范三紅，杜靜婷，王相帥（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

響應(yīng)面法優(yōu)化油松花粉蛋白酶解工藝

范三紅，杜靜婷，王相帥
（山西大學生命科學學院，山西太原030006）

以油松花粉蛋白為原料，蛋白水解度為評價指標，對油松花粉蛋白酶解工藝進行研究。首次優(yōu)選出堿性蛋白酶為最佳水解酶，然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計挑選出對油松花粉水解工藝有顯著影響的三個因素：加酶量、pH和底物濃度。采用Box-Behnken中心組合實驗及響應(yīng)曲面分析法得到油松花粉蛋白水解的最優(yōu)工藝條件為：加酶量0.04 g/g樣品，pH11.1，底物濃度0.09 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃，油松花粉蛋白的水解度為79.07%。本文的研究為油松花粉多肽及其功能性食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

油松花粉，蛋白，蛋白酶水解，響應(yīng)面

油松又名松黃，泛指馬尾松、油松、赤松、黑松和云南松等松屬植物的雄性配子體，是我國傳統(tǒng)食藥兼用的花粉品種［1］。松花粉作為生命的遺傳物質(zhì)，含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素、必需脂肪酸等營養(yǎng)成分及黃酮，多糖等生物活性物質(zhì)［2-3］，而且配比合理，有“微型營養(yǎng)庫”之稱［4］，花粉內(nèi)部的蛋白質(zhì)含量為7%～35%，氨基酸占總量的20%左右［5］?，F(xiàn)代藥理藥效研究表明油松花粉及其提取物具有抗衰老、抗疲勞、促進生長發(fā)育、調(diào)整機體代謝、增強非特異性免疫功能、清除羥自由基等功效［6-7］，其保健和治療作用已得到國內(nèi)外廣泛的認可和應(yīng)用［8］。

通過對油松花粉蛋白的水解處理，可將蛋白酶解為多肽，有利于更好的開發(fā)油松花粉蛋白，有效提高油松花粉蛋白的利用率［9］。研究證明，將大分子的蛋白酶解成多肽以后，更有利于人體的吸收，使得油松花粉蛋白的功能特性得到充分體現(xiàn)，同時不破壞花粉原有營養(yǎng)價值［10］。尹樹花，郭麗梅采用正交法優(yōu)化了堿性蛋白酶水解油松花粉蛋白質(zhì)工藝［11］，并對兩種堿性蛋白酶的水解效果進行了對比［12］。李升軍等［13］把制備的油松花粉小肽加入化妝品中，初次研究了油松花粉在化妝品方面的應(yīng)用。本實驗利用PB因素篩選實驗和響應(yīng)面設(shè)計確定出了油松花粉的最佳酶解工藝條件，不僅準確度高，也為日后研究油松花粉多肽和開發(fā)油松花粉蛋白的功能性食品奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

油松花粉蛋白實驗室自制，純度85.66%；酸性蛋白酶5萬U/g、堿性蛋白酶20萬U/g、木瓜蛋白酶50萬U/g北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉分析純，天津化學試劑三廠；茚三酮分析純，上海三愛思試劑有限公司。

HRHS24型電熱恒溫水浴鍋青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；TG16A-WS型高速離心機武漢愛斯佩科學儀器有限公司；101-2AB型電熱鼓風干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；JP-040ST型超聲波清洗機深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；868型酸度計美國奧利龍公司；JA1203N型電子天平上海精密科學儀器有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1酶解工藝流程選擇一定的底物濃度→水浴→調(diào)節(jié)pH→加酶→水浴鍋水浴→煮沸滅酶→離心取上清液→測量水解度［14］。

1.2.2水解酶的篩選選取酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶及其復合酶分別對油松花粉蛋白進行水解。計算蛋白水解度，并篩選出水解油松花粉蛋白的最佳水解酶。

1.2.3油松花粉蛋白水解度的單因素實驗采用控制變量法，分別研究加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度五個因素對油松花粉蛋白水解度的影響［15］。

1.2.3.1加酶量在pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時間為3 h，酶解溫度為45℃，加酶量分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/g樣品的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.2pH在加酶量為0.03 g/g樣品，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時間為3 h，酶解溫度為45℃，pH分別為9、10、11、12、13的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.3底物濃度在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，酶解時間為3 h，酶解溫度為45℃，底物濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/mL的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.4酶解時間在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解溫度為45℃，酶解時間分別為1、2、3、4、5 h的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.3.5酶解溫度在加酶量為0.03 g/g樣品，pH為11，底物濃度為0.06 g/mL樣品，酶解時間為3 h，酶解溫度分別為35、40、45、50、55℃的條件下對油松花粉蛋白進行酶解。

1.2.4Plackett-Burman篩選實驗設(shè)計在單因素基礎(chǔ)上，對加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度五個因素進行顯著性篩選實驗，選擇對油松花粉蛋白水解度有顯著影響的因子，進行后續(xù)的響應(yīng)面實驗。

1.2.5響應(yīng)曲面實驗設(shè)計在單因素實驗和Plackett-Burman篩選實驗的基礎(chǔ)上，對所確定的因子進行Box-Behnken中心組合實驗，確定出油松花粉水解的最優(yōu)條件。

表1　Plackett-Burman實驗因素和水平Table 1　Range of different factors investigated with Plackett-Burman

表2　Box-Behnken實驗因素和水平Table 2　Factors and levels of Box-Behnken design

1.3水解度的測定和計算方法

采用茚三酮比色法測定水解度［16］，首先將煮沸滅酶的油松花粉蛋白水解液離心取其上清液4 mL，再加蒸餾水4 mL，取稀釋后的油松花粉蛋白水解液2 mL，加pH為8的緩沖溶液1.0 mL，茚三酮溶液1.0 mL，沸水浴加熱10～15 min，冷卻，在570 nm處測其吸光度值（蒸餾水做空白對照）。另取同樣條件的原油松花粉蛋白溶液，在570 nm處測其吸光度值，按照如下公式計算油松花粉蛋白水解度。

式中：A表示在標準曲線中查出的蛋白質(zhì)的質(zhì)量（μg）；w表示樣品質(zhì)量（g）；V1表示水解液的總體積（mL）；V2表示顯色時所稀釋液的體積（mL）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Minitab 15.0，Design Expert 8.0.6，Excel軟件分析實驗數(shù)據(jù)，并進行響應(yīng)面設(shè)計。

2　結(jié)果與分析

2.1水解酶的篩選

由圖1可以看到不同種類的酶和復合酶以及復合酶的比例對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，油松花粉蛋白水解的結(jié)果由圖1所示。單獨選取堿性蛋白酶時，水解度最大。選取酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及這三種酶復合水解時，油松花粉蛋白的水解度均有不同程度的降低。這可能是因為酶的專一性，實驗中蛋白來源是由堿提酸沉法所提取，堿溶性蛋白居多，因而選擇堿性蛋白酶時，油松花粉蛋白水解度最大［17］。

2.2油松花粉水解度的單因素實驗結(jié)果

2.2.1加酶量對油松花粉水解度的影響由圖2可以看出加酶量對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢隨著加酶量的提高而逐漸增大，但在加酶量大于0.04 g/g樣品后，水解度的增大趨勢明顯減小。這可能是因為加酶量在0.04 g/g樣品之后，蛋白的水解程度達到最大，酶解反應(yīng)已經(jīng)充分，再增加酶也無法促進水解反應(yīng)。考慮到節(jié)約材料，所以選擇最佳加酶量為0.04 g/g樣品。

圖1　不同種類的酶及其復合酶的不同比例對油松花粉蛋白水解度的影響Fig.1　Effect of different proportions of enzymes and different types of compound enzyme on the degree of hydrolysis of pine pollen

圖2　加酶量對水解度的影響Fig.2　Effect of total enzyme dose on hydrolysis degree

2.2.2pH對油松花粉蛋白水解度的影響由圖3可以看到pH對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，隨著pH的提高，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當pH 為11時，水解度達到最大。這可能是因為隨著pH增大，逐漸接近堿性蛋白酶的最適pH，當pH繼續(xù)增大，堿性太強，有可能酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，酶活性降低，使得水解度下降。

圖3　pH對水解度的影響Fig.3　Effect of pH on hydrolysis degree

2.2.3底物濃度對油松花粉蛋白水解度的影響由圖4可以看到底物濃度對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，隨著底物濃度的提高，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在底物濃度為0.08 g/mL時，水解度達到最大。這可能是因為在底物濃度過低時，油松花粉蛋白與水解酶的接觸不是很充分，而隨著底物濃度增大，水解反應(yīng)逐漸充分。在底物濃度過大時，溶液濃度較高，阻礙了與酶的接觸，使油松花粉蛋白水解度下降。

圖4　底物濃度對水解度的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis degree

2.2.4酶解時間對油松花粉蛋白水解度的影響由圖5可以看到酶解時間對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，在酶解的初期，隨著酶解時間的增加，油松花粉蛋白水解度也增大，但是在4 h之后，水解度趨于穩(wěn)定。這可能是因為隨著酶解時間的增加，水解反應(yīng)不斷的進行使得水解度也不斷增大，在4 h之后，蛋白的酶解反應(yīng)基本已經(jīng)充分，水解度不會有明顯的增大。

圖5　酶解時間對水解度的影響Fig.5　Effect of time on hydrolysis degree

2.2.5酶解溫度對油松花粉蛋白水解度的影響由圖6可以看到酶解溫度對油松花粉蛋白水解度的影響趨勢，隨著酶解溫度的上升，水解度先增大后減小，在溫度為50℃時達到最大。這可能是因為隨著酶解溫度的上升，水解酶的活性也在增大，促進了水解反應(yīng)的進行。溫度高于50℃時，酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活性下降，水解反應(yīng)得到抑制。

2.3Plackett-Burman實驗顯著影響因子的確定

圖6　酶解溫度對水解度的影響Fig.6　Effect of temperature on hydrolysis

表3　Plackett-Burman Design實驗結(jié)果Table 3　Response values of Plackett-Burman Design

2.3.1PB實驗設(shè)計處理及響應(yīng)值在單因素實驗基礎(chǔ)上，對加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度這五個因素進行Plackett-Burman實驗，以油松花粉蛋白水解度為響應(yīng)值，以此篩選出具有顯著性影響的因素。Plackett-Burman Design實驗結(jié)果見表3。2.3.2顯著影響因素的確定利用Minitab 15.0軟件油松花粉因素篩選實驗進行分析，得到PB實驗的回歸模型方差分析和回歸方程顯著性檢驗表。

表4　回歸模型方差分析表Table 4　Regression analysis of variance table

由表4可知，主效應(yīng)的p＜0.001，決定系數(shù)R2= 0.9651，說明實驗所得的擬合回歸方程達到顯著水平；校正決定系數(shù)R2adj=0.9361，表明本實驗的數(shù)據(jù)變異可以用此回歸方程來解釋，因此可以較好地確定關(guān)鍵影響因素。

由表5回歸方程顯著性檢驗表可知，因素A、B、C 的p值小于0.01，說明這三個因素對實驗具有極顯著的影響。因此，在油松花粉水解度的優(yōu)化實驗中，對A、B、C即加酶量、pH、底物濃度進行響應(yīng)面實驗設(shè)計。D、E分別選擇酶解時間5 h，酶解溫度50℃作為最優(yōu)工藝條件。

表5　回歸方程顯著性檢驗表Table 5　Regression equations significant test table

表6　Box-Behnken Design實驗設(shè)計與結(jié)果Table 6　Box-Behnken Design and response values

2.4響應(yīng)曲面實驗設(shè)計對最佳工藝條件的確定

2.4.1Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果以油松花粉蛋白水解度為響應(yīng)，利用Minitab 15.0軟件進行響應(yīng)曲面設(shè)計，Box-Behnken Design實驗設(shè)計與結(jié)果見表6。

對表6中數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到油松花粉蛋白水解度對溫度、加酶量、時間的三元二次回歸方程為：

Y=4.0800A+0.9752B+3.5900C-7.5308A2-9.6358B2-4.2808C2+2.4550AB-0.8900AC+0.0150BC+78.5376

表7　回歸方程方差分析Table 7　Analysis of variances for the fitted regression model

從回歸系數(shù)方差分析（表7）可以看出，本實驗所選的三元二次回歸模型具有較好的顯著性（p＜0.01），各因素對油松花粉蛋白的線性關(guān)系也呈現(xiàn)極顯著性（p＜0.01），平方項對該模型具有極顯著性（p＜0.01），交互作用不具有顯著性（p＞0.05）。決定系數(shù)R2=0.9778，校正決定系數(shù)R2adj=0.9380，說明該模型能解釋93.8%響應(yīng)值的變化，從失擬項在p=0.14＞0.05（不顯著），說明可以利用該回歸方程確定油松花粉蛋白的最佳水解度［17-19］。

表8　回歸系數(shù)顯著性分析Table 8　Significance test for each regression coefficient of the fitted regression model

從回歸系數(shù)顯著性分析（表8）可以看出，A、C、A2、B2、C2這幾個因素對油松花粉蛋白水解度的影響是極顯著的（p＜0.01），說明在該實驗中，加酶量、底物濃度對油松花粉蛋白水解度有極顯著影響，而從A2、B2、C2影響極顯著也可以看出，它們對油松花粉蛋白水解度的影響是非線性的［20-21］。

2.4.2響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化根據(jù)以上的分析利用Design Expert 8.0.6分別作出該響應(yīng)面分析的曲面圖形。圖7～圖9可以直觀的分析出加酶量、pH、底物濃度對油松花粉蛋白水解度的影響。

加酶量和pH的交互作用對油松花粉水解度的影響由圖7所示，加酶量在0.04～0.05 g/g樣品之間，pH 在10.5～11.5時，油松花粉蛋白水解度存在最大值。加酶量和底物濃度的交互作用對油松花粉水解度的影響由圖8所示，加酶量在0.04～0.05 g/g樣品之間，底物濃度在0.08～0.10 g/mL時，油松花粉蛋白水解度存在最大值。pH和底物濃度的交互作用對油松花粉水解度的影響由圖9所示，pH在10.8～11.2之間，底物濃度在0.08～0.10 g/mL時，油松花粉蛋白水解度存在最大值。

圖7　加酶量和pH交互影響水解度的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface for the effects of total enzyme dose and pH on hydrolysis degree

圖8　加酶量和底物濃度交互影響水解度的響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface for the effects of total enzyme dose andsubstrate concentration on hydrolysis degree

圖9　pH和底物濃度交互影響水解度的響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface for the effects of pH and substrateconcentration on hydrolysis degree

利用Minitab 15.0，對油松花粉蛋白水解度工藝條件經(jīng)行優(yōu)化預測，得出理論最佳工藝條件為：加酶量為0.043 g/g樣品，pH為11.091，底物濃度為0.089 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃，油松花粉蛋白水解度最大為80.029%。

2.4.3油松花粉蛋白水解工藝條件的驗證與確定為了進一步驗證響應(yīng)面實驗結(jié)論的準確性，同時考慮到實驗操作的可行性及方便性，對預測的最佳實驗條件進行修正：加酶量為0.04 g/g樣品，pH為11.1，底物濃度為0.09 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃。按照此優(yōu)化條件對油松花粉蛋白進行水解，實驗重復3次并取平均值作為最后實驗結(jié)果。據(jù)此得到油松花粉蛋白水解度為79.13%、78.99%、79.08%，平均蛋白水解度為79.07%，與預測值80.29%相差不大，說明本模型能較好的預測油松花粉蛋白水解度的實際效果，具有很好的應(yīng)用價值。

3　結(jié)論

油松花粉蛋白的酶解工藝中，篩選出堿性蛋白酶為水解油松花粉蛋白質(zhì)的最佳選擇，加酶量、pH、底物濃度、酶解時間、酶解溫度5個單因素中，加酶量、pH和底物濃度達到了極顯著水平。對這3個因素進行優(yōu)化分析，得出最佳水解工藝為加酶量0.04 g/g樣品，pH11.1，底物濃度0.09 g/mL，酶解時間5 h，酶解溫度50℃，在此條件下油松花粉水解度可達到79.07%。通過對油松花粉蛋白酶解工藝的優(yōu)化能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)提取的關(guān)鍵共性技術(shù)有理論與實際應(yīng)用方面的指導意義，為促進油松花粉資源高值化利用和精深加工提供一定的技術(shù)支撐。

［1］田志環(huán).松花粉與人體健康［J］.解放軍保健醫(yī)學雜志，2007，9（4）：255-256.

［2］Nergiz c，Donmez i.Chemical composition and nutritive value of pinus pinea L.seeds［J］.Food Chemistry，2004，86：365-368.

［3］范三紅，劉艷榮，楊民樂，等.油松花粉多糖分離純化及結(jié)構(gòu)分析的初步研究［J］.食品科學，2009，30（15）：127-129.

［4］Markovic-housley z，Degano m，Lamnad，et al.Crystalstructure of a hypoallergenic isoform of the major birch pollen allergen Bet v1 and its likely biological function as a plantsteroid carrier［J］. Journal of Molecular Biology，2003，325（1）：123-133.

［5］Paul Ig.The allerg en profile of ash（Fraxinus excelsior）pollen：cross-reactivity with allerg ens from various plant species［J］. Clinical and Ex-perimental Allergy，2002，32（6）：933-941.

［6］范三紅，周立波.油松花粉多糖提取及其清除羥自由基活性研究［J］.食品科學，2008，29（12）：274-277.

［7］張俊剛，徐穎，蔣東升等，油松花粉對小鼠非特異性免疫功能及NK細胞活性的影響［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（1）：30-31.

［8］范三紅，王相帥，王亞云，等.油松花粉蛋白提取工藝的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（22）：246-249.

［9］尹樹花，郭麗梅.堿性蛋白酶水解法制備油松花粉肽的研究［J］.食品科技，2008，33（2）：101-103.

［10］Wei H C，Cai Q Y，Rahn R O，et al.Inhibition of Uv light and fenton reaction induced oxdative DNA damage by the soybean isoflavone genistein［J］.Carcinogen Sis，1996，17：73.

［11］尹樹花，郭麗梅.堿性蛋白酶水解法制備油松花粉肽的研究［J］.食品科技，2008，33（2）：101-103.

［12］尹樹花，郭麗梅.兩種蛋白酶水解油松花粉蛋白的比較［J］.現(xiàn)代食品科技，2007，23（11）：68-70，74.

［13］李升軍，馮韌，陳瑾，等.油松花粉小肽及多功能化妝品的制備［J］.中國洗滌用品工業(yè)，2009（1）：84-86.

［14］董新紅，趙謀明，蔣躍明，等.超聲波法在提取多糖類化合物中的應(yīng)用研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（3）：155-163.

［15］薛靜玉，陳復生，丁長河.用響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶制備生物活性大豆肽的條件［J］.河南紅葉大學學報：自然科學版，2012，33（2）：19-24.

［16］郭興鳳.蛋白質(zhì)水解度的測定［J］.中國油脂，2000，25（6）：176-177.

［17］鄭冬梅，李升福，孔保華，等.玉米蛋白水解條件的優(yōu)化研究［J］.食品科學，2002，23（8）：52-56.

［18］胡筱波，徐明剛，劉志偉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化油菜花粉谷蛋白酶解條件［J］.食品科學，2007，28（7）：117-121.

［19］張強，闞國仕，陳紅漫，等.酶解玉米蛋白粉制備抗氧化肽［J］.食品工業(yè)科技，2005，26（6）：109-111.

［20］韓雅珊.食品化學實驗指導［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，1996.

［21］安金雙，王迪，馬士淇，等.響應(yīng)面法優(yōu)化灰樹花中多糖超聲波提取工藝的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（6）：11-14.

Optimization of hydrolysis of Chinese pine pollen protein by response surface methodology

FAN San-hong，DU Jing-ting，WANG Xiang-shuai
（College of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

With protein of Chinese pine pollen as the raw material protein hydrolysis degree as an evaluation index，this paper aimed to study the process conditions of pine pollen proteolysis.The alkaline protease was choosen as the bast hydrolase.On the basis of single factor experiment，the Plackett-Burman screening test was adopted to determine three factors（which signifcantly affect）significantly affecting hydrolysis of Chinese pine pollen as：total enzyme dose，pH and substrate concentration.Then，the hydrolysis process conditions of pine pollen protein was optimized by Box-Behnken center combination experiment and response surface methodology.Results showed that the optimum conditions for hydrolysis were as follows：enzyme concentration 0.04 g/g，pH11.1，substrate concentration 0.09 g/mL，enzymatic time 5 h，enzymatic temperature 50℃.Under the optimal conditions，the hydrolysis degree of Chinese pine pollen protein could reach 79.07%.This study provided a theoretical basis for the development of Chinese pine pollen peptides and functional foods.

pine pollen；protein；protease hydrolysis；response surface

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0236-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.039

2015－06－10

范三紅（1963-），男，副教授，研究方向：食品科學，E-mail：fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科學基金項目（2012011031-4）；山西省高等學校高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目（20111003）。