唐鑫華姜廷波高紅秀王敬國(guó)鄒德堂

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

轉(zhuǎn)NtFer1基因粳稻空育131抗Fe2+脅迫能力分析

唐鑫華1姜廷波2高紅秀1王敬國(guó)1鄒德堂1

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2. 東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

旨在研究煙草鐵蛋白基因NtFerl功能，提高粳稻抗逆性等。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將NtFerl基因轉(zhuǎn)入粳稻空育131，經(jīng)抗性篩選、PCR、Southern雜交、Northern雜交和RT-PCR檢測(cè)等，表明外源基因已整合到空育131基因組中，并能夠在子代穩(wěn)定遺傳表達(dá)。在缺鐵和鐵過(guò)量條件下培育T2代轉(zhuǎn)基因植株，缺鐵條件下轉(zhuǎn)基因株系抗氧化酶活性（SOD、POD）、葉綠素相對(duì)含量、葉片總鐵含量和根系生長(zhǎng)量均顯著高于對(duì)照，而丙二醛（MDA）含量顯著低于對(duì)照；鐵過(guò)量條件下轉(zhuǎn)基因株系抗氧化酶活性（SOD）、葉片總鐵含量、糙米總鐵含量和根系生長(zhǎng)量均顯著高于對(duì)照，而MDA含量和稻瘟病葉瘟指數(shù)顯著低于對(duì)照。表明鐵蛋白基因NtFerl能夠提高轉(zhuǎn)基因植株抗氧化脅迫能力和稻瘟病抗性，增加植株鐵離子儲(chǔ)藏能力，增強(qiáng)植株缺鐵脅迫的耐性和鐵過(guò)量脅迫的抗性。

NtFerl基因；粳稻；總鐵含量；氧化脅迫

鐵是植物生長(zhǎng)必需的微量元素之一，它對(duì)于植物葉綠體的合成和酶的合成是必不可少的，能夠促進(jìn)植物的光合作用和呼吸作用［1］；植物缺鐵會(huì)導(dǎo)致葉綠素含量減少、葉片黃化，使植物出現(xiàn)失綠癥甚至死亡［2］。而過(guò)量的Fe2+導(dǎo)致氧化脅迫，F(xiàn)e2+催化Fenton反應(yīng)生成具有強(qiáng)氧化性的羥自由基，損害細(xì)胞膜系統(tǒng)甚至導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡［3，4］，在酸性條件下土壤會(huì)釋放出大量的Fe2+造成鐵污染，潛育性水稻土中Fe2+毒害是限制水稻生長(zhǎng)的原因之一［5，6］。鐵蛋白（Ferritin）是一種可以?xún)?chǔ)存鐵離子的儲(chǔ)藏結(jié)合蛋白，由24個(gè)同源或異源亞基組成的450 kD復(fù)合體，每個(gè)鐵蛋白分子可以?xún)?chǔ)藏0-4 500個(gè)可溶的、無(wú)毒的、可利用的鐵離子。鐵蛋白的一個(gè)主要作用是儲(chǔ)存鐵離子，作為植物體光合作物和固氮的鐵源；另一個(gè)主要作用是作為脅迫反應(yīng)蛋白，促進(jìn)過(guò)剩鐵離子的儲(chǔ)藏［7-9］。研究表明煙草鐵蛋白基因NtFerl在轉(zhuǎn)基因煙草中的過(guò)量表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株抗氧化能力、葉片總鐵含量和最大光化學(xué)量子產(chǎn)量［10］。大豆鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入萵苣中，轉(zhuǎn)基因植株鐵含量比對(duì)照高出20％-70％，生長(zhǎng)速度也高于對(duì)照［11］。豌豆鐵蛋白基因轉(zhuǎn)化到秀水11中增加了轉(zhuǎn)基因植株中鐵的貯藏量，降低了植株游離鐵含量從而減輕了轉(zhuǎn)基因植株的氧化損傷，氧化脅迫的耐受能力有不同程度的增強(qiáng)［12］。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將鐵蛋白基因NtFerl轉(zhuǎn)入粳稻空育131，在缺鐵和鐵過(guò)量條件下培育T2代轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)比較轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照在不同F(xiàn)e2+條件下生理響應(yīng)等方面差異，分析鐵蛋白基因NtFerl功能，旨為粳稻分子抗逆育種提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用粳稻空育131種子由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。煙草鐵蛋白基因NtFerl（GenBank登錄號(hào)：AB083924）前期研究獲得，cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)756 bp，編碼251個(gè)氨基酸。植物表達(dá)載體PBI121由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1載體構(gòu)建和菌株培養(yǎng) 將煙草鐵蛋白基因NtFerl cDNA片段插入植物表達(dá)載體PBI121替代GUS基因，啟動(dòng)子CaMV35S，終止子NOS，篩選標(biāo)記NPTII基因，利用凍融法將經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105。將農(nóng)桿菌EHA105- NtFerl涂布LB（Kan 50 mg/L和Rif 50 mg/L）固體培養(yǎng)基，27℃暗培養(yǎng)，挑取若干單菌斑至LB（Kan 50 mg/L和Rif 50 mg/L）液體培養(yǎng)基，27℃、160 r/min 培養(yǎng)12-16 h，取500 μL上述菌液加入至100 mL YEB 培養(yǎng)液中，待OD=0.5時(shí)侵染備用。

1.2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化 空育131成熟種子除去穎殼，消毒處理播至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，14 d剝離愈傷組織至愈傷繼代培養(yǎng)基，10 d后轉(zhuǎn)至預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)4 d，將愈傷組織浸沒(méi)于農(nóng)桿菌EHA105-NtFerl菌液中30 min，置于共培養(yǎng)基20℃暗培養(yǎng)3 d，經(jīng)篩選、分化和生根培養(yǎng)（Kan 50-120 mg/L）將幼苗移入壯苗營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，選出長(zhǎng)勢(shì)較好的若干株進(jìn)一步研究。

1.2.3T0代植株分子檢測(cè) 用試劑盒（原平皓，HF224） 提取葉片基因組DNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，NtFer1-F（5'-CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCC-3'）和NtFer1-R（5'-CATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'）。PCR反應(yīng)體系：模板0.5 μg，100 μmol/L引物各0.1 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL Taq 0.2 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃30 s，58.5℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳分離成像。用DIG標(biāo)記探針試劑盒（Roche）標(biāo)記煙草鐵蛋白基因NtFerlcDNA為探針，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》方法進(jìn)行Southern雜交。用Trizol 法提取葉片總RNA，取30 μg 65℃水浴5 min，經(jīng)1％甲醛變性膠電泳分離后進(jìn)行Northern雜交，方法同Southern雜交。

1.2.4T2代植株分子檢測(cè) 用Trizol 法提取葉片和根部總RNA，參照試劑盒（Toyobo，Japan）說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以水稻Actinl基因?yàn)閮?nèi)參基因，外源基因特異引物為：NtFer1-RT-F（5'-AGGAGTTGATGCTTGTACCC-3'）和NtFer1-RT-R（5'-TTCTCAGCGTGCTCTCTTTC-3'），內(nèi)參基因特異引物為：Actin1-RT-F（5'-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3'）和Actin1-RT-R（5'-ATCCAACCGGAGGATAGCATG -3'）。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃ 30 s，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，42個(gè)循環(huán)；熔解程序：94℃ 30 s，94℃-60℃臺(tái)階溫度0.5℃保持1 min，94℃ 30 s。DNA提取和PCR檢測(cè)同1.2.3。

1.2.5生理指標(biāo)測(cè)定 經(jīng)抗性篩選和分子檢驗(yàn)后，將T2代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ找浦糜趬衙鐮I(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)（Fe2+5 μmol/L和300 μmol/L），40 d測(cè)定植株上部葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量，以及葉綠素相對(duì)含量和PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm（經(jīng)20 min暗適應(yīng)），均重復(fù)3次。SOD活性用氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原法測(cè)定，POD活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，MDA含量用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，葉綠素相對(duì)含量用葉綠素儀SPAD-502（Japan）測(cè)定，PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm用葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2500（德國(guó)WALZ）經(jīng)20 min暗適應(yīng)后測(cè)定。

1.2.6葉片、糙米總Fe含量測(cè)定 根據(jù)Fe標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濕式消解-原子吸收法測(cè)定總Fe含量（原子吸收分光光度計(jì)Z-2000，Japan），并計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。取T2代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨‵e2+5 μmol/L和300 μmol/L，40 d）上部葉片烘干后測(cè)定總Fe含量，重復(fù)3次；成熟籽粒去除穎殼、烘干粉碎測(cè)定糙米中總Fe含量，重復(fù)3次。

1.2.7根系生長(zhǎng)量測(cè)定 在Fe2+5 μmol/L和300 μmol/L營(yíng)養(yǎng)液中培育40 d，蒸餾水沖洗干凈根系表面使根系充分展開(kāi)，應(yīng)用植物根系分析系統(tǒng)根系分析儀LA-S測(cè)定植株根系總長(zhǎng)度和不同直徑范圍根系長(zhǎng)度，重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.8糙米氨基酸含量測(cè)定 T2代轉(zhuǎn)基因植株成熟種子等質(zhì)量混合以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨‵e2+300 μmol/L營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)），去除穎殼、粉碎、過(guò)篩、烘干，稱(chēng)取100 mg，加入8 mL 6 mol/L HCl 吹入氮?dú)夥饪冢?10℃水解22 h，冷卻過(guò)濾定容至50 mL，取1 mL真空凍干加入1 mL 0.02 mol/L HCl，離心取上清0.8 mL，過(guò)濾后用全自動(dòng)氨基酸分析儀（德國(guó)阿米諾西斯，A200）測(cè)定氨基酸含量，并重復(fù)3次。

1.2.9瘟病抗性分析 采集黑龍江省粳稻主要產(chǎn)區(qū)2010-2012年稻瘟病小種樣本，分離培養(yǎng)62個(gè)單孢菌株，菌體懸浮液濃度 2×105孢子/mL，每個(gè)菌株取10 mL懸浮液加入0.02％ Tween20混勻，噴霧器接種于T2代轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏娜~一心的幼苗（Fe2+300 μmol/L營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)），27℃、濕度90％，暗培養(yǎng)24 h，然后保持27℃、濕度90％、12 h/d光照培養(yǎng)，按照國(guó)際水稻所稻瘟病抗性評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)葉瘟分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0、8、10和12 d調(diào)查葉瘟級(jí)別，根據(jù)病情指數(shù)公式計(jì)算稻瘟病病情指數(shù)［13，14］。

2　結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)基因植株分子檢測(cè)

對(duì)T0代抗性植株P(guān)CR檢測(cè)，抗性植株和質(zhì)粒在750 bp處均擴(kuò)增出目的條帶（圖1），初步證明外源基因NtFerl整合到空育131基因組中。從中選出3株長(zhǎng)勢(shì)較好的抗性植株，進(jìn)行Southern blot檢測(cè)，其均能與探針雜交出條帶（圖2-A），進(jìn)一步證明外源基因已整合到粳稻空育131基因組中；分離總RNA進(jìn)行Northern blot檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因植株中均檢測(cè)到了相應(yīng)的外源基因NtFerl表達(dá)的mRNA信號(hào)（圖2-B），表明外源基因NtFerl已在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。

圖1　T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

圖2　T0代轉(zhuǎn)基因植株Southern（A）和Northern（B）雜交檢測(cè)

經(jīng)連續(xù)2代自交對(duì)上述3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（Nt1、Nt2和Nt3）PCR檢測(cè)（圖3），抗性植株和質(zhì)粒均產(chǎn)生特異擴(kuò)增條帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談t無(wú)特異擴(kuò)增條帶；RT-PCR檢測(cè)（圖4）在不同F(xiàn)e2+脅迫條件下NtFerl基因在轉(zhuǎn)基因株系中均有表達(dá)，且相同株系在不同F(xiàn)e2+條件下相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異。表明NtFerl基因在轉(zhuǎn)基因植株中能夠穩(wěn)定遺傳表達(dá)。

2.2T2代轉(zhuǎn)基因植株生理指標(biāo)比較分析

2.2.1抗氧化酶活性和MDA含量變化 在Fe2+5 μmol/L和300 μmol/L培養(yǎng)液條件下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因株系SOD活性顯著高于對(duì)照8.0％-11.4％和9.3％-13.3％（圖5-A），而MDA含量顯著低于對(duì)照13.9％-18.5％和8.3％-15.1％（圖5-C）；在低濃度Fe2+條件下轉(zhuǎn)基因株系POD活性顯著高于對(duì)照10.5％-21.0％（圖5-B），而在高濃度Fe2+條件下其與對(duì)照的差異不顯著。表明在一定Fe2+條件下NtFerl基因在轉(zhuǎn)基因粳稻中的表達(dá)能夠提高葉片細(xì)胞的抗氧化酶活性從而降低質(zhì)膜過(guò)氧化作用，保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)。

圖3　T2代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

圖4　T2代轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測(cè)

圖5　SOD活性（A）、POD活性（B）和MDA含量（C）

2.2.2葉綠素相對(duì)含量和PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm變化 在缺鐵（Fe2+5 μmol/L）條件下轉(zhuǎn)基因株系葉綠素相對(duì)含量顯著高于對(duì)照8.3％-15.9％（圖6），PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm顯著高于對(duì)照5.2％-6.4％（圖7）；在鐵過(guò)量（Fe2+300 μmol/L）條件下轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照葉綠素相對(duì)含量無(wú)顯著差異，而PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm有高于對(duì)照的趨勢(shì)。在缺鐵條件下NtFerl基因在轉(zhuǎn)基因粳稻中的表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株葉綠素相對(duì)含量和PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)缺鐵耐性要強(qiáng)于對(duì)照，并能夠減緩光能轉(zhuǎn)換效率的降低。

圖6　葉綠素相對(duì)含量

圖7　PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm

2.2.3葉片和糙米總鐵含量比較 在Fe2+5 μmol/L 和300 μmol/L培養(yǎng)液條件下轉(zhuǎn)基因株系葉片總鐵含量顯著高于對(duì)照10.8％-15.1％和10.4％-14.9％（圖8）；在Fe2+300 μmol/L培養(yǎng)液條件下轉(zhuǎn)基因株系糙米總鐵含量顯著高于對(duì)照7.6％-13.7％（圖9），在Fe2+5 μmol/L培養(yǎng)液條件下轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照由于嚴(yán)重缺鐵而導(dǎo)致植株不能成熟收獲籽粒。表明NtFerl基因轉(zhuǎn)入表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株在缺鐵和鐵過(guò)量條件下葉片儲(chǔ)藏鐵離子的能力，鐵過(guò)量條件下能夠提高轉(zhuǎn)基因植株糙米總鐵含量。

圖8　葉片鐵含量

圖9　糙米鐵含量

圖10　不同直徑范圍的根系長(zhǎng)度及根系總長(zhǎng)度

圖11　糙米氨基酸含量

2.2.4根系生長(zhǎng)量比較 對(duì)7個(gè)不同直徑范圍內(nèi)的根系長(zhǎng)度和根系總長(zhǎng)度（直徑≥0.10 mm）比較發(fā)現(xiàn)，在Fe2+5 μmol/L培養(yǎng)液條件下轉(zhuǎn)基因株系根系總長(zhǎng)度（直徑≥0.10 mm）顯著高于對(duì)照16.7％（P＜0.05），其中直徑≥0.45 mm的根系長(zhǎng)度高于對(duì)照24.9％（P ＜0.05）；在Fe2+300 μmol/L培養(yǎng)液條件下轉(zhuǎn)基因株系根系總長(zhǎng)度（直徑≥0.10 mm）顯著高于對(duì)照6.4％ （P＜0.05），其中直徑≥0.45 mm的根系長(zhǎng)度分高于對(duì)照3.2％（圖10）。表明NtFerl基因轉(zhuǎn)入表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株在缺鐵和鐵過(guò)量條件下根系生長(zhǎng)量。

2.2.5糙米氨基酸含量比較 在過(guò)量Fe2+條件下轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?6種氨基酸和游離氨基酸總質(zhì)量含量略高于對(duì)照，但差異未達(dá)顯著，其中丙氨酸Ala等7種氨基酸質(zhì)量含量高于對(duì)照、絲氨酸Ser等7種氨基酸質(zhì)量含量與對(duì)照持平、蘇氨酸Thr 等3種氨基酸略呈下降趨勢(shì)，其中僅丙氨酸Ala和脯氨酸Pro含量高于對(duì)照6.1％和8.5％（圖11）差異達(dá)到顯著。

2.2.6稻瘟病抗性比較 在過(guò)量 Fe2+條件下3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系稻瘟病葉瘟指數(shù)在3個(gè)統(tǒng)計(jì)時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照，其中第10天和12天分別低于對(duì)照7.8％和13.1％且差異達(dá)到顯著（圖12）。表明NtFerl基因的轉(zhuǎn)入表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株稻瘟病葉瘟抗性，從而抑制稻瘟病病菌對(duì)葉片的侵害、降低葉瘟指數(shù)。

圖12　稻瘟病葉瘟指數(shù)

3　討論

SOD和POD是活性氧清除劑，均屬于抗氧化類(lèi)酶，在植物抗氧化脅迫中具有清除氧自由基、防止脂膜過(guò)氧化以及維持活性氧代謝平衡的功能［15，16］。MDA是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，其會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，含量高低可作為細(xì)胞膜過(guò)氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的指標(biāo)［17，18］。在不同F(xiàn)e2+條件下轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性顯著高于對(duì)照，而MDA含量顯著低于對(duì)照。一方面外源鐵蛋白基因NtFerl的轉(zhuǎn)入表達(dá)促進(jìn)植株細(xì)胞將有毒害游離Fe2+以無(wú)毒的狀態(tài)儲(chǔ)藏在鐵蛋白中，從而降低了由Fe2+催化Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基（·OH）含量；另一方面鐵是SOD酶重要金屬輔基之一，鐵蛋白能夠?qū)⒂卸竞Φ腇e2+轉(zhuǎn)化成無(wú)毒的、可利用的狀態(tài)供給細(xì)胞合成SOD酶，從而提高細(xì)胞抗氧化酶活性、降低過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的傷害。轉(zhuǎn)鐵蛋白基因NtFerl的轉(zhuǎn)入表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株在不同F(xiàn)e2+條件下的抗氧化性。

SPAD-502型葉綠素儀測(cè)定葉片SPAD值與葉片實(shí)際測(cè)定的葉綠素含量之間呈極顯著正相關(guān)，可用SPAD值表示葉綠素相對(duì)含量［19-21］。Fv/Fm是PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率或最大PSⅡ的光能轉(zhuǎn)換效率，葉片暗適應(yīng)20 min后測(cè)得。非脅迫條件下該參數(shù)的變化極小，不受物種和生長(zhǎng)條件的影響，脅迫條件下該參數(shù)明顯下降［22］。在缺鐵條件下轉(zhuǎn)基因植株葉片總鐵含量顯著高于對(duì)照，鐵蛋白能夠儲(chǔ)藏較多鐵離子并將具有強(qiáng)氧化性Fe2+轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的、可利用的狀態(tài)供給葉綠體合成等，從而減緩葉綠素含量的降低，抑制PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm下降，鐵蛋白基因NtFerl的轉(zhuǎn)入表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因植株缺鐵的耐性，但在長(zhǎng)期持續(xù)嚴(yán)重缺鐵情況下轉(zhuǎn)基因植株仍無(wú)法正常生長(zhǎng)。在缺鐵條件下（Fe2+5 μmol/L）轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照由于缺鐵葉片從三葉一心期開(kāi)始，葉片逐漸失綠變黃致死亡，但轉(zhuǎn)基因植株的失綠緩于對(duì)照；而在鐵過(guò)量時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照MDA含量極顯著高于缺鐵時(shí)對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照，過(guò)量Fe2+產(chǎn)生的氧化脅迫強(qiáng)度高于Fe2+不足時(shí)產(chǎn)生的氧化脅迫強(qiáng)度，但在過(guò)量Fe2+條件下轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照能夠生長(zhǎng)至成熟收獲籽粒。根據(jù)上述情況推測(cè)在缺鐵條件下植株的死亡主要原因是由于葉綠素合成不足導(dǎo)致光能轉(zhuǎn)化效率低所造成。

鐵蛋白基因NtFerl能夠提高轉(zhuǎn)基因粳稻糙米總鐵含量，而所測(cè)17種氨基酸總質(zhì)量含量無(wú)顯著變化，有顯著增加的丙氨酸Ala和脯氨酸Pro是人體所需的氨基酸，因此可為改善飲食鐵缺乏癥狀研究提供參考。

接種稻瘟病混合菌種轉(zhuǎn)基因株系葉片稻瘟病指數(shù)顯著低于對(duì)照，結(jié)合葉片總鐵含量的差異推測(cè)可能原因是，轉(zhuǎn)基因植株葉片較高鐵含量抑制了稻瘟病病菌對(duì)葉片的侵害，當(dāng)病菌侵染葉片后受侵染部位細(xì)胞響應(yīng)使鐵蛋白釋放出儲(chǔ)存的鐵離子，F(xiàn)e2+催化Fenton反應(yīng)生成具有強(qiáng)氧化性的羥自由基抑制稻瘟病病菌增長(zhǎng)，而在沒(méi)有受到病菌侵染的部位鐵離子仍以可溶的、無(wú)毒的狀態(tài)儲(chǔ)存在鐵蛋白中。試驗(yàn)用空育131屬高緯寒地中、早熟粳稻品種，具有產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)和抗倒伏等優(yōu)點(diǎn)，但屬稻瘟病易感品種嚴(yán)重影響其推廣種植，轉(zhuǎn)NtFerl空育131植株稻瘟病抗性顯著提高，可為利用基因工程技術(shù)提高粳稻抗病育種提供參考。

4　結(jié)論

在缺鐵（Fe2+5 μmol/L）條件下，T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片抗氧化酶活性（SOD、POD）、葉綠素相對(duì)含量、葉片總鐵含量和根系生長(zhǎng)量均較對(duì)照有顯著提高，而MDA含量顯著低于對(duì)照。外源鐵蛋白基因NtFerl的轉(zhuǎn)入表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因植株低鐵脅迫的耐性、抗氧化性和鐵離子儲(chǔ)藏能力。

在鐵過(guò)量（Fe2+300 μmol/L）條件下，T2代轉(zhuǎn)基因植株葉片抗氧化酶活性（SOD）、葉綠素相對(duì)含量、葉片總鐵含量、糙米總鐵含量和根系生長(zhǎng)量均較對(duì)照有顯著提高，而MDA含量顯著低于對(duì)照；接種稻瘟病病菌后轉(zhuǎn)基因植株葉瘟指數(shù)顯著低于對(duì)照。外源鐵蛋白基因NtFerl的轉(zhuǎn)入表達(dá)還能夠提高轉(zhuǎn)基因植株鐵稻瘟病抗性。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Analysis on Fe2+Stress Resistance of Transgenic Japonica Kongyu 131 with NtFer1

TANG Xin-hua1JIANG Ting-bo2GAO Hong-xiu1WANG Jing-guo1ZOU De-tang1
（1. College of Agriculture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；2. State Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding，Northeast Forestry University，Harbin 150040）

In order to realize the gene's function and improve the resistance ability of japonica，NtFer1 was transformed into japonica Kongyu 131 by Agrobacterium-mediated method. The results by resistance screening，PCR，Southern blotting，Northern blotting，and RTPCR demonstrated that the gene was integrated into Kongyu 131's genome，stably and genetically expressed in offspring. T2generation was cultured in iron deficiency and overload conditions respectively. Under iron deficiency conditions，SOD，POD activity，relative chlorophyll content，total iron content in leaves and roots of transgenic lines were all significantly higher than the control，while the MDA content was lower than the control. Under iron overload conditions，SOD activity，total iron content in leaves and brown rice，and roots growth of transgenic lines were significantly higher than the control，while MDA content and rice blast index were significantly lower than the control. The results revealed that NtFer1 could improve transgenic plant's ability of oxidative stress and resistance to rice blast，enhance Fe2+storage ability and stress resistance in iron deficiency and overload conditions.

NtFerl gene；japonica；total iron content；oxidative stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.012

2016-01-04

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題（2013BAD20B04），國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD16B11）

唐鑫華，博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：水稻遺傳育種；E-mail：tangxinhua821@sina.com

鄒德堂，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：水稻遺傳育種；E-mail：zoudetang0103@sina.com