發(fā)酵優(yōu)化

為了提高重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)角蛋白酶的產(chǎn)量，在3 L發(fā)酵罐中研究了雙碳源［甲醇與山梨醇（圖9-A和圖9-B）和甲醇與甘露醇（圖10-A和圖10-B）］混合流加對(duì)發(fā)酵過(guò)程中生物量和角蛋白酶產(chǎn)量的變化。當(dāng)甲醇與山梨醇以20∶0.5和20∶1（W/W）混合流加時(shí)，生物量和角蛋白酶產(chǎn)量都比單一流加甲醇有所提高，而甲醇與山梨醇以20∶1.5和20∶2 （W/W）混合流加時(shí)結(jié)果卻相反。其中甲醇與山梨醇以20∶1混合流加，發(fā)酵168 h，菌體干重達(dá)到166.2 g/L，角蛋白酶產(chǎn)量達(dá)到1 463 U/mL，比單一流加甲醇分別提高了22.9％和33.7％。

圖9　甲醇與山梨醇混合流加中菌體干重變化（A）及角蛋白酶產(chǎn)量變化（B）

甲醇與甘露醇混合流加時(shí)，20∶0.5、20∶1、20∶1.5的混合比例都促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中生物量和角蛋白酶產(chǎn)量的增加。甲醇與甘露醇以20∶0.5比例混合流加，發(fā)酵168 h，菌體干重達(dá)到134.4 g/L，角蛋白酶的產(chǎn)量達(dá)到2 048 U/mL，角蛋白酶產(chǎn)量比單流加甲醇提高了87.2％，菌體干重卻僅增加了0.4％。在一定程度上增加甘露醇的流加比例，角蛋白酶的產(chǎn)量比單一流加甲醇時(shí)有所提高，甲醇與甘露醇的混合比例為20∶2時(shí)，生物量和角蛋白酶的產(chǎn)量都有下降。

圖10　甲醇與甘露醇混合流加中菌體干重變化（A）及角蛋白酶產(chǎn)量變化（B）

2.7重組角蛋白酶對(duì)羊毛的處理效果分析

將羊毛分別用滅活后的角蛋白酶以及有活性的角蛋白酶進(jìn)行處理，如圖11所示，前者呈球狀，纖維集合體較為緊密，而后者呈餅狀，纖維集合體較疏松，表明經(jīng)重組角蛋白酶處理后的羊毛具備了一定的抗氈化作用。

分別對(duì)上述兩種羊毛進(jìn)行電子顯微鏡掃描，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果（圖12）發(fā)現(xiàn)，角蛋白酶處理過(guò)的羊毛纖維表面的鱗片層被破壞，表層邊緣斷裂，表面附著較多碎屑，說(shuō)明角蛋白酶能夠有效降解羊毛表面的鱗片層。

圖 11 重組角蛋白酶對(duì)羊毛的處理效果分析

圖12　羊毛纖維的電子顯微鏡掃描圖片

3　討論

pPIC9k攜帶的卡那霉素抗性賦予重組子G418抗性，而隨著目的基因在畢赤酵母基因組上的拷貝數(shù)目的增加，重組子對(duì)G418的抗性也逐漸增加，因此可以利用重組子對(duì)G418的抗性篩選到目的基因的拷貝數(shù)目不同的重組子。理論上講，目的基因的拷貝數(shù)目越高，目的產(chǎn)物的表達(dá)量越高，但是李兵等［19］的研究表明基因拷貝數(shù)對(duì)基因產(chǎn)物表達(dá)量的影響是無(wú)法預(yù)測(cè)的，高表達(dá)菌株的篩選應(yīng)以表達(dá)的蛋白量或酶活為標(biāo)準(zhǔn)。本研究最終篩選到抗3 mg/mL G418的重組子的產(chǎn)酶能力最好，根據(jù)Invitrogen公司的多拷貝畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推測(cè)目的基因的拷貝數(shù)在5個(gè)拷貝左右。

畢赤酵母通常被用來(lái)高密度發(fā)酵來(lái)提高外源蛋白的表達(dá)量，因此對(duì)篩選到的重組子進(jìn)行了3 L發(fā)酵罐誘導(dǎo)發(fā)酵，并利用疏水層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化。SDS等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明部分目的蛋白的前導(dǎo)肽沒(méi)有被剪切掉，而條帶的變化表明未正確折疊的目的蛋白在體外可以自身折疊形成成熟酶。就重組角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)來(lái)看，該重組酶反應(yīng)的pH的范圍較大，在其最適pH（pH10.0）上下變動(dòng)一個(gè)單位，酶活下降很小，可見(jiàn)該酶對(duì)pH值不是很敏感，反應(yīng)過(guò)程中pH在一定程度上變化不會(huì)對(duì)該酶的酶活造成大的影響。從pH穩(wěn)定性上來(lái)看，該酶在適當(dāng)?shù)膲A性環(huán)境下放置1 h仍然可以保留多半的酶活。另外從溫度對(duì)重組酶的影響上來(lái)看，該酶降解角蛋白適宜在高溫條件下（50℃）進(jìn)行，而且酶活在一定溫度范圍內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間放置損失很少。羊毛、羽毛等角蛋白的降解通常在堿性高溫的環(huán)境進(jìn)行，因此重組角蛋白酶十分適合用于工業(yè)中角蛋白的降解。

誘導(dǎo)階段，重組P. pastoris以甲醇為唯一碳源和能源表達(dá)外源目的蛋白時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)是一對(duì)十分尖銳的矛盾，共同爭(zhēng)奪碳源和能源，導(dǎo)致外源基因表達(dá)效率低下［20］。山梨醇和甘露醇作為已知的對(duì)AOX1啟動(dòng)子沒(méi)有抑制作用的碳源［21，22］，通常被用作額外的碳源在誘導(dǎo)階段和甲醇一起流加，不僅可以弱化甲醛異化供能途徑，抑制毒副產(chǎn)物甲醛的生成積累，同時(shí)降低體系中甲醇對(duì)細(xì)胞的壓力，提高AOX1胞內(nèi)啟動(dòng)子的表達(dá)效率，進(jìn)一步提高了目的產(chǎn)物的產(chǎn)量［23，24］。本實(shí)驗(yàn)中，采用甲醇與山梨醇和甘露醇混合流加的策略，從兩種碳源的流加效果上來(lái)看，適量的山梨醇和甘露醇與甲醇混合流加都能在一定程度上促進(jìn)膠蛋白酶產(chǎn)量的提高。其中甲醇與甘露醇以適當(dāng)?shù)谋壤旌狭骷訒r(shí)對(duì)角蛋白酶的產(chǎn)量的提高影響最大。從結(jié)果上來(lái)看，雖然山梨醇與甘露醇為同分異構(gòu)體，但是在重組P. pastoris發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶的過(guò)程中的影響卻不同，從發(fā)酵過(guò)程中醇氧化酶的活性變化來(lái)看，兩種流加方式中醇氧化酶活性的變化趨勢(shì)是相似的，但區(qū)別在于誘導(dǎo)表達(dá)后期，流加甘露醇時(shí)，醇氧化酶的活性一直維持在較高的水平，菌體對(duì)甲醇的利用效率更高，更有利于角蛋白酶的表達(dá)，因此甘露醇更適合與甲醇混合流加，來(lái)降低甲醇對(duì)菌體的毒害作用，提高角蛋白酶的產(chǎn)量。

在實(shí)際應(yīng)用中，受羊毛纖維表面鱗片層的結(jié)構(gòu)影響［25］，羊毛經(jīng)機(jī)械力反復(fù)作用，會(huì)出現(xiàn)纖維集合體逐漸收縮成球的氈化現(xiàn)象，導(dǎo)致羊毛織物在使用過(guò)程中發(fā)生變形。在本研究中，純化的角蛋白酶作用于羊毛使其鱗片層被破壞，導(dǎo)致羊毛的氈化率下降，進(jìn)一步證實(shí)了本研究獲得的重組角蛋白酶在紡織等行業(yè)的應(yīng)用價(jià)值。

4　結(jié)論

本研究成功實(shí)現(xiàn)了嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌角蛋白酶基因在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)，純化的角蛋白酶對(duì)羊毛鱗片層有顯著的降解作用，可以用來(lái)改性羊毛，降低氈化率。角蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明，該酶為高溫堿性蛋白酶。利用甲醇和甘露醇雙碳源混合流加策略發(fā)酵，角蛋白酶的產(chǎn)量達(dá)到2 048 U/mL，比單一流加甲醇提高了87.2％，為目前應(yīng)用酵母生產(chǎn)角蛋白酶報(bào)道中的最高水平。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Expression of Keratinase Gene Derived from Stenotrophomonas maltophilia in Pichia pastoris

LI Guang-lei1ZHANG Juan1，2FANG Zhen1，2LONG Ming-xing1DU Guo-cheng1，2CHEN Jian2，3
（1. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122；3. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

kerD，a keratinase gene derived from Stenotrophomonas maltophilia BBE11-1，was optimized by Pichia codon，and then the recombinant vector pPIC9k-kerD was constructed；the recombinant vector was integrated into the Pichia SMD1168 genome，and Mut+recons were screened；recons resisting G418 were induced by methanol，and the best recombinant strain with the highest enzyme production was screened. The recombinant enzyme was purified and detected by SDS-PAGE，while part of the enzymatic properties was investigated. We found that the optimal reaction pH of recombinant enzyme was 10，and the optimal reaction temperature was 60℃. In order to further increase the yield of recombinant enzyme，multi-carbon source feeding strategy，using methanol mixed with sorbitol and mannitol as carbon source，was used to optimize the formation of producing keratinase by the recombinant strain. The results showed that when mixing ratio of methanol to mannitol was 20∶0.5，fermenting 168 h，production of recombinant keratinase reached 2 048 U/mL，which was improved 87.2％ from single methanol carbon.

keratinase；Pichia pastoris；enzymatic properties；double carbon source；optimization of fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.023

2016-02-03

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2011AA100905），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470160），中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目（114957）

李光磊，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：leegl09@163.com

陳堅(jiān)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品生物技術(shù)和生化工程；E-mail：jchen@jiangnan.edu.cn張娟，女，博士，研究方向：食品微生物生理學(xué)與生物化學(xué)及食品酶制劑的發(fā)酵工學(xué)；E-mail：zhangj@jiangnan.edu.cn