張秀云，李丹丹，馬艷芳（.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院信息工程系，山東萊蕪700；.菏澤市食品藥品監(jiān)督管理局，山東菏澤74000；.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安708）

響應(yīng)面法優(yōu)化白果蛋白質(zhì)提取工藝

張秀云1，李丹丹2，馬艷芳3
（1.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院信息工程系，山東萊蕪271100；2.菏澤市食品藥品監(jiān)督管理局，山東菏澤274000；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018）

以白果為原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法研究白果蛋白質(zhì)的提取工藝，考察提取液濃度、pH、料液比及提取時間對白果蛋白質(zhì)提取率的影響。結(jié)果表明白果提取蛋白質(zhì)的最適條件為：提取液濃度0.16 mol/L，pH8.7，料液比1∶26，提取時間5 h，此條件下，白果蛋白質(zhì)的提取率為82.76%，與理論預(yù)測值83.01%相比，其相對誤差為0.30%，說明優(yōu)化得出的回歸模型具有一定的實際指導(dǎo)意義。

白果蛋白質(zhì)，提取，響應(yīng)面法

白果，又名銀杏，是銀杏的種仁，具有可食性［1］。研究表明，白果內(nèi)營養(yǎng)成分豐富，主要有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、尼克酸以及鉀、鈣、鎂等多種微量元素等［2］。此外銀杏酸、白果酚、膽固醇等功效成分亦成為白果的一大研究熱點［3］。因此，白果廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域。

白果中含有8%～13%的蛋白質(zhì)，因地域不同含量有所差異。研究顯示，作為一種新型的植物蛋白，白果蛋白質(zhì)氨基酸組成豐富合理，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，并具有良好的抗氧化和延緩衰老的作用［4-5］。此外，白果蛋白對食品的加工性能、營養(yǎng)和口感有一定的影響，其持油性、持水性和起泡性奠定了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)［6］。但現(xiàn)今對白果蛋白的研究尚處于一個初步探索階段，對其實際應(yīng)用方面的研究還很匱乏。因此，提取白果蛋白質(zhì)并進行深入研究對擴大其應(yīng)用范圍、充分發(fā)揮其生物功效有重要意義。目前對白果蛋白質(zhì)的提取多采用傳統(tǒng)提取法和正交優(yōu)化實驗，但是提取率不是很高［7-8］。因此為了獲得高提取率的白果蛋白和充分利用原料，本文采用響應(yīng)面分析法對白果蛋白質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，得到白果蛋白質(zhì)的最佳提取條件，為今后白果蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和其產(chǎn)品的深加工提供了可行性依據(jù)，對白果的綜合利用及新產(chǎn)品開發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白果郯城縣匯豐食品有限責(zé)任公司；牛血清蛋白質(zhì)南京三生生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍G250上海綠鳥科技發(fā)展公司；氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、石油醚（均為分析純） 天津市博迪化工有限公司。

K9860全自動凱氏定氮儀濟南海能儀器有限公司；MP511 pH計上海精密儀器；TU180紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司；臺式高速離心機上海盧湘儀器有限公司；高速組織粉碎機金壇市萬華實驗儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1白果蛋白提取工藝流程白果→脫種皮和胚芽→干燥（60℃）→粉碎過篩（60目）→石油醚脫脂→干燥（60℃）→提?。═ris-HCl法）→離心15 min→定容→含量測定。

1.2.2白果蛋白質(zhì)的提取及測定采用Tris-HCl提取法提取白果蛋白質(zhì)。采用凱氏定氮法測定脫脂白果粉中的總蛋白質(zhì)含量，參照GB 5009.5-2010；采用考馬斯亮藍法測定白果提取液中蛋白質(zhì)的含量，參照文獻［9-10］；白果蛋白質(zhì)提取率的計算公式為：

白果蛋白質(zhì)提取率（%）=提取液中蛋白質(zhì)含量/原料中蛋白質(zhì)含量×100

1.2.3提取白果蛋白質(zhì)的單因素實驗選取提取液濃度、pH、料液比及提取時間四個因素進行單因素實驗。固定pH8.0、料液比1∶25、提取時間6 h，提取液Tris-HCl濃度選取0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mol/L；固定提取液濃度0.2 mol/L、料液比1∶25、提取時間6 h，提取液pH采用4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0六個水平；固定提取液濃度0.2 mol/L、pH8.0、提取時間6 h，料液比采用1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）6個水平；固定提取液濃度0.2 mol/L、pH8.0、料液比1∶25；提取時間采用2、4、6、8、10、12 h六個水平，分別進行單因素實驗。

1.2.4響應(yīng)面法提取白果蛋白質(zhì)工藝研究在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上，對提取液濃度、pH、料液比及提取時間四個實驗進行了Box-Behnken實驗設(shè)計，進行響應(yīng)面分析，優(yōu)化工藝條件。實驗因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken實驗設(shè)計因素與水平值Table 1　Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.5數(shù)據(jù)處理方法用Excel和Design-Expert 6.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的圖表和數(shù)據(jù)分析。用Box-Behnken組合進行提取工藝優(yōu)化。

2　結(jié)果與分析

2.1白果蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

凱氏定氮法測定白果中的蛋白質(zhì)含量為10.27%，含水量7.21%。

2.2提取白果蛋白質(zhì)的單因素實驗

2.2.1提取液濃度對白果蛋白質(zhì)提取率的影響由圖1可見，在Tris-HCl濃度為0.1～0.2 mol/L的范圍內(nèi)隨著Tris-HCl濃度的提高，蛋白質(zhì)提取率不斷升高，當(dāng)Tris-HCl濃度為0.2 mol/L時，白果蛋白質(zhì)的提取率達到最高。繼續(xù)增加提取液濃度，蛋白質(zhì)提取率不斷下降?？赡苁沁M一步提高濃度時，離子的水合作用，降低了蛋白質(zhì)的溶解度［11］，從蛋白質(zhì)提取率及節(jié)約溶質(zhì)用量兩方面考慮，選擇0.2 mol/L的Tris-HCl溶液為白果蛋白質(zhì)的提取液。

圖1　提取液濃度對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1　Effect of Tris-HCl concentration on the extraction rate of Ginkgo protein

2.2.2pH對白果蛋白質(zhì)提取率的影響由圖2可知，當(dāng)提取液pH由pH4.0逐步升高到pH9.0時，白果蛋白質(zhì)提取率也逐漸增大，尤其在pH4.0～8.0之間規(guī)律更為明顯，但當(dāng)繼續(xù)增大pH，提取率增大不明顯。這是因為堿性條件可以會打破蛋白質(zhì)分子間的部分氫鍵［12］，從而促使淀粉和蛋白質(zhì)分離，增加了蛋白提取率。但是，過堿性環(huán)境會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性或水解，可能會影響蛋白質(zhì)的活性，因此提取白果蛋白質(zhì)的提取液pH應(yīng)控制在pH8.0左右。

圖2　pH對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2　Effect of pH on the extraction rate of Ginkgo protein

2.2.3料液比對白果蛋白質(zhì)提取率的影響圖3反映了料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響，圖中曲線顯示了蛋白質(zhì)提取率隨料液比的變化而變化，隨著溶劑量的增大，蛋白質(zhì)提取率隨之增大。當(dāng)水料比為1∶35時，蛋白質(zhì)提取率達到最大值，但是由圖可知在水料比由1∶30變?yōu)?∶35時，蛋白質(zhì)提取率的變化曲線走勢平緩。由于過高的水料比會產(chǎn)生大量的廢液，增大成本，所以最終將料液比定為1∶30。

圖3　料液比對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3　Effect of the solid-liquid rate on the extraction rate of Ginkgo protein

2.2.4提取時間對白果蛋白質(zhì)提取率的影響由圖4看出，提取時間在6 h時，蛋白質(zhì)提取率達到最高水平，其后隨著提取時間的進一步增加，蛋白質(zhì)提取率下降，但下降幅度不大，在6～12 h的區(qū)間內(nèi)，提取率從46.63%下降到36.02%，下降了10.41%。分析原因：給予白果粉充足的溶脹時間，有利于蛋白質(zhì)的分離溶解［13］，但若提取時間過長，則可能有部分蛋白質(zhì)出現(xiàn)凝聚沉淀，與不溶物質(zhì)一起在離心時除去了，而且時間加長也會加大生產(chǎn)成本，所以綜合各方面因素，認為浸提時間選4 h比較合適。

圖4　提取時間對白果蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on the extraction rate of Ginkgo protein

2.3響應(yīng)面法實驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行了響應(yīng)面優(yōu)化實驗，其實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

利用Design Expert 6.0軟件對表2響應(yīng)面分析結(jié)果進行回歸分析，對提取液濃度（A）、pH（B）、料液比（C）及提取時間（D）等四個因素進行回歸擬合，得到回歸方程為：Y=80.15+3.53A+4.48B+2.77C+1.78D-0.69A2-2.40B2-0.58C2-0.97D2-4.30AB-2.72AC-3.13AD-1.44BC+0.70BD-1.14CD

對該實驗?zāi)Ｐ偷娘@著性分析見方差分析表3。模型F=16.91，Pr＞F值＜0.0001表明此回歸模型是極顯著的。有0.01%的可能是因外界環(huán)境的干擾而發(fā)生變化。A、B、C、D、B2、AB、AC、AD的Pr＞F值均小于0.05，說明這些是顯著的模擬項。失擬項F=0.71，Pr＞F= 0.9999＞0.05表明失擬項相對于純誤差不顯著，且無失擬因素存在，回歸方程擬合充分，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。

各因素的F值大小可以反映因素對實驗指標的重要性，F(xiàn)值越大表明對實驗指標的影響越大［14］。由表3可知，F(xiàn)（A）=49.27，F(xiàn)（B）=79.39，F(xiàn)（C）=30.33，F(xiàn)（D）=12.58，且F（B）＞F（A）＞F（C）＞F（D），即各因素對白果蛋白提取率的影響順序為：pH＞提取液濃度＞料液比＞提取時間。

回歸方程中各因素系數(shù)的絕對值大小反應(yīng)了其對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正、負反應(yīng)影響的方向［15］。因為本方程的二次項系數(shù)是負值，代表3D圖形拋物面開口向下，有極大值，因此可以進行優(yōu)化分析［16］。

表2　Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2　Box-Behnken experiment design and the results of these experiments

表3　回歸模型方差分析Table 3　Variance analysis of the regression model

利用Design Expert軟件做不同因素間的響應(yīng)面分析圖和等高線圖。該圖組可直觀地反映各因素及其交互作用對蛋白質(zhì)提取率的影響。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素間交互作用較強，圓形則相反［17-18］。具體結(jié)果及分析見圖5～圖7所示。

圖5　提取液濃度和pH的交互作用Fig.5　The interaction of Tris-HCl concentration and pH

圖5表明，提取液濃度和pH的交互作用對白果蛋白質(zhì)的提取率有顯著影響。圖中曲線顯示，當(dāng)料液比和提取時間一定時，隨著提取液濃度的增大，白果蛋白質(zhì)提取率逐漸增大且趨于平緩，隨著pH的增大，白果蛋白質(zhì)提取率先增大隨后保持平緩的變化趨勢。提取液濃度和pH兩因素對白果蛋白質(zhì)提取率交互作用顯著。

圖6　提取液濃度和料液比的交互作用Fig.6　The interaction of Tris-HCl concentration and solid-liquid rate

圖6表明，當(dāng)pH和提取時間一定時，隨著提取液濃度的增大，白果蛋白質(zhì)提取率先增大隨后趨于平緩，隨著提取液濃度的增大，白果蛋白質(zhì)提取率先增大隨后有減小的趨勢。隨著料液比的增大，白果蛋白質(zhì)提取率先增大隨后趨于平緩。因此，提取液濃度和料液比兩因素對白果蛋白質(zhì)的提取率影響顯著。

圖7表明，當(dāng)pH和料液比一定時，增大提取液濃度白果蛋白質(zhì)提取率也隨之增大，達到最大之后趨于平緩，隨著提取時間的延長，白果蛋白質(zhì)提取率先增大隨后保持平緩的變化趨勢。因此，pH和料液比的交互作用對白果蛋白質(zhì)提取率具有顯著影響。

圖7　提取液濃度和提取時間的交互作用Fig.7　The interaction of Tris-HCl concentration and extraction time

2.4驗證實驗

經(jīng)軟件分析優(yōu)化，由該模型得到的最佳優(yōu)化條件為：提取液濃度為0.158 mol/L，pH8.67，料液比1∶25.78，提取時間5.15 h，且預(yù)測白果蛋白質(zhì)提取的理論值為83.01%?？紤]到實際操作性，將實驗條件修正為：提取液濃度為0.16 mol/L，pH8.7，料液比1∶26，提取時間5 h，在此修正條件下進行三次提取實驗，蛋白質(zhì)提取率的平均值為82.76%，與理論值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化白果蛋白質(zhì)的提取工藝是可行的。與李瑩瑩等［7］采用正交實驗優(yōu)化白果蛋白質(zhì)提取率75.01%相比，響應(yīng)面分析法提取具有較高的提取率。

3　結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法建立的數(shù)學(xué)模型方差分析說明模型顯著擬合度好，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。利用實驗?zāi)Ｐ瓦M行響應(yīng)面分析，對實驗因素及其相互作用進行探討，優(yōu)化提取白果蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件為：0.16 mol/L，pH8.7，料液比1∶26，提取時間5 h，且此條件下蛋白質(zhì)提取率的平均值為82.76%，與理論值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化白果蛋白質(zhì)的提取工藝是可行的。

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Optimization of Ginkgo protein extraction by response surface methology

ZHANG Xiu-yun1，LI Dan-dan2，MA Yan-fang3
（1.Department of Information Engineering，Laiwu Vocational and Technical College，Laiwu 271100，China；2.Heze Food and Drug Administration，Heze 274000，China；3.College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

The response surface analysis method was used to study the Ginkgo protein extraction process on the basis of single factor experiment with Ginkgo for materials，the effect of Tris-HCl concentration，pH，solidliquid rate，extraction time on the protein extraction yield was inspected.The research results showed that the optimal conditions for ginkgo protein extraction：0.16 mol/L，pH8.7，1∶26（g/mL），and 5 h.Under this condition，the yield of Ginkgo protein was 82.76%，compared to the theoretical value，the relative error of 0.30%.Optimized regression equation derived some practical significance.

Ginkgo protein；extraction；response surface method

TS251.1

B

1002-0306（2016）04-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.051

2015－07－24

張秀云（1980-），女，碩士，講師，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究，E-mail：zhangxiuyun1980@126.com.。