唐雅茹，于上富，國(guó)立東，2，王娜娜，霍貴成，*（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱50030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱50030）

一株產(chǎn)膽鹽水解酶植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

唐雅茹1，于上富1，國(guó)立東1，2，王娜娜1，霍貴成1，*
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

為了提高植物乳桿菌Lactobacillus plantarum KLDS1.0386的膽鹽水解酶產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，最終獲得最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖18.2 g/L、蛋白胨15.03 g/L、酵母粉9.97 g/L、乙酸鈉3.13 g/L、檸檬酸氫二銨2.00 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L。優(yōu)化前植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的比酶活為1.04 U/mg，經(jīng)過培養(yǎng)基的優(yōu)化后，膽鹽水解酶的比酶活為3.37 U/mg，比優(yōu)化前提高了3.24倍。且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果誤差在允許范圍內(nèi)，說明該模型可以投入使用。

植物乳桿菌，培養(yǎng)基組成，膽鹽水解酶，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

隨著人們生活水平的提高，高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，醫(yī)學(xué)研究表明［1］，人體內(nèi)膽固醇含量過高是心血管疾病發(fā)生的重要原因之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于乳酸菌降膽固醇的研究越來越多，乳酸菌在生長(zhǎng)代謝的過程中會(huì)產(chǎn)生膽鹽水解酶［2］（bile salt hydrolase，BSH），它是一種胞內(nèi)酶，能將體內(nèi)的結(jié)合膽鹽降解成游離膽酸和氨基酸，游離膽酸能與血清中的膽固醇發(fā)生共沉淀，隨糞便一同排出體外，因此降低了膽固醇水平［3-4］。所以提高細(xì)菌中膽鹽水解酶的含量，對(duì)降低膽固醇水平具有很重要的意義［5-7］。國(guó)內(nèi)方面利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化BSH的培養(yǎng)基成分報(bào)道比較少，為了提高膽鹽水解酶活力，本實(shí)驗(yàn)選擇了植物乳桿菌KLDS1.0386，該菌具有很好的益生特性，而且體外降膽固醇能力達(dá)到55.71%，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，篩選出影響B(tài)SH比酶活的3個(gè)顯著性因素，并進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定出實(shí)驗(yàn)因素的中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，最終進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立培養(yǎng)基成分與膽鹽水解酶比酶活之間的回歸方程模型，以期為以后高產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌發(fā)酵制品的開發(fā)和研制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌KLDS1.0386分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC）提供；茚三酮上海惠世生化試劑有限公司；95%乙醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司；MRS液體培養(yǎng)基天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)，牛血清白蛋白，溶菌酶。

GL-21M型離心機(jī)上海市離心機(jī)研究所；VD-1320型潔凈工作臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；YH-2S型遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；XK96-A型快速混勻器姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；DU800型紫外分光光度計(jì)美國(guó)Beckman公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線挑取平板上的植物乳桿菌單菌落，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)2次后，以2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 h于紫外分光光度計(jì)上測(cè)一次OD620，直到24 h，記錄菌的生長(zhǎng)情況，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2BSH比酶活測(cè)定將植物乳桿菌KLDS1.0386傳代培養(yǎng)2次后，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定初期，離心（10000×g，4℃，10 min）留菌體，用磷酸緩沖液清洗兩次后，加入VC磷酸緩沖液和溶菌酶溶液，37℃水浴30 min后，在冰浴條件下進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎（600 W，15 min），離心后留上清，即為粗酶液。

采用茚三酮顯色法來測(cè)定BSH酶活［8］，取0.1 mL的粗酶液，加入0.1 mL的50 mmol/L牛磺脫氧膽鹽溶液、0.8 mL的pH6.0的磷酸鈉緩沖液，振蕩混勻后37℃水浴30 min，之后冷卻終止反應(yīng)，加入0.5 mL的三氯乙酸（15%，w/v）沉淀蛋白質(zhì)，3 min后離心（10000×g，4℃，10 min），留上清液，并加入1.5 mL的茚三酮顯色液，混勻后沸水浴15 min，冰浴至室溫，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)得在570 nm處的最大吸收值。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)［9］，比酶活定義為每毫克蛋白質(zhì)所含的膽汁鹽水解酶的單位（U）數(shù)。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)以普通MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖作為碳源，添加量為20 g/L，進(jìn)行比酶活測(cè)定，從而確定最佳碳源。

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，將氮源分別替換成蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、大豆蛋白胨、牛肉膏，添加量為25 g/L，進(jìn)行比酶活測(cè)定，確定最佳氮源。

在最佳碳源和氮源基礎(chǔ)上，進(jìn)行復(fù)合氮源的優(yōu)化，參考相關(guān)文獻(xiàn)［10］后共設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)，1號(hào)：蛋白胨5 g/L、酵母粉20 g/L，2號(hào)：蛋白胨10 g/L、酵母粉15 g/L，3號(hào)：蛋白胨15 g/L、酵母粉10 g/L，4號(hào)：蛋白胨20 g/L、酵母粉5 g/L，篩選出膽鹽水解酶產(chǎn)量最高的氮源組合。1.2.4Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖、蛋白胨和酵母粉對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量有很重要的影響，并且參考相關(guān)文獻(xiàn)［10-11］后可知，乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、硫酸錳、硫酸鎂都會(huì)有重要影響，所以此8種成分，被選為Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的影響因素，膽鹽水解酶比酶活作為響應(yīng)值。利用軟件Design Expert進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，每一因素設(shè)置高（+1）、低（-1）兩個(gè)水平，高水平為低水平的1.5倍，總共進(jìn)行12組實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而篩選出對(duì)膽鹽水解酶比酶活影響最顯著的因素。

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1　Factors and levels of Plackett-Burman experiment

1.2.5最陡爬坡實(shí)驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的顯著性結(jié)果，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，篩選出膽鹽水解酶比酶活最高時(shí)顯著性因素的濃度梯度。

1.2.6Box-Behnken實(shí)驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用Design Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，3個(gè)影響因素，3個(gè)水平，共形成15組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expet軟件進(jìn)行回歸分析，確定優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基。

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 2　Factors and levels table of Box-Behnken experiment

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS 19分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，離散度通過標(biāo)準(zhǔn)差來表示，結(jié)果數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2　結(jié)果與討論

2.1植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線

植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線如圖1所示，該菌生長(zhǎng)情況穩(wěn)定，8 h時(shí)就進(jìn)入了對(duì)數(shù)期，當(dāng)培養(yǎng)到15 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期初期，可用于酶活的測(cè)定。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1最佳碳源的篩選在微生物的生長(zhǎng)代謝過程中，碳源是必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［12］，選用最佳碳源，可以讓微生物的生長(zhǎng)達(dá)到最佳狀態(tài)。如圖2所示，幾種碳源對(duì)植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的影響不同，其中葡萄糖對(duì)膽鹽水解酶比酶活影響最大，可達(dá)0.96 U/mg，可溶性淀粉的影響最小，比酶活為0.28 U/mg，因此最佳碳源確定為葡萄糖。

圖1　植物乳桿菌KLDS1.0386的生長(zhǎng)曲線Fig.1　The grow curve of Lactobacillus plantarum KLDS1.0386

圖2　不同碳源對(duì)膽鹽水解酶比酶活的影響Fig.2　Effect of different carbon sources on BSH production

2.2.2最佳氮源的篩選以葡萄糖為碳源，分別添加25 g/L的蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、硫酸銨、酵母粉作為氮源，研究不同氮源對(duì)膽鹽水解酶活性的影響。結(jié)果如圖3所示，氮源不同，膽鹽水解酶的產(chǎn)量也不同，其中蛋白胨和酵母粉對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量有很大的促進(jìn)作用，比酶活分別為0.9 U/mg、0.85 U/mg，因此被選出進(jìn)行復(fù)合氮源優(yōu)化。

圖3　不同氮源對(duì)膽鹽水解酶比酶活的影響Fig.3　Effect of different nitrogen sources on BSH production

2.2.3最佳組合氮源的篩選從四種組合中篩選出最佳的氮源組合，由圖4可知，2號(hào)和4號(hào)對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量影響較大，其中4號(hào)的膽鹽水解酶比酶活達(dá)到1.49 U/mL，酵母粉能夠?yàn)榫纳L(zhǎng)提供生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但由于高含量的酵母粉可能會(huì)抑制該菌的生長(zhǎng)，少量即能達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)。

圖4　不同氮源組合對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of different mixed nitrogen sources on BSH production

2.3Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的回歸分析如表4所示，當(dāng)Prob＞F值小于0.05時(shí)，說明該因素對(duì)膽鹽水解酶的產(chǎn)量有顯著影響，而且F值越大，該因素對(duì)膽鹽水解酶的比酶活影響越大。對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量影響顯著的依次是：A、B、E，且可信度在95%置信區(qū)間內(nèi)，回歸方程為：Y=1.78+0.15A+0.058B+0.042C+8.333E-003D-0.052E-0.032F+0.025G-0.018H，R2=0.9933，說明方程擬合很好，而其他因素對(duì)膽鹽水解酶產(chǎn)量影響很小。因此選擇A、B、E 3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，篩選出顯著性因素的產(chǎn)BSH最佳濃度梯度。

表3　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　The results of Plackett-Burman experimental design

表4　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的回歸分析表Table 4　Regression analysis table of Plackett-Burman design

2.4最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以葡萄糖、蛋白胨和乙酸鈉作為影響因素，步長(zhǎng)為1 g/L，結(jié)果如表5所示，當(dāng)葡萄糖為18 g/L、蛋白胨為15 g/L、乙酸鈉為3 g/L時(shí)，植物乳桿菌KLDS1.0386所產(chǎn)膽鹽水解酶含量最高，因此，該組合被定為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表5　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5　Experimental results of the steepest ascent path

2.5Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)2.4最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，各因素編碼及結(jié)果如表6所示。以膽鹽水解酶比酶活為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行3因素，15次的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，并利用Design-Expet軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)式方程：Y=3.24+0.13A+ 0.015B+0.05E+0.01AB-0.04BE-0.34A2-0.2B2-0.2E2，決定系數(shù)R2=0.9648。由表7可知，模型p=0.0040＜0.05，說明方程擬合度較好；p失擬項(xiàng)為0.5659＞0.05，說明失擬不顯著；校正性決定系數(shù)R2Adj=0.9015，表明該模型可信度較高，可用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算。

2.6模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上模型預(yù)測(cè)，當(dāng)顯著性因素葡萄糖為18.20 g/L、蛋白胨為15.03 g/L、乙酸鈉為3.13 g/L時(shí)，模型預(yù)測(cè)值為3.256 U/mg，在上述條件下進(jìn)行三次模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的膽鹽水解酶比酶活為（3.37± 0.21）U/mg，與誤差在允許范圍內(nèi)，因此該模型具有一定的實(shí)踐價(jià)值，可以很好地預(yù)測(cè)該菌產(chǎn)膽鹽水解酶實(shí)際發(fā)酵情況。

表6　響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6　Response surface central composite design and experimental results

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出適合植物乳桿菌產(chǎn)膽鹽水解酶的最佳碳源和組合氮源，然后采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)法對(duì)初始培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行了篩選，最終選出葡萄糖、蛋白胨和乙酸鈉為影響植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的顯著因素。利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定了顯著因素的最佳濃度值，并以此為中心點(diǎn)進(jìn)行了Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，

表7　模型方差分析表Table 7　Anova analysis of model equations

最終確定了植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的最佳培養(yǎng)基成分為：葡萄糖18.2 g/L、蛋白胨15.03 g/L、酵母粉9.97 g/L、乙酸鈉3.13 g/L、檸檬酸氫二銨2.00 g/L、磷酸氫二鉀2.00 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L。優(yōu)化前植物乳桿菌KLDS1.0386產(chǎn)膽鹽水解酶的量為1.04 U/mg，經(jīng)過培養(yǎng)基的優(yōu)化后，膽鹽水解酶的比酶活為3.37 U/mg，比優(yōu)化前提高了3.24倍。

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Optimization of fermentation medium of Lactobacillus plantarum KLDS1.0386 for bile salt hydrolase production

TANG Ya-ru1，YU Shang-fu1，GUO Li-dong1，2，WANG Na-na1，HUO Gui-cheng1，*
（1.Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，College of Pharmacy，Harbin 150030，China）

In order to improve the bile salt hydrolase production of Lactobacillus plantarum KLDS1.0386，the response surface method was used to optimize the medium composition.The optimal values of the culture medium were as follows（g/L）：glucose 18.2 g/L，peptone 15.03 g/L，yeast extract 9.97 g/L，sodium acetate 3.13 g/L，diammonium hydrogen citrate 2.00 g/L，K2HPO42.00 g/L，MnSO40.25 g/L，MgSO40.58 g/L.Before optimizing，the activity of bile salt hydrolase was 1.04 U/mg，Under the optimal conditions，specific enzyme activity of bile salt hydrolase was 3.37 U/mg，increasing 3.24 times than before.The experimental result was consistent with the value predicted by the mathematical model.which showed the model can be put into use.

Lactobacillus plantarum；medium composition；bile salt hydrolase；response surface method

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0232-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.038

2015－07－17

唐雅茹（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：yarutang@126.com。

霍貴成（1958-），男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：gchuo58@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金；國(guó)家863項(xiàng)目（2011AA100902）。