曹繼東劉俊李遂焰

（1. 西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031；2. 中國科學院微生物研究所 植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101）

基因組水平預測稻瘟菌分泌蛋白組及富集分析

曹繼東1，2劉俊2李遂焰1

（1. 西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031；2. 中國科學院微生物研究所 植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101）

稻瘟菌分泌蛋白在稻瘟菌入侵植物過程中發(fā)揮著重要的作用。這些分泌蛋白中有很多是效應(yīng)蛋白，這些效應(yīng)蛋白可以干擾寄主的抗性、抑制寄主免疫反應(yīng)。因此，對稻瘟菌分泌蛋白組的預測及功能分析就顯得十分必要，也是目前植物和微生物分子互作研究領(lǐng)域的熱點。使用SignalP、TMHMM及SecretomeP等軟件，完成稻瘟菌分泌蛋白組的預測。同時，對含信號肽的經(jīng)典分泌蛋白進行了GO功能富集、KEGG通路分析、結(jié)構(gòu)域統(tǒng)計以及可降解植物成分的經(jīng)典分泌蛋白預測等分析。結(jié)果顯示，稻瘟菌含有約789個分泌蛋白，其長度多集中在100-500 aa；GO功能分析發(fā)現(xiàn)，這些分泌蛋白多富集在分泌途徑及宿主互作中；KEGG分析顯示，分泌蛋白在糖代謝途徑中發(fā)揮著重要作用；大規(guī)模篩選預測到156個分泌蛋白具有降解植物細胞壁等成分的功能；同時還發(fā)現(xiàn)稻瘟菌中有可能存在大量不含信號肽的非經(jīng)典分泌蛋白。通過設(shè)計的生物信息學流程，實現(xiàn)了稻瘟菌分泌蛋白組的預測；預測出經(jīng)典分泌蛋白具有可降解植物細胞壁等成分以及參與糖代謝途徑的功能；稻瘟菌中存在大量的無信號肽的非經(jīng)典分泌蛋白。

稻瘟菌；分泌蛋白組；分泌蛋白；糖代謝

稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）能夠在水稻生長的任何時期對水稻的不同部位進行侵染，造成水稻大量減產(chǎn)［1］。稻瘟菌所引起的稻瘟病，現(xiàn)已在全球范圍蔓延，如中國、美國、韓國和日本等地，直接威脅世界糧食安全［1-5］。稻瘟菌全基因組測序的完成及序列公布［2-4］，使得對稻瘟菌相關(guān)的研究更加深入，也更有利于植物和稻瘟菌互作的分子機制研究。在稻瘟菌對植物的侵染過程中，眾多分泌蛋白參與其中，發(fā)揮著重要的作用。例如，GASl 和GAS2是稻瘟菌附著胞形成中特異性表達的兩個基因，可以編碼小型蛋白，并分泌到細胞質(zhì)中［6］。GASl或者GAS2基因的缺失，都會降低稻瘟菌附著胞的形成能力以及降低該菌的侵染能力［6］。胞外幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBPl的研究表明，該蛋白含有兩個幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在稻瘟菌感知外界環(huán)境及附著胞形成過程中具有重要的作用［7］。

分泌蛋白組（secretome）一詞，在對枯草桿菌分泌蛋白的研究中首次提出［8］。分泌蛋白普遍存在于動植物中，功能多種多樣，具有免疫、獲取營養(yǎng)、重塑細胞壁環(huán)境及信號感知等功能［9］。通常情況下，含有信號肽并且通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑分泌的蛋白質(zhì)集合，稱之為分泌蛋白組［9，10］。相應(yīng)的蛋白稱之為經(jīng)典分泌蛋白（classical secreted protein）［9］。然而在高等生物中，如在擬南芥全基因組的研究中發(fā)現(xiàn)，預測18％的蛋白質(zhì)為可分泌蛋白［10］，但大多數(shù)預測的分泌蛋白質(zhì)并不具備經(jīng)典信號肽［10，11］。這些不具備經(jīng)典信號肽的可分泌蛋白被稱為無信號肽分泌蛋白（leaderless secreted proteins）［11］。

隨著多種真菌基因組測序的完成，越來越多的真菌分泌蛋白組以實驗或者計算機預測的方式獲得［12］。如黑曲霉（Aspergillus niger）［13］、白色念珠菌（Candida albicans）［14］、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）［15］、玉米黑粉菌（Ustilago maydis）［16］、白腐菌（Phanerochaete chrysosporium）［17］以及禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）［18］等真菌的分泌蛋白組都已有報道。雖已有文章報道預測的稻瘟菌分泌蛋白組［19，20］，但是基本只是獲得經(jīng)典分泌蛋白的數(shù)目。已報道的稻瘟菌分泌蛋白組預測文章，未完成經(jīng)典分泌蛋白大數(shù)據(jù)集的相關(guān)分析，如GO功能富集、KEGG代謝通路分析。另外，為了深入的研究稻瘟菌分泌蛋白與植物互作的關(guān)系，從稻瘟菌全基因組水平出發(fā)，獲得可降解植物細胞壁等成分的經(jīng)典分泌蛋白是十分必要的。值得一提的是，無信號肽分泌蛋白現(xiàn)在越來越被研究者所重視。但是關(guān)于稻瘟菌無信號肽分泌蛋白的預測，目前還沒有相關(guān)的報道。

有鑒于此，本研究綜合使用SignalP、TMHMM、big-PI Predictor、Protcomp和SecretomeP多種生物信息學分析軟件，開發(fā)了新的分泌蛋白預測流程，對稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白和無信號肽分泌蛋白進行了重新定義。同時，編寫了Python腳本程序進行信息提取以及相關(guān)結(jié)構(gòu)域數(shù)目的統(tǒng)計。在此基礎(chǔ)上，進一步完成了對經(jīng)典分泌蛋白的GO功能富集、KEGG通路以及結(jié)構(gòu)域分析。同時，利用從稻瘟菌全基因組注釋中所獲取的眾多信息，進行大規(guī)模的篩選，對有可能降解植物成分的稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白進行預測，期望為進一步開展該菌分泌蛋白的功能研究以及研究水稻-稻瘟菌互作的分子機制提供有利的借鑒。

1　材料與方法

1.1材料

稻瘟菌的全蛋白組序列來源于Broad institute數(shù)據(jù)庫（http：//www.broadinstitute.org/annotation/geno me/）。稻瘟菌本地blast比對數(shù)據(jù)庫來自于KOBAS數(shù)據(jù)源（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/site/download_fas ta.jsp）。

本地化blast版本號為blast-2.2.30+，下載于NCBI（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov）。獨立SignalP 4.1軟件包下載自（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。獨立TMHMM-2.0軟件包下載自（http：//www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）。big-PI Predictor在線軟件（http：//mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html）。

ProtComp 9.0在線軟件（http：//linux1.softberry. com/berry.phtml？topic=protcompan＆amp;group=programs＆amp;su bgroup=proloc）。SecretomeP 2.0在線軟件（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）。

1.2方法

1.2.1分泌蛋白確定方法 經(jīng)典的分泌蛋白一般具有以下幾個特征：具有信號肽、無跨膜結(jié)構(gòu)域（N端40個氨基酸中含一個跨膜結(jié)構(gòu)域除外）、無GPI錨定位點以及不含線粒體、葉綠體等細胞器的定位信號［11］。

本研究使用SignalP軟件［21］、TMHMM軟件［22］、big-PI Predictor軟件［23］和Protcomp軟件進行稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白的預測。首先使用SignalP及TMHMM軟件，對經(jīng)典分泌蛋白信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域進行大規(guī)模篩選。然后，使用big-PI Predictor軟件［23］對具有信號肽且含有0或1個跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進行GPI錨定位點預測。最后，使用Protcomp軟件完成對蛋白的亞細胞定位預測。經(jīng)過上述4步的嚴格篩選，得到蛋白基本可認為是經(jīng)典分泌蛋白。

稻瘟菌無信號肽分泌蛋白的預測，使用最新的SecretomeP 2.0軟件［24］進行篩選。篩選標準為：不具備信號肽，SecP值大于等于0.5。編寫相應(yīng)的Python腳本進行信息的提取和統(tǒng)計。

1.2.2GO功能富集、KEGG通路分析及相關(guān)統(tǒng)計 （1）經(jīng)典分泌蛋白的GO功能分析。首先，使用Python腳本語言提取經(jīng)典分泌蛋白的氨基酸序列。然后，使用在線軟件agriGO（http：//bioinfo.cau.edu. cn/agriGO/analysis.php）對經(jīng)典分泌蛋白進行GO功能富集分析，選取Fisher統(tǒng)計模型進行計算。

（2）對經(jīng)典分泌蛋白進行KEGG代謝通路分析。首先構(gòu)建本地化的blast平臺，blast版本號為blast-2.2.30+。然后將稻瘟菌比對數(shù)據(jù)庫格式化。使用blastp模式將分泌蛋白序列比對到稻瘟菌數(shù)據(jù)庫中，E value設(shè)置為10-5。將blast比對結(jié)果導入到KOBAS軟件（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do），進行KEGG差異通路分析。編寫Python程序，提取相關(guān)信息并進行差異倍數(shù)計算。

稻瘟菌全基因組注釋信息以及結(jié)構(gòu)域信息來源于Broad institute數(shù)據(jù)庫。編寫Python腳本程序進行提取、相關(guān)統(tǒng)計以及大規(guī)模篩選，從而完成可降解植物細胞壁等成分的分泌蛋白預測。通過編寫Python腳本，進行結(jié)構(gòu)域的提取和統(tǒng)計。

1.2.3原位（in planta）表達譜驗證 稻瘟菌分泌蛋白原位表達譜數(shù)據(jù)整合自Chen等［25］的研究。本實驗通過提取原位分泌蛋白表達譜數(shù)據(jù)并與本研究所得假定分泌蛋白進行驗證，進一步確定假定分泌蛋白的原位表達情況。

2　結(jié)果

2.1稻瘟菌中經(jīng)典分泌蛋白的預測

稻瘟菌中共含有11 069條蛋白序列。首先使用本地化的SignalP 4.1軟件對上述蛋白序列進行信號肽預測。SignalP軟件可以對氨基酸序列的信號肽存在情況以及信號肽切割位點進行預測。為了保持軟件預測敏感性的同時避免預測錯誤，軟件D值采用系統(tǒng)默認。結(jié)果（圖1）表明，1 576條蛋白含有N端經(jīng)典信號肽，約占全部序列的14.24％。

使用TMHMM-2.0軟件對具有N端經(jīng)典信號肽的蛋白序列進行跨結(jié)構(gòu)域預測，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)有1 278條蛋白序列不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，217條蛋白含有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，30條蛋白序列含有2個跨膜結(jié)構(gòu)域，51條蛋白序列含有3個及3個以上的跨膜結(jié)構(gòu)域，分別占蛋白總數(shù)（1 576條）的81％、14％、2％和3％。由于TMHMM 程序可能無法將信號肽序列和跨膜結(jié)構(gòu)域區(qū)分開來［17，18］，因此將含有一個跨膜結(jié)構(gòu)域及不含有跨膜結(jié)構(gòu)域的序列初步認定為經(jīng)典分泌蛋白，兩部分蛋白共計1 495條。利用big-PI Predictor軟件對上述1 495條蛋白序列進行GPI脂錨定蛋白預測，結(jié)果（圖1）顯示，1 410個蛋白不具備GPI脂錨定位點，85個蛋白具有脂錨定位點。

Protcomp軟件對上述1 410個不具GPI脂錨定位點的蛋白質(zhì)進行亞細胞定位預測。結(jié)果（表1）表明，共有789個蛋白屬于胞外分泌蛋白，其它621個蛋白并不分泌到胞外。621個不分泌到胞外的蛋白中，最多的是轉(zhuǎn)運到線粒體（16％），其次是細胞質(zhì)膜（10％）、溶酶體（5％）、細胞質(zhì)（5％）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（3％）。另外轉(zhuǎn)運到高爾基體、過氧化物酶體、細胞核和液泡的蛋白占5％，共計77個。

通過上述的生物信息學流程分析，最終在稻瘟菌中獲得了789個經(jīng)典分泌蛋白（圖1）。通過對789個蛋白的氨基酸數(shù)目進行統(tǒng)計，結(jié)果（圖3）表明更多的經(jīng)典分泌蛋白長度集中于100-500 aa，占經(jīng)典分泌蛋白總量的79.84％。通過對數(shù)據(jù)的指數(shù)擬合（R2=0.6）顯示，隨著經(jīng)典分泌蛋白長度的增加，其蛋白數(shù)目越來越少。由此可以推測，大多數(shù)的經(jīng)典分泌蛋白質(zhì)屬于小型蛋白，所含氨基酸數(shù)目一般較少。

圖1　稻瘟菌分泌蛋白組預測分析流程

圖2　1 576個含有信號肽的蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果

圖3　稻瘟菌789個經(jīng)典分泌蛋白氨基酸長度分析

表1　1 410個不具GPI脂錨定位點的蛋白質(zhì)亞細胞定位預測

2.2稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白GO功能富集及KEGG通路分析

獲取稻瘟菌789個經(jīng)典分泌蛋白的基因號，使用AgriGO軟件進行GO功能富集分析，設(shè)置稻瘟菌全基因組作為背景值，選取Fisher統(tǒng)計模型進行計算。通過對789個經(jīng)典分泌蛋白的功能富集（圖4）發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)多參與到分泌途徑以及和宿主的相互作用中。由此可知，經(jīng)典分泌蛋白在稻瘟菌和宿主互作過程中發(fā)揮著重要的作用。

為了完成經(jīng)典分泌蛋白的KEGG通路分析。首先，使用本地化的blast將789個經(jīng)典分泌蛋白序列比對到稻瘟菌數(shù)據(jù)庫中。然后，使用在線軟件KOBAS對數(shù)據(jù)進行分析，通過一系列復雜計算最終得到差異KEGG通路。結(jié)果（圖5）表明糖類代謝相關(guān)途徑發(fā)生了顯著的變化。如淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、戊糖和糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑以及其它多糖的降解。由于稻瘟菌侵染水稻過程中需要大量的能量，因此獲取能量對于稻瘟菌的生存極為重要。由此可以推測，許多經(jīng)典分泌蛋白有可能參與到糖代謝途徑中，為稻瘟菌的生存及侵染提供足夠的能量。除上述途徑外，氰基氨基酸代謝途徑（Cyanoamino acid metabolism）也發(fā)生了顯著的變化。這些結(jié)果表明，稻瘟菌分泌蛋白參與糖代謝途徑可能是其成功侵染寄主的一個重要機制。

圖4　GO富集差異生物學過程分析

2.3部分稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白具有降解植物成分的功能

編寫Python程序，從稻瘟菌全基因組中提取789個經(jīng)典分泌蛋白的基因組注釋，并通過編寫的程序篩選出相應(yīng)的可降解植物細胞壁等成分的經(jīng)典分泌蛋白。經(jīng)過大規(guī)模的篩選，本研究發(fā)現(xiàn)了156個分泌蛋白有可能具有降解植物細胞壁等成分的功能（表2）。

稻瘟菌分泌蛋白組中存在著許多降解植物蠟質(zhì)層以及細胞壁結(jié)構(gòu)的分泌蛋白和酶類。本研究發(fā)現(xiàn)，4個經(jīng)典分泌蛋白能夠特異性地降解植物的角質(zhì)層?？山到庵参锢w維素的經(jīng)典分泌蛋白數(shù)目較多，有39個。在降解植物纖維素的分泌蛋白中，有15個預測為內(nèi)切糖苷酶，8個預測為可降解纖維二糖。半纖維素主要的兩種成分為阿拉伯糖和木聚糖。在經(jīng)典分泌蛋白中預測到37個可降解半纖維素的分泌蛋白。另外，還有11個預測為可降解木質(zhì)素相關(guān)成分，這些分泌蛋白為漆酶、氧化物酶以及阿魏酸酯酶。4個經(jīng)典分泌蛋白預測為果膠酯酶和果膠裂解酶，可降解植物細胞壁和胞間層之間的果膠。胼胝體存在于植物的胞間連絲以及韌皮部，是由β-1，3 葡聚糖形成的多聚物。在植物響應(yīng)物理傷害以及病原菌侵染過程中起很重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)了6個經(jīng)典分泌蛋白具有降解胼胝體的功能。

除降解植物蠟質(zhì)層以及細胞壁的分泌蛋白外，本研究還發(fā)現(xiàn)了可降解植物蛋白質(zhì)、脂類、淀粉以及膽堿的分泌蛋白（表2）。通過對稻瘟菌全基因組注釋信息的篩選，共有45個經(jīng)典分泌蛋白可以降解蛋白質(zhì)，該類分泌蛋白多為蛋白酶及肽酶。另外，7個經(jīng)典分泌蛋白預測可以降解脂類物質(zhì)。降解膽堿及淀粉的分泌蛋白數(shù)目較少，分別為2個和1個。

圖5　經(jīng)典分泌蛋白差異KEGG通路分析

表2　可降解植物細胞壁等成分的稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白統(tǒng)計

2.4稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白結(jié)構(gòu)域分析

從Broad institute數(shù)據(jù)庫中提取稻瘟菌789個經(jīng)典分泌蛋白的結(jié)構(gòu)域注釋，編寫Python腳本語言，進行相關(guān)信息的統(tǒng)計。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果（表3）可知，789個經(jīng)典分泌蛋白中共有278個分泌蛋白存在功能結(jié)構(gòu)域。其中，90個分泌蛋白具有兩個及兩個以上的結(jié)構(gòu)域。另外，本研究統(tǒng)計了出現(xiàn)次數(shù)較多的結(jié)構(gòu)域，見表3。數(shù)目最多的結(jié)構(gòu)域為Chitin_ bind_1（PF00187.10），即幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其次為CBM_1（PF00734.9）、糖水解酶61家族（PF03443.5）以及Kelch相關(guān)結(jié)構(gòu)域（PF07646.6，PF01344.16）。

另外，通過對789個經(jīng)典分泌蛋白中所有結(jié)構(gòu)域的篩選發(fā)現(xiàn)，含有的糖基水解酶家族相關(guān)結(jié)構(gòu)域最多，約占結(jié)構(gòu)域總數(shù)的20％（82個）。具體結(jié)構(gòu)域分布見圖6。例如，PF04616結(jié)構(gòu)域?qū)儆谔擒账饷?3家族，具有阿拉伯呋喃糖酶以及木糖酶活性。

2.5稻瘟菌中預測含有大量的無信號肽分泌蛋白

以稻瘟菌全蛋白組氨基酸序列作為實驗對象，使用SecretomeP軟件進行分析，從而預測潛在的無信號肽分泌蛋白。本研究篩選結(jié)果表明，約有4 341個假定分泌蛋白滿足上述條件，約占稻瘟菌總蛋白的39％。

為了增加實驗的可信度，本實驗從4 341個假定無信號肽分泌蛋白中選取了187個（SecP值≥0.9）進行了結(jié)構(gòu)域分析（圖 7）。選取的187個假定分泌蛋白中，只有57個具有結(jié)構(gòu)域。57個具有結(jié)構(gòu)域的假定無信號肽分泌蛋白中，含有最多的結(jié)構(gòu)域為鋅指結(jié)構(gòu)域（PF00096.17）和氯霉素抗性引導肽結(jié)構(gòu)域（PF08077.2）。在含有結(jié)構(gòu)域的無信號肽分泌蛋白中，絕大多數(shù)只含有一個結(jié)構(gòu)域，并且結(jié)構(gòu)域多種多樣。由此可見，非經(jīng)典分泌蛋白應(yīng)該具有更加多樣化的功能。

表3　稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)目統(tǒng)計

圖6　稻瘟菌經(jīng)典分泌蛋白中糖基水解酶家族結(jié)構(gòu)域

圖7　非經(jīng)典分泌蛋白（SecP值0.9）結(jié)構(gòu)域

2.6假定分泌蛋白原位（in planta）表達情況

本研究整合了Chen等［25］稻瘟菌-水稻原位表達譜的數(shù)據(jù)，從中獲得了831個原位表達的稻瘟菌分泌蛋白基因。通過統(tǒng)計（圖8）發(fā)現(xiàn)，本研究所獲得的789個假定經(jīng)典分泌蛋白（CSPs）中，共有354個在原位表達譜中被檢測到，占所有假定分泌蛋白的45％。與經(jīng)典分泌蛋白不同的是，在原位表達譜中僅檢測到55個非經(jīng)典分泌蛋白。

3　討論

稻瘟菌全基因組序列的釋放，為其分泌蛋白的研究奠定了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。眾所周知，真菌分泌蛋白與致病關(guān)系密切。因此，在全基因組水平研究稻瘟菌的分泌蛋白特點，將有助于全面了解其致病因子的概況。

目前完成測序的稻瘟菌菌株70-15［2］、98-06［3］、Y34［4］及P131［4］中，其基因組序列大多是保守的。若以70-15菌株基因組作為參照，Y34、P131 及98-06三種菌株基因組的保守率達到96％以上。菌株Y34、P131和70-15三者相較，其各自基因組中分別含有51個、136個和71個特有基因。在上述特有基因中，13％的基因預測可編碼分泌蛋白［4］。在屬于菌株Y34和P131的特有基因中，19％的基因預測為含有信號肽的分泌蛋白。另外，預測菌株98-06中含有1732個分泌蛋白，其中645個被認為是候選的效應(yīng)蛋白［3］。由此可見，分泌蛋白在各個稻瘟菌生理小種中普遍存在。

本研究使用生物信息學的方法，最終在稻瘟菌中獲得了789個經(jīng)典分泌蛋白。通過對經(jīng)典分泌蛋白氨基酸數(shù)目的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的經(jīng)典分泌蛋白長度集中于100-500 aa，屬于小型蛋白。另外，通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典分泌蛋白在植物-稻瘟菌互作過程中起著非常重要的作用。由此可以推測，經(jīng)典分泌蛋白多為小型蛋白，因其結(jié)構(gòu)較為簡單，可更加方便的在植物-稻瘟菌互作中發(fā)揮作用。在其它致病菌中，分泌蛋白也多為小型蛋白。如Cladosporium fulvum 中的Avr4、Avr4E和Avr9基因，Melampsora lini 中的AvrL567A、AvrL567B等，這些基因的產(chǎn)物均為經(jīng)典分泌蛋白且氨基酸數(shù)目皆小于200，同時能使植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)［26］。另外，通過稻瘟菌-水稻互作的原位表達譜數(shù)據(jù)驗證發(fā)現(xiàn)，354個預測所得經(jīng)典分泌蛋白發(fā)生了差異表達。更加有力地說明了稻瘟菌在入侵水稻過程中，經(jīng)典分泌蛋白發(fā)揮著極其重要的作用。

圖8　經(jīng)典分泌蛋白及非經(jīng)典分泌蛋白原位（in planta）表達情況

稻瘟菌在侵染過程中會形成附著胞，依靠附著胞產(chǎn)生的瞬間高壓，從而達到刺穿植物細胞壁的目的［1，5，27，28］。同時，稻瘟菌會分泌大量可降解細胞壁的酶類，從而加快菌絲侵染［29］。已有研究表明，病原菌侵染過程中所產(chǎn)生的分泌蛋白，可以降解植物成分。如稻瘟菌中的XYL-6基因，該基因產(chǎn)物即為分泌蛋白，且具有木聚糖酶活性，能夠降解水稻細胞壁［30］。另外，在白粉菌（Erysiphe cichoracearum）侵染擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，果膠裂解酶基因PMR6對于白粉菌的致病是必須的［31］。該基因產(chǎn)物為具有果膠裂解酶活性的分泌蛋白，可以完成對擬南芥細胞壁的降解［31］。本研究通過稻瘟菌全基因組注釋，共預測出156個經(jīng)典分泌蛋白可能具有降解植物成分的功能。其中，絕大部分分泌蛋白是降解植物蠟質(zhì)層和細胞壁等相關(guān)成分的酶類。如降解蠟質(zhì)層的角質(zhì)酶，降解纖維素的葡聚糖酶以及降解半纖維素的木聚糖酶等。

作為兼性活體寄生菌［1，5］，稻瘟菌侵染植物過程中需要消耗大量的能量。植物作為稻瘟菌的直接碳源，如何利用植物成分為菌自身提供能量顯得十分重要。雖然已有研究表明分泌蛋白具有降解植物成分的功能，但分泌蛋白對于稻瘟菌糖代謝途徑的貢獻卻所知甚少。本研究通過對789個經(jīng)典分泌蛋白KEGG代謝途徑的分析發(fā)現(xiàn)，淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、半乳糖代謝（galactose metabolism）、戊糖和糖醛酸轉(zhuǎn)化途徑（pentose and glucuronate interconversions）以及其他多糖的降解（other glycan degradation）等途徑發(fā)生了極其顯著的變化（圖6）。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)典分泌蛋白中存在種類多樣且數(shù)量較多的糖基水解酶結(jié)構(gòu)域（圖7）。這意味著，眾多的分泌蛋白有可能參與到糖代謝途徑當中，為稻瘟菌提供所需的能量從而助力入侵過程。

經(jīng)典分泌蛋白具有N端的信號肽，由信號肽引導核糖體到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而完成多肽的合成［9，32］。除了含有信號肽的經(jīng)典分泌蛋白外，還存在一種不含有信號肽的分泌蛋白［11］。該類分泌蛋白在動植物中普遍存在。例如，人的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體中即存在大量不具有信號肽的蛋白質(zhì)［32，33］。真菌中已有關(guān)于不含有信號肽分泌蛋白的研究。例如，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的a因子［34］，以及灰蓋鬼傘（Coprinus cinereus）通過非經(jīng)典途徑分泌的兩個半乳凝素［35］。本研究通過對稻瘟菌分泌蛋白組的預測，發(fā)現(xiàn)了很多潛在的非經(jīng)典分泌蛋白。同時，在稻瘟菌-水稻互作表達譜中也檢測到該類分泌蛋白的表達。眾多非經(jīng)典分泌蛋白的存在是否具有重要的生物學意義，或者具有何種重要的生物學意義，隨著稻瘟菌分泌蛋白研究的不斷加深，相信非經(jīng)典分泌蛋白的功能會得到很好的詮釋。

4　結(jié)論

本研究通過設(shè)計生物信息學分析流程，重新定義了稻瘟菌分泌蛋白組。其中，經(jīng)典分泌蛋白789個，無信號肽分泌蛋白4 341個。通過對經(jīng)典分泌蛋白的大規(guī)模數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典分泌蛋白在與宿主互作及糖代謝過程中起到重要的作用。另外，發(fā)現(xiàn)了156個經(jīng)典分泌蛋白具有可降解植物細胞壁等成分的功能。經(jīng)典分泌蛋白結(jié)構(gòu)域的預測發(fā)現(xiàn)，存在最多的結(jié)構(gòu)域為糖水解酶結(jié)構(gòu)域。進而佐證了經(jīng)典分泌蛋白在糖代謝中發(fā)揮著重要作用這一結(jié)論。

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（責任編輯 李楠）

Prediction for Secretome from Magnaporthe oryzae at Genome Scale and Its Enrichment Analysis

CAO Ji-dong1，2LIU Jun2LI Sui-yan1
（1. School of Life Sciences and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031；2. State Key Laboratory of Plant Genomics，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

Secreted proteins play an important role during pathogenic process of Magnaporthe oryzae. However，many of those secreted proteins are actually effect proteins that interfere the resistance of host plants and inhibit the immune responses of host plants. Therefore，the prediction of secreted proteins by M. oryzae and its functional analysis are necessary and hot topics in the interaction of plant and microbe molecules. The software SignalP，TMHMM，and SecretomeP were applied to complete the prediction of the secretome by M. oryzae. The analyses of classical secreted proteins（CSPs）containing signal peptide by GO function enrichment，KEGG pathway，and statistics of domains were performed，further the CSPs involved in the degradation of plant derived compounds were predicted. Total 789 CSPs were found in M. oryzae genome and the amino acid lengths of CSPs were mainly concentrated between 100 to 500 aa exclusively. GO function analysis of CSPs indicated that they were enriched in the secreting pathways and in the interactions with host. Interestingly，the results of KEGG metabolism and domain analysis of CSPs suggested that some of them contributed to sugar metabolism. Around 156 CSPs were recruited in the degradation of cell walls of plants. Besides，many non-classical leaderless secreted proteins were discovered in the M. oryzae secretome. In summary，by designing the informatics procedure，we predicted the secretome of M. oryzae，CSPs were able to degrade plant derived compounds such as cell walls，and some were involved in sugar metabolism. In addition，M. oryzae. harbored many non-classical leaderless secreted proteins.

Magnaporthe oryzae；secretome；secreted protein；sugar metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.020

2015-12-01

國家自然科學基金面上項目（Y6113C2JJ1），中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項B類（Y42D021CX1）

曹繼東，男，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：cjdmcjd@163.com

李遂焰，女，碩士，副教授，碩士生導師，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：suiyanli_@163.com