馬冬梅鄧國成白俊杰江小燕曹婷婷蔡磊

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶魚類選育與養(yǎng)殖重點開放實驗室，廣州 510380；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070）

大口黑鱸潰瘍綜合征病毒MCP基因的原核表達及重組蛋白的免疫效果初步分析

馬冬梅1，2鄧國成1白俊杰1，2江小燕1曹婷婷1蔡磊1

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶魚類選育與養(yǎng)殖重點開放實驗室，廣州 510380；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070）

為了預防近年來流行于廣東省養(yǎng)殖大口黑鱸（Micropterus salmoides）中的病毒性潰瘍綜合征，以大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（Largemouth bass ulcerative syndrome virus，以下簡稱 LBUSV）的主要衣殼蛋白（MCP）作為目標抗原蛋白，將MCP基因開放閱讀框插入到pBV220載體中，轉化大腸桿菌DH5α，構建重組表達MCP蛋白的工程菌。重組菌經(jīng)過42℃溫度誘導和SDSPAGE電泳，檢測到在分子量51 kD處有一條特異表達蛋白帶，重組蛋白約占重組菌體總蛋白的30％。重組MCP蛋白經(jīng)洗滌、純化、溶解、復性和透析后純度達90％以上。將純化后的重組蛋白與不完全弗氏佐劑混合、乳化后，免疫大口黑鱸，然后進行感染實驗，感染后20 d疫苗保護率最高達67.7％。結果表明，該病毒MCP蛋白具有一定的免疫原性，可以作為制作重組疫苗的候選蛋白。

大口黑鱸；潰瘍綜合征病毒；主要衣殼蛋白；原核表達；免疫效果

大口黑鱸（Micropterus salmoides）因具有生長快、養(yǎng)殖周期短、肉質細致鮮美和容易起捕等特點，目前已成為中國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖品種［1，2］。根據(jù)中國《2014年漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計，2013年中國大口黑鱸的產(chǎn)量約為34萬t。但從2008年起，每年6-10月期間，在廣東省的養(yǎng)殖大口黑鱸中都會流行病毒性潰瘍綜合征表現(xiàn)為皮膚和肌肉壞死潰爛，并伴有脾臟和腎臟變大等，病魚死亡率最高達60％，該病給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失［3，4］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該病毒性潰瘍綜合征是由一種虹彩病毒科（Iridoviridae）蛙病毒屬（Ranavirus）的病毒感染引起的［5］。目前，已對該病毒建立了快速的檢測方法［6-8］，但還沒有有效的治療手段。

魚類的虹彩病毒具有直徑120-300 nm 的二十面體衣殼結構特征［9］，衣殼是包圍在病毒核酸外面的蛋白質外殼，虹彩病毒的主要衣殼蛋白（major capsid protein，MCP）分子量約為50 kD，占病毒總蛋白的40％-45％［10］。衣殼蛋白具有保護病毒核酸和介導病毒與宿主細胞結合的作用，一般具有該種病毒特異的表面抗原，可刺激宿主的機體產(chǎn)生病毒抗原免疫應答［11，12］。疫苗免疫是預防魚類流行疾病發(fā)生的一種有效方法，傳統(tǒng)的魚用疫苗以獲取方法來分有活疫苗、滅活疫苗和化學疫苗［13］。新型的用基因工程疫苗（synthetic peptide vaccine）是利用DNA重組技術方法，將病毒的抗原基因片段定向插入載體，導入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞等宿主中，使之重組表達，經(jīng)純化后而制得的疫苗［14，15］?；蚬こ桃呙缇哂兄苽淙菀?、可大量生產(chǎn)、穩(wěn)定、易保存、副反應少、使用安全等優(yōu)點，但存在免疫原性不足的缺點［13，14］。以魚類虹彩病毒MCP作為保護性抗原的基因工程疫苗已有大量的研究報道，但在實際應用中還存在爭議，如在國內外對虹彩病毒的研究中都有發(fā)現(xiàn)MCP是魚虹彩病毒的保護性抗原，具有一定的免疫保護效果［16，17］，但同時也有文獻報道MCP是一種無效抗原，盡管具有較強的免疫原性，但并不能介導有效地免疫保護［18，19］。

為了預防近年來流行的病毒性大口黑鱸潰瘍綜合征，本研究利用原核表達的方法，構建重組表達該致病病毒MCP蛋白的重組工程菌。重組菌表達的重組蛋白經(jīng)過純化、復性和濃縮，與不完全弗氏佐劑混勻乳化后免疫大口黑鱸，并檢測LBUSV 的MCP蛋白免疫保護效果，旨在為該病毒病疫苗的開發(fā)提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

實驗用大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（Largemouth bass ulcerative syndrome virus，LBUSV）由珠江水產(chǎn)研究所生物技術實驗室保存。感染實驗用的大口黑鱸來自珠江水產(chǎn)研究所良種基地，平均體質量約為50 g，經(jīng)PCR檢測LBUSV病毒［6］為陰性，認為是健康魚用于實驗。

1.2方法

1.2.1大口黑鱸潰瘍綜合征病毒MCP重組表達工程菌的構建 根據(jù)LBUSV MCP基因的1 392 bp的ORF設計引物MCPEP1：5'-CGGAATTCATGTCTTCT GTTACGGGTTC-3'和MCPEP2：5'-CGCGGATCCTTA CAGGATGGGGAAACCCA-3'，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切并插入pBV220原核表達載體，轉化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過篩選得到陽性克隆，在ABI 3730自動測序儀上進行測序。

1.2.2MCP重組蛋白的表達和純化 將測序結果正確的陽性重組大腸桿菌接種在LB培養(yǎng)基中，37℃200 r/min 培養(yǎng)至OD600值達0.4-0.5時，將菌液快速升溫至42℃誘導重組蛋白表達，4 h后停止誘導，離心以收集細菌菌體，超聲波破碎后，12 000 r/min離心10 min分別取上清液和沉淀物，用12％ SDS-PAGE膠電泳、考馬斯亮藍染色，檢測。包涵體先用0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.5）洗滌1次，含2 mo/L尿素的Tris-HCl（pH8.5）洗滌2次，再用含有4 mol/L 尿素的Tris-HCl（pH8.5）各洗滌1次，最后用8 mol/L 尿素溶解包涵體。將溶解后的蛋白溶液裝入透析袋進行尿素梯度濃度透析以去除尿素，并用聚乙二醇6000濃縮后，用12％ SDS-PAGE電泳檢測，并用Bradford 法測定純化后的蛋白濃度［20］。

1.2.3免疫保護實驗 把健康的大口黑鱸隨機分為4組，每組35尾，其中3個實驗組，1個對照組。將純化后的重組MCP蛋白與不完全弗氏佐劑混合并乳化后，實驗魚腹腔注射進行免疫，3個實驗組的免疫劑量分別為每尾魚50 μg/200 μL、100 μg/200 μL和150 μg/200 μL，對照組腹腔注射0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.5）。免疫后分別放入獨立已消毒的5 m3的水泥池中，實驗過程中每天早晚各投喂一次飼料和吸污一次，水溫控制在28℃左右，免疫30 d后，實驗組和對照組全部進行攻毒實驗，每尾背鰭肌肉注射劑量為102.5LD50/0.2 mL，每天觀察記錄各組魚的死亡情況，20 d后計算免疫實驗保護效率：

將發(fā)病的死魚進行PCR檢測，以確定死亡原因。

2　結果

2.1MCP蛋白的誘導表達

對測序結果證明插入正確的重組工程菌進行誘導表達，溫度誘導后的重組菌經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后，在分子量約51 kD處檢測到一條特異表達蛋白帶，與預期蛋白大小一致，42℃溫度誘導4 h該工程菌特異表達的重組蛋白約占菌體總蛋白量的30％。將誘導后的重組菌超聲波破碎、離心后，分別取上清液和沉淀物進行SDS-PAGE電泳檢測，結果（圖1）表明，工程菌表達的重組蛋白帶主要是以包涵體的形式出現(xiàn)在沉淀物中，而上清液中基本無此特異條帶的出現(xiàn)。

圖1　SDS-PAGE檢測重組主要衣殼蛋白（MCP）的表達

2.2MCP蛋白的純化

將表達MCP蛋白的重組工程菌超聲波破碎、離心得到的沉淀即為包涵體，優(yōu)化洗滌方法，用尿素洗滌沉淀中的包涵體純化MCP蛋白，然后用8 mol/L尿素溶解包涵體，并透析復性濃縮。純化后的MCP蛋白占溶液中總蛋白濃度的90％（圖2）。用Bradford 法測定蛋白濃度，每升LB培養(yǎng)基可生產(chǎn)純化的重組MCP蛋白約86.7 mg。

圖2　SDS-PAGE檢測重組MCP蛋白的純化

圖3　累積死亡曲線

2.3MCP蛋白免疫保護效果

將純化后的MCP蛋白以3個不同的濃度與不完全弗氏佐劑乳化后免疫大口黑鱸，30 d后進行攻毒實驗，檢測免疫保護效果。結果（圖3）表明，攻毒后第6天開始，除150 μg組外，各組均有魚開始發(fā)病死亡，而150 μg組是在攻毒后第7天開始出現(xiàn)發(fā)病死亡；第7-9天，除150 μg組外，各組死亡率加劇，對照組累積死亡率最高，達94.3％，50 μg組和100 μg組分別為73.5％和42.9％，而150 μg組是在攻后第10天出現(xiàn)死亡加劇，累積死亡率為29％；對照組在第10天累積死亡率達到100％，而100 μg組和150 μg組在第11天累積死亡率達到峰值，分別為57.1％和32.3％，50 μg組在第12天累積死亡率為85.3％，從第13天開始各組再無實驗魚死亡。對照組與免疫組相比死亡速度最快、死亡率最高，免疫劑量達150 μg的實驗組免疫效果最好，攻毒15 d，保護率達67.7％，比100 μg組（保護率42.9％）和50 μg組（保護率11.8％）的免疫效果顯著提高（表1）。以每尾魚50 g計算，MCP蛋白的免疫劑量要在3 μg/g魚以上才能達到較好的免疫效果。經(jīng)PCR檢測，攻毒后的發(fā)病魚均感染了LBUSV（圖4）。

表1　MCP蛋白免疫效果分析

圖4　PCR檢測發(fā)病魚電泳結果

3　討論

人類基因工程疫苗已有深入的研究和廣泛的應用［21，22］，在魚類中重組蛋白疫苗的開發(fā)還一直處于研究階段，但也有多種漁用重組蛋白疫苗和DNA疫苗等新型疫苗得到研究和開發(fā)［23，24］，如IPNV重組VP2亞單位疫苗［25］、VHSV重組G蛋白亞單位和AHNV重組MCP重組［26］蛋白疫苗的研制和開發(fā)，魚類基因工程疫苗有著廣闊的發(fā)展前景，是魚類疫苗發(fā)展的重要方向［27］。選擇免疫原性好的目標蛋白對于成功開發(fā)重組蛋白疫苗至關重要，病毒的衣殼蛋白因具有較強的抗原特性，成為魚類重組病毒蛋白疫苗開發(fā)和制備的首選優(yōu)良候選目標蛋白。

關于重組虹彩病毒MCP疫苗免疫效果的研究結果很不一致，有的研究發(fā)現(xiàn)MCP是魚虹彩病毒的保護性抗原，具有一定的免疫保護效果，但有研究卻認為MCP是一種無效抗原，盡管具有較強的免疫原性，但并不能介導有效的免疫保護［16-19］。本研究表明，大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（LBUSV）的主要衣殼蛋白MCP作為免疫蛋白源對大口黑鱸進行免疫具有一定的免疫效果。與本研究相似，重組虹彩病毒MCP疫苗的研究表明，將鱖傳染性脾腎壞死病毒重組MCP免疫鱖，再用該病毒攻毒后，每尾魚（體質量40-50 g）注射50 μg重組MCP蛋白組免疫保護效率最高，達64.3％［29，30］。用重組大西洋鱈魚神經(jīng)壞死病毒（SJNNV）衣殼蛋白免疫大西洋鱈魚（平均體質量約為2.2 g），攻毒后10 μg組比50 μg組免疫效果好，免疫保護效率最高達80％以上［31］。用赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因重組蛋白制備的疫苗免疫軍曹魚，經(jīng)過3次免疫和一次免疫，相對保護率最高分別為56％和54％，但濃度50 μg組的免疫效果比10 μg和100 μg的免疫效果好［32］。以上研究表明重組病毒衣殼蛋白的免疫保護效率約在50％-80％之間。與本研究結果相比，以LBUSV的主要衣殼蛋白MCP作為免疫蛋白源對大口黑鱸進行免疫，每尾魚（平均體質量約為50 g）注射150 μg MCP蛋白免疫1個月，免疫保護率為67.7％，約每克大口黑鱸需注射3 μg重組MCP蛋白即可產(chǎn)生免疫保護效果，免疫原蛋白需求量高于鱖傳染性脾腎壞死病毒重組MCP疫苗［29，31］，低于大西洋鱈魚重組神經(jīng)壞死病毒（SJNNV）重組MCP疫苗，免疫原蛋白需求量可能與魚的種類和魚的體質量有關。

在用大腸桿菌表達重組MCP蛋白時，該研究首先選用的是pET-30c（+）（Novagen公司）載體構建了MCP基因的表達質粒，經(jīng)誘導后得到分子量約60 kD的帶組氨酸標簽的重組表達蛋白，但在純化時，該蛋白不能與Ni親合純化柱結合，可能是由于蛋白在復性時發(fā)生了異構化，組氨酸標簽不能很好地暴露在蛋白表面，或形成了細小的沉淀［33］，所以未能與Ni親合純化柱有效結合。將MCP基因插入用pBV220載體，進行溫度誘導得到了51 kD大小的重組蛋白，去掉了用pET-30c（+）載體表達的組氨酸標簽，用傳統(tǒng)的尿素洗滌的方法得到了純化的MCP蛋白［34］，純度達90％。該方法與Ni親合純化柱相比也有操作簡單，成本低，純化速度快等優(yōu)點，更適合大量生產(chǎn)疫苗的需求。

4　結論

將大口黑鱸潰瘍綜合征病毒的MCP基因經(jīng)過改造后，插入到原核表達載體pBV220，構建重組表達MCP蛋白的工程菌。工程菌經(jīng)過溫度誘導，表達的重組MCP蛋白經(jīng)過純化和復性后與不完全弗氏佐劑乳化后，免疫大口黑鱸，然后進行感染實驗，20 d后計算疫苗保護率最高達67.7％。結果表明，該病毒MCP蛋白具有一定的免疫原性，可以作為制作重組疫苗的候選蛋白。

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（責任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression of MCP Gene from Largemouth Bass Ulcerative Syndrome Virus and the Immune Effect Analysis of Recombinant Protein

MA Dong-mei1，2DENG Guo-cheng1BAI Jun-jie1，2JIANG Xiao-yan1CAO Ting-ting1CAI Lei1
（1. Key Laboratory of Tropical ＆amp; Subtropical Fishery Resource Application ＆amp; Cultivation（Ministry of Agriculture），Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380；2. Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province，Wuhan 430070）

For preventing the outbreak of viral ulcerative syndrome in largemouth bass（Micropterus salmoides）in Guangdong province，the ORF of major capsid protein（MCP）gene，as target antigen protein gene，from largemouth bass ulcerative syndrome virus（LBUSV）was inserted in vector pBV220，then transformed into Escherichia coli DH5α，and the recombinant engineering bacterium for expressing MCP was constructed. Following 42℃ temperature inducement and SDS-PAGE analysis，the recombinant bacterium was detected to produce a special expression protein with molecular weight about 51 kD，and the proportion of recombinant MCP protein was nearly 30％ of total bacterial protein. After washed，purified，dissolved，renatured and dialyzed，the purity of the recombinant protein reached over 90％. The purified protein was mixed and emulsified with incomplete Freund's adjuvant，then was injected in largemouth bass as vaccine. The immunized fish were challenged with LBUSV，and the highest relative percentage of survival reached 67.7％ after 20 days. The results indicate that the MCP of LBUSV has the immunogenicity and can be selected as candidate protein for recombinant vaccine.

largemouth bass（Micropterus salmoides）；ulcerative syndrome virus；major capsid protein；prokaryotic expression；immune effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.021

2015-11-04

國家自然科學基金項目（31001107），“948”計劃重點項目（2011-G12），國家科技支撐計劃（2012BAD26B03），廣東省省級科技計劃項目（2015A020209035）

馬冬梅，女，博士，副研究員，研究方向：魚類遺傳育種；E-mail：madongmei2003@163.com

白俊杰，男，研究員，研究方向：水產(chǎn)動物遺傳育種及生物技術；E-mail：jjbai@163.net