路曉 孫紅梅 褚文輝 張偉 李春義

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)國家重點實驗室，長春 130000）

梅花鹿CGI99基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及其對鹿茸干細(xì)胞增殖的影響

路曉 孫紅梅 褚文輝 張偉 李春義

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)國家重點實驗室，長春 130000）

利用慢病毒介導(dǎo)的基因沉默體系，對梅花鹿生茸區(qū)骨膜干細(xì)胞（AP）中CGI99基因進(jìn)行RNA干擾，并初步研究該基因?qū)?xì)胞增殖的影響。設(shè)計出1條針對梅花鹿CGI99基因的shRNA序列與載體質(zhì)粒 pLVTHM連接，之后與pSPAX2、pMD2.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293t細(xì)胞，獲得重組慢病毒，感染AP細(xì)胞；通過熒光定量PCR檢測CGI99基因的下調(diào)水平；通過MTT實驗檢測CGI99基因沉默對AP細(xì)胞增殖影響?；虻谋磉_(dá)水平大幅度下調(diào)，干擾效率達(dá)到70.8％；MTT實驗的數(shù)據(jù)曲線趨于一致。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了針對梅花鹿CGI99基因的RNAi載體并干擾了CGI99基因在AP細(xì)胞中的表達(dá)，且初步確定CGI99基因?qū)P細(xì)胞的增殖并無顯著影響。

鹿茸；RNAi；CGI99基因；鹿茸干細(xì)胞

鹿茸作為哺乳動物中唯一能夠完全再生的骨質(zhì)性附屬器官，生長極其迅速，且成骨過程極易觀察。鹿茸生長頂端具有明顯的真皮層、間充質(zhì)層、前成軟骨層、過渡層和軟骨層［1］，同時在生長高峰期細(xì)胞的生長速度可達(dá)到癌細(xì)胞的30倍，但其卻不發(fā)生癌變［2］。研究表明，鹿茸的再生是基于干細(xì)胞的過程，鹿茸干細(xì)胞具有補(bǔ)充維持鹿一生中每一個鹿茸再生循環(huán)所需的快速增殖細(xì)胞的能力。鹿生茸區(qū)骨膜細(xì)胞（antlerogenic periosteum，AP）為鹿茸發(fā)生的干細(xì)胞［3］，而且由于其可分化成皮膚、血管、神經(jīng)、軟骨及骨等多種成分［4］，因此，鹿茸可作為一種研究骨快速生長、成骨過程以及干細(xì)胞生物學(xué)等的天然優(yōu)秀模型。

CGI99基因（同名基因C14orf166）全長1 064 bp，核心編碼區(qū)738 bp，編碼分子量約26 kD的蛋白分子，該基因主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，但在細(xì)胞核中也有表達(dá)［5］。本實驗室構(gòu)建的SSH（Suppression Subtractive Hybridization）文庫篩選到了CGI99基因，通過原位雜交試驗發(fā)現(xiàn)該基因在鹿茸軟骨小梁中高度表達(dá)（未發(fā)表），而在鹿茸的其他部位則幾乎不表達(dá)（如血管），因此，推測其在鹿茸軟骨發(fā)育、成骨中具有重要的調(diào)節(jié)作用，如可能與參與軟骨發(fā)生的調(diào)控［6］。由于AP細(xì)胞可分化為軟骨，本實驗利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi途徑，靶向沉默AP細(xì)胞中的CGI99基因［7］，并進(jìn)一步探究CGI99基因沉默對AP細(xì)胞增殖的影響，旨在為繼續(xù)研究該基因的相關(guān)機(jī)制做好初步工作。

1　材料與方法

1.1材料

AP細(xì)胞、細(xì)胞株人胚腎細(xì)胞293t、載體質(zhì)粒pLVTHM、包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒pSPAX2均由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶Cla I、Mlu I 購自NEB公司；T4 DNA 連接酶、1 000 bp DNA Marker購自TaKaRa（大連）公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自全式金公司、小量質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；大量質(zhì)粒DNA 提取試劑盒購自Promega公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工公司；DMEM、Trypsin 購自Life Tech公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自Gibco公司；SYBR GREEN 、X-tremeGENE HP購自Roche公司；ploybrene購自Santa Cruz Biotech公司，其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2方法

1.2.1梅花鹿CGI99基因shRNA重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)本課題組cDNA文庫中的CGI99基因序列（數(shù)據(jù)未發(fā)表），并根據(jù)The RNAi Consortium（TRC）RNAi靶位點篩選法則、Angela篩選法則及通過在線設(shè)計等方法比較多條備選序列，最終選擇了1條針對梅花鹿CGI99基因的高分RNAi靶序列。為確保該序列不會對梅花鹿其他基因造成影響，將靶序列在NCBI中進(jìn)行同源性比對，另外在人類的基因組中進(jìn)行相似的比對（包裝細(xì)胞為人胚腎293t），以確保靶序列不會對包裝細(xì)胞的相關(guān)基因產(chǎn)生RNAi效應(yīng)。在RNAi序列兩端加上酶切位點、終止信號、內(nèi)成環(huán)結(jié)構(gòu)等，送公司合成。共設(shè)計2對shRNA序列（表1），其中S2為無意義鏈，作為陰性對照。合成的序列經(jīng)退火后形成雙鏈Oligo DNA，與經(jīng)Cla I、Mlu I雙酶切后的pLVTHM質(zhì)粒連接，經(jīng)DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增。挑選重組陽性克隆菌株，提取質(zhì)粒后，按如下引物進(jìn)行PCR鑒定［7］：上游5'-ctgggaaatcaccataaacg-3'，下游5'-ttattcccatgcgacggtat-3'。對鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定（博仕生物有限公司）。測序正確后大量提取質(zhì)粒，同時對pSPAX2和pMD2.G兩種質(zhì)粒進(jìn)行大量提取備用。

表1　shRNA序列

1.2.2重組慢病毒包裝 對293t 細(xì)胞進(jìn)行實驗前的處理，當(dāng)293t 細(xì)胞生長狀態(tài)合適時，使用1.5 mL opti-MEM 稀釋10 μg DNA（pLVTHM重組陽性質(zhì)粒、pSPAX2與pMD2.G的質(zhì)量比為4∶4∶2），同時添加20 μL X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑，室溫下孵育25 min，將該混合溶液加到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕搖培養(yǎng)皿以混勻。在37℃，CO2濃度為5％的培養(yǎng)箱中孵育12 h后，更換為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后檢測綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，以此確定三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。收集細(xì)胞培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染24 h的培養(yǎng)基，并用0.45 μm濾器過濾以棄去細(xì)胞碎片沉淀，然后經(jīng)100 kD 超濾管濃縮后用1.5 mL EP管分裝，-80℃保存待用。

1.2.3重組慢病毒感染AP細(xì)胞 消化并重懸AP細(xì)胞，準(zhǔn)確計數(shù)后，添加2.5×104個細(xì)胞于6孔板中央，添加2 mL完全培養(yǎng)基。12 h后進(jìn)行重組慢病毒感染，棄去6孔板中培養(yǎng)基，替換為2 mL含有200 μL（滴度3.2×106TU/mL）慢病毒液及2 μL polybrene的混合液，12 h后更換為完全培養(yǎng)基，24 h后觀察AP細(xì)胞熒光蛋白GFP的表達(dá)情況。

1.2.4RT-PCR檢測AP細(xì)胞RNAi效率 取感染后的AP細(xì)胞，提取總RNA，酶標(biāo)儀測定RNA濃度及純度后，反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，之后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，對結(jié)果進(jìn)行校正，以未做任何處理的AP細(xì)胞作對照，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性15 s，55.4℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃。

針對CGI99基因及GAPDH內(nèi)參基因分別設(shè)計一對引物，見表2。

表2　CGI99基因及GAPDH內(nèi)參基因引物序列

1.2.5MTT實驗檢測AP細(xì)胞增殖情況 消化感染AP-S1、S2細(xì)胞及不做任何處理的AP細(xì)胞（未進(jìn)行慢病毒感染的，作為空白對照）并準(zhǔn)確計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×104個/mL，取200 μL細(xì)胞懸液于96孔板中，使得每孔細(xì)胞數(shù)在5×103個左右，接種24、48、78、96和120 h后，每孔添加20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，停止培養(yǎng)，小心棄去上清后，加入150 μL DMSO溶解，搖床避光反應(yīng)10 min后，利用酶標(biāo)儀在490 nm處測定吸光度。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

2　結(jié)果

2.1陽性重組質(zhì)粒pLVTHM的PCR鑒定

PCR鑒定結(jié)果如圖1所示，1號泳道為空白質(zhì)粒pLVTHM，作為陰性對照，其擴(kuò)增片段十分接近Marker的100 bp條帶；2、3號泳道為陽性克隆，2種陽性重組質(zhì)粒分別命名為pLVTHM-S1和pLVTHM-S2，擴(kuò)增片段接近Marker的200 bp條帶。已知空白質(zhì)粒pLVTHM 的擴(kuò)增片段為85 bp，陽性重組質(zhì)粒的擴(kuò)增片段為141 bp，結(jié)果與實驗預(yù)期相符，即表明挑選的陽性克隆的確為實驗所需。測序結(jié)果最終確定陽性克隆中正確插入了所需的shRNA，即RNAi 靶位點序列。

圖1　重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

2.2重組慢病毒三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞效果檢測

在293t細(xì)胞中進(jìn)行X-tremeGENE HP介導(dǎo)的pLVTHM陽性重組質(zhì)粒、pSPAX2和pMD2.G三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到大量呈不規(guī)則狀態(tài)分布的GFP熒光（圖2-A）。在相同倍數(shù)的可見光下觀察，293t細(xì)胞形狀呈圓粒狀，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，無死細(xì)胞（圖2-B），表明3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞按預(yù)期進(jìn)行，并得到慢病毒顆粒。

圖2　三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24 h后的293t細(xì)胞

2.3重組慢病毒對梅花鹿AP細(xì)胞的感染

用包裝成功的慢病毒感染AP細(xì)胞，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察。如圖3所示，感染慢病毒的AP細(xì)胞中有大量綠色熒光分布于視野，而可見光下的同一視野可看到AP細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

圖3　重組慢病毒感染的AP細(xì)胞（48 h）

2.4感染效率的檢測

將未感染的AP細(xì)胞作為對照進(jìn)行熒光定量RT-qPCR檢測，通過熔解曲線可知，GAPDH基因和CGI99基因均被特異性擴(kuò)增。利用2-ΔΔCt分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，由圖4可知，與陰性對照AP相比，AP-S1的CGI99基因的表達(dá)水平大幅度下調(diào)，干擾效率達(dá)到70.8％，而AP-S2的CGI99基因的表達(dá)基本不變。因此可確定攜帶pLVTHM-S1的質(zhì)粒能夠有效沉默CGI99基因的表達(dá)，本實驗獲得了可穩(wěn)定傳代的低表達(dá)梅花鹿AP細(xì)胞系。

圖4　RT-PCR檢測CGI99基因的沉默水平

2.5CGI99下調(diào)對AP細(xì)胞分裂繁殖的影響

進(jìn)行6 d的MTT實驗后，由圖5可知，AP-S1及AP-S2的增殖程度與空白對照AP相比，沒有顯著的變化（數(shù)據(jù)顯著水平P＞ 0.05），說明CGI99的下調(diào)對AP細(xì)胞的增殖沒有明顯影響，同時說明慢病毒感染對細(xì)胞增殖也沒有顯著影響。

圖5　MTT實驗生長曲線

3　討論

鹿茸作為哺乳動物中唯一可以再生的器官，在軟骨發(fā)生及骨生長方面的研究具有重要意義。除此之外，由于鹿茸具有可再生性、干細(xì)胞依賴性以及成骨過程明顯等諸多特性，是一種極具潛力的哺乳動物生物醫(yī)學(xué)模型［8］。在目前能找到的相關(guān)報道中，該基因多在腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、流感病毒的復(fù)制以及腦組織發(fā)育等機(jī)體活動中起調(diào)控作用［9-13］。因此，研究CGI99基因的功能及作用機(jī)理就顯得極為重要。而目前研究得出的關(guān)于CGI99基因的結(jié)論多集中在病毒調(diào)控及蛋白質(zhì)復(fù)合物相互作用中［14-18］，利用鹿茸這個獨(dú)特的模型研究CGI99基因在軟骨發(fā)生方面的功能研究目前還尚未見過報道。

RNAi技術(shù)作為一種研究基因功能的新工具，由于其實驗簡單、快速、重復(fù)性好等特點，越來越廣泛地應(yīng)用在研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路及基因病、癌癥的治療中［19-21］。本實驗通過RNAi途徑靶向沉默了CGI99基因在AP細(xì)胞中的表達(dá)，同時將鹿茸作為研究軟骨組織發(fā)生機(jī)制的模型，為研究該基因提供了一種有效途徑。而MTT實驗結(jié)果顯示CGI99基因的沉默對AP細(xì)胞的增殖并沒有顯著的影響，由此推斷該基因在細(xì)胞增殖方面或許沒有特異性的作用，而極有可能在細(xì)胞分化方面有著重要的作用。

本實驗建立了靶向沉默CGI99基因的技術(shù)平臺，為進(jìn)一步在鹿茸或者其他模式動物中研究CGI99基因的功能及作用機(jī)理提供借鑒，但其在軟骨發(fā)生等方面影響的機(jī)理還有待于繼續(xù)研究。

4　結(jié)論

本實驗成功干擾了CGI99基因在AP細(xì)胞中的表達(dá)，構(gòu)建了梅花鹿CGI99基因的RNAi慢病毒載體，并且初步驗證了CGI99基因的沉默對AP細(xì)胞的增殖沒有顯著影響。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Lentiviral Vector for CGI99 RNAi and Its Effects on Antlerogenic Periosteum Cell Proliferation in Sika Deer

LU Xiao SUN Hong-mei CHU Wen-hui ZHANG Wei LI Chun-yi
（State Key Laboratory of Special Economical Animal Molecular Biology，Institute of Special Animal and Plant Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130000）

CGI99 of antlerogenic periosteum（AP）cells from Chinese sika deer was interfered using the lentivirus-mediated gene silencing system，and a preliminary study on the gene function on proliferation of AP cells was proceeded. One sequence shRNA targeting CGI99 of sika deer was designed，then reassembled into the lentiviral plasmids pLVTHM. Together with the plasmids pSPAX2 and pMD2.G，recombinant lentivirus was acquired by their co-transfection into HEK 293t cells，and then infected into AP cells. Detecting the down-regulating expression level of CGI99 mRNA in infected AP cells was conducted by RT-PCR，and the effect of silenced CGI99 on AP cell proliferation was assayed by MTT. The results showed that the expression level of CGI99 mRNA in cells that infected with recombinant lentivirus was obviously decreased，the interferential efficiency reached 70.8％；and the curves by MTT assay tended to be consistent. Therefore，we successfully constructed RNAi vector for CGI99 and interfered the expression of CGI99 in AP cells，and preliminarily confirmed that the CGI99 presented insignificant effect on the AP cells' proliferation.

deer antler；RNAi；CGI99；antlerogenic periosteum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.018

2015-12-11

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20140204010YY），吉林省自然科學(xué)基金項目（20140101139JC）

路曉，女，碩士研究生，研究方向：鹿茸生物學(xué)；E-mail：1234wuguipa@163.com

李春義，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：鹿茸干細(xì)胞與哺乳動物器官再生、鹿茸生物學(xué)及其基因工程；E-mail：lichunyi1959@163.com