于志鵬，蔡佳彣，趙文竹，張宏陽，吳　雨，張　霜，勵建榮，*，劉靜波（.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州203；2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春30062）

基于二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計的藍蛤ACE抑制肽酶解工藝模型

于志鵬1，蔡佳彣1，趙文竹1，張宏陽1，吳雨1，張霜1，勵建榮1，*，劉靜波2，*
（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，
遼寧錦州121013；
2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林長春130062）

以藍蛤蛋白為原料，選用Protamex蛋白酶進行酶解并以水解度作為測定指標，在單因素實驗基礎(chǔ)上進行二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計，對獲得最優(yōu)工藝參數(shù)進行驗證，將獲得的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽進行ACE抑制活性測定和傅立葉紅外光譜分析。結(jié)果表明在底物濃度為10%，酶解pH為10，加酶量7%和酶解溫度60℃為最優(yōu)酶解條件，酶解1 h所得的藍蛤蛋白水解度為30.1%，利用高效液相色譜法對藍蛤活性肽進行體外ACE抑制活性測定表明其半抑制濃度為80 mg/mL，且活性肽溶液以無規(guī)卷曲空間構(gòu)型為主。

藍蛤，活性肽，酶解，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計

藍蛤（Aloididae aloidis）是盛產(chǎn)于我國沿海的一種重要低值海洋貝類，藍蛤中富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，且含量高達60%，氨基酸組成全面，其氨基酸總量和必需氨基酸總量均與貽貝相當，并且精氨酸的含量較高［1］。藍蛤由于個體較小，食用價值不大等諸多原因，多被作為對蝦活餌料［1-2］，造成豐富的藍蛤資源未得到充分利用?；陉懙刭Y源的有限性，海洋資源尤其是藍蛤等低值貝類資源的高值化利用將有效解決當前優(yōu)質(zhì)蛋白資源緊缺所面臨的難題。利用海洋蛋白資源開發(fā)活性肽備受關(guān)注，其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽成為研究的熱點之一。ACE抑制肽可以調(diào)節(jié)腎素血管緊張素系統(tǒng)-激肽釋放酶激肽系統(tǒng)，ACE能夠?qū)o升壓活性的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有升高血壓活性的血管緊張素Ⅱ，ACE抑制肽通過對ACE活性的抑制進而實現(xiàn)對高血壓的緩解作用。有文獻報道藍蛤酶解產(chǎn)物具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性［3］。目前對于ACE抑制肽的制備多采用外源蛋白酶進行酶解［4-5］，通過優(yōu)化設(shè)計等手段獲得最優(yōu)酶解條件。本研究擬利用外源性蛋白酶酶解藍蛤蛋白制備活性肽，酶解過程中實時監(jiān)測反應(yīng)體系水解度的變化，通過二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計建立外源酶制備藍蛤活性肽的最優(yōu)工藝，并采用高效液相色譜法測定藍蛤活性肽的ACE抑制活性，同時利用傅立葉紅外光譜對藍蛤ACE抑制肽的空間結(jié)構(gòu)進行了探索。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮藍蛤肉購于興隆大家庭購物中心（錦州）；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、卡托普利、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、馬尿酸美國Sigma公司；Protamex?蛋白酶（活力1.5 AU-N/g）諾維信公司；乙腈、甲醇和三氟乙酸（TFA） 色譜純，美國Thermo Fisher科技公司。

高效液相色譜儀美國安捷倫科技公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇大地自動化儀器廠；ZD-2雷磁電位滴定儀上海雷磁儀器廠；JJ-1精密增力電動攪拌器江蘇省金壇市自動化儀器廠；AG204型電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；RE 52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；KQ-100DB臺式數(shù)控超聲波清洗器成都一科儀器設(shè)備有限公司；IRPrestige-21傅里葉紅外光譜島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1藍蛤蛋白活性肽的酶解工藝取一定量新鮮藍蛤肉經(jīng)絞肉機絞成肉糜，并制成一定濃度的藍蛤肉糜水溶液轉(zhuǎn)移到水解瓶中。將裝有藍蛤肉糜溶液的水解瓶置于恒溫水浴鍋調(diào)整至相應(yīng)的底物濃度、加酶量、酶解溫度和pH條件下，加入一定量的Protamex?蛋白酶啟動水解。水解過程中不斷攪拌，每隔30 min測定酶解液pH，并不斷加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液以維持pH在規(guī)定的范圍內(nèi)（±0.05），水解完成后經(jīng)100℃滅酶10 min，9000×g離心10 min，取上清液冷凍干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2酶解藍蛤蛋白制備活性肽的單因素實驗以水解度為指標，經(jīng)單因素實驗初步考察酶解溫度、加酶量、底物濃度和pH四個因素對復合蛋白酶水解藍蛤蛋白制備活性肽的水解度的影響。

將藍蛤肉糜水溶液調(diào)整pH分別在8、9、10、11條件下，并在底物濃度5%、加酶量5%和50℃情況下酶解1 h，研究pH對藍蛤水解效果的影響。

設(shè)定藍蛤肉糜水解溫度分別為40、50、60、70、80℃，并在底物濃度5%、加酶量5%和pH10情況下酶解1 h，研究溫度對藍蛤水解效果的影響。

將加酶量分別設(shè)定為1%、3%、5%、7%、10%和12%，并在pH10、底物濃度5%和60℃情況下酶解1 h，研究pH對藍蛤水解效果的影響。

將藍蛤肉糜底物濃度分別配制為1%、5%、10% 和15%，并在pH10、加酶量5%和60℃情況下酶解1 h，研究pH對藍蛤水解效果的影響。

1.2.3酶解藍蛤蛋白制備活性肽二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計模型在單因素實驗基礎(chǔ)上，進行四元二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計優(yōu)化，分別考察溫度、加酶量、底物濃度和pH及其兩兩因素交互作用和因素二次項對水解效果的影響，因素水平見表1。

表1　因素水平編碼表Table 1　Experiment factors coding table

1.2.4酶解蛋白質(zhì)水解度（DH）的測定水解度測定采用pH-stat法［6］。

1.2.5血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的測定采用高效液相色譜法，在Wu等［7］方法基礎(chǔ)上進行了一些修改，取30 μL HHL底物液，加入10 μL抑制劑混合均勻，在（37±0.5）℃恒溫水浴中預(yù)熱3～5 min，然后加入20 μL ACE（2.0 U/mg protein）液充分混合，37℃保溫30 min后，再加入60 μL的1 mol/L HCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液，同時用10 μL pH為8.3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對照組［8-10］。該反應(yīng)液用0.45 μm濾膜過濾后直接用HPLC系統(tǒng)進行分析。色譜條件：Inertsil WP300 C18色譜柱（5 μm，125 mm×4.0 mm），柱溫25℃，流速0.5 mL/min，流動相乙腈/水（0.05% TFA）比例為25/75等梯度洗脫，檢測波長228 nm。

ACE抑制活性計算公式如下：

ACE抑制活性（%）=100×（M-N）/M

式中：M為空白對照組中馬尿酸的峰面積；N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。

配制不同濃度的藍蛤蛋白ACE抑制肽的水溶液，按照血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性測定方法測定，進而獲得不同濃度樣品對ACE活性的抑制率，以抑制率對藍蛤ACE抑制肽濃度（mg/mL）作圖，根據(jù)趨勢線獲得抑制率為50%時，對應(yīng)的藍蛤蛋白ACE抑制肽的濃度，即為半抑制濃度（IC50）。

1.2.6傅里葉變換紅外光譜分析（FTIR）采用KBr壓片法進行紅外光譜分析，具體操作：藍蛤蛋白源ACE抑制肽粉末1 mg與干燥的KBr粉末100 mg（預(yù)先放置于馬弗爐中200℃干燥10 h）混勻后置于瑪瑙研缽中研磨過篩，過篩后的粉末在紅外燈下壓片，采用KBr壓片法在波數(shù)為400～4000 cm-1范圍，利用紅外光譜儀IRPrestige-21進行測定，掃描方式采用透過率測定活性肽的紅外光譜圖。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel，SPSS以及Origin對數(shù)據(jù)進行處理分析，樣品測定結(jié)果采用平均值±標準偏差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果

2.1.1pH對水解效果的影響水解度變化趨勢見圖1。圖1表明pH在8～10時，水解度隨pH的升高而增加；pH10條件下的水解度最高；pH在10～11時，水解度降低。在pH10條件下復合蛋白酶水解藍蛤蛋白效果最佳，在此pH條件下藍蛤蛋白可能與復合蛋白酶的活性位點更好的結(jié)合進而提高了酶解效果。因此復合蛋白酶酶解藍蛤蛋白制備活性肽在pH10條件下進行后續(xù)的單因素實驗。

圖1　pH對水解效果的影響Fig.1　Influence of pH on the degree of hydrolysis

2.1.2溫度對水解效果的影響由圖2可以看出，溫度由40～60℃升高過程中，水解度逐漸升高；當酶解溫度升高到70～80℃時，水解效果降低，因此可以初步得出60℃時藍蛤肉糜水解效果較好。實驗結(jié)果證明在一定溫度范圍內(nèi)隨著溫度升高，酶促反應(yīng)和一般化學反應(yīng)一樣反應(yīng)速度加快；然而由于蛋白酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，當溫度超過一定數(shù)值后，隨著溫度逐漸升高，蛋白酶因逐漸變性而失活，導致水解度降低。

圖2　溫度對水解效果的影響Fig.2　Influence of temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3加酶量對水解效果的影響酶的用量增加有利于提高對底物蛋白質(zhì)的水解程度，但是從經(jīng)濟的角度講，其成本過高，因此應(yīng)當根據(jù)底物的情況來確定其合適的用量。加酶量對酶解效果的影響見圖3，經(jīng)單因素方差分析可知1%、3%、5%、7%、10%和12%加酶量組間水解度差異顯著（p＜0.05），對加酶量5%、7%、10%和12%進行單因素方差分析，結(jié)果表明組間差異不顯著。由圖3可知隨著加酶量的增加，水解度隨之升高，但在加酶量為5%時的水解度比加酶量3%時提高了5%，而比加酶量為12%時藍蛤蛋白的水解度僅低2%，綜合考慮初步選取加酶量為5%。

圖3　加酶量對水解效果的影響Fig.3　Influence of enzyme addition on the degree of hydrolysis

2.1.4底物濃度對水解效果的影響蛋白酶必須溶解于水才能均勻分散于藍蛤肉糜中，進而與底物接觸并對其發(fā)生作用，實驗結(jié)果如圖4所示。底物濃度在1%～10%范圍內(nèi)，酶解1 h的水解度由31.7%降低到28.3%僅降低3.3%，而當?shù)孜餄舛仍黾又?5%時水解度為18.03%，與底物濃度為1%條件下的水解度相比降低了13.67%。因此考慮在較高底物濃度下且有較高的水解度，初步選擇10%底物濃度為最佳條件。

2.2二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計模型的建立

在單因素實驗基礎(chǔ)上進行了二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計，其結(jié)果見表2，并進行了回歸系數(shù)的顯著性檢驗、回歸方程檢驗和失擬檢驗。

根據(jù)相關(guān)系數(shù)得到回歸方程：Y=0.249+0.031X1-0.02X4-0.014X12-0.116X22-0.019X32+0.004X42

表2　二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計實驗結(jié)果與分析Table 2　Results and analysis of the general rotary unitized design

表明方程在0.05水平下顯著，且在中心處滿足可見回歸方程在實驗中心處擬合得很好。

根據(jù)西爾維斯特不等式判別方程的極值［11］。設(shè)在穩(wěn)點x0=（x01，x02，...x0p）處，計算y=xj（j=1，2，…，p）的各階偏導數(shù)，并且定義行列式Dj，并對3個變量依次計算3個行列式：

根據(jù)西爾維斯特不等式判別方程可以得出方程有極大值，利用求駐點方法求得當水解度取得極值時，X1=1，X2=0，X3=0，X4=0。通過回歸系數(shù)檢驗（見表1）、回歸方程檢驗F回=6.5887和失擬檢驗Flf＜1，可以認為該方程為最優(yōu)回歸方程，將因素編碼表代入方程中，即在底物濃度為10%，酶解pH為10，加酶量7%和酶解溫度60℃條件下，酶解1 h所得的藍蛤蛋白水解度為29.4%，并經(jīng)實驗驗證（水解度為30.1%）與回歸方程優(yōu)化結(jié)果一致。

2.3藍蛤活性肽ACE抑制活性及紅外光譜分析

利用高效液相色譜法對藍蛤活性肽進行體外ACE抑制活性測定，結(jié)果表明其半抑制濃度為80 mg/mL，與目前已經(jīng)闡明其活性的酶解產(chǎn)物相比具有作為ACE抑制肽開發(fā)的潛力。通過傅里葉紅外光譜分析藍蛤ACE抑制肽的空間結(jié)構(gòu)，其光譜圖見圖5，由圖5可知藍蛤ACE抑制肽在1668 cm-1有強吸收峰，而在1200～1330 cm-1波數(shù)無強吸收峰，證明存在無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，而未形成穩(wěn)定的α螺旋、β轉(zhuǎn)角和β折疊結(jié)構(gòu)。

圖5　藍蛤ACE抑制肽紅外光譜Fig.5　FTIR spectrum of ACE inhibitory peptides from blue calm

3　結(jié)論

以藍蛤蛋白為原料，選用Protamex?蛋白酶進行酶解并獲得最優(yōu)酶解參數(shù)，即在底物濃度為10%，酶解pH為10，加酶量7%和酶解溫度60℃條件下，酶解1 h所得的藍蛤蛋白水解度為30.1%，利用高效液相色譜法對藍蛤活性肽進行體外ACE抑制活性測定表明其半抑制濃度為80 mg/mL，且活性肽溶液以無規(guī)卷曲空間構(gòu)型為主。

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Enzyme hydrolysis preparation model of ACE inhibitory peptides from blue clam based on quadratic general rotation design

YU Zhi-peng1，CAI Jian-wen1，ZHAO Wen-zhu1，ZHANG Hong-yang1，WU Yu1，ZHANG Shuang1，LI Jian-rong1，*，LIU Jing-bo2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，China）

Blue clam was hydrolyzed by protamex protease and measured by the degree of hydrolysis.The hydrolysis model of peptides from blue clam was established through quadratic general rotation design followed single factor experiment，subsequently ACE inhibitory activity and FTIR of blue clam-derived peptides was measured.The results showed that the equation for the optimal regression equation had a maximal value according to regression coefficient test，regression equation，and the lack of fit test.The optimal details of enzymatic hydrolysis was as follows：substrate concentration 10%，enzymatic hydrolysis pH value 10，the amount of enzyme 7%and hydrolysis temperature 60℃，and hydrolysis degree of blue clam protein was 30.1%in one hour.In vitro ACE inhibitory activity of bioactive peptides from blue clam was performed by high performance liquid chromatography，and the IC50value was 80 mg/mL.In addition，secondary structure of the blue calmderived peptides was random coil.

blue clam；bioactive peptide；enzymatic hydrolysis；angiotensin I-converting enzyme；general rotation design

TS201

A

1002-0306（2016）04-0250-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.042

2015－08－24

于志鵬（1984-），男，博士，講師，研究方向：蛋白質(zhì)及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開發(fā)，E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

勵建榮（1964-），男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品加工，E-mail：lijr6491@163.com。劉靜波（1962-），女，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)與功能食品，E-mail：ljb168@sohu.com。

國家科技支撐課題（2012BAD00B03）。