劉晶晶，湯會(huì)芳，郭芝琳，韓曜平，王雪鋒，戴陽(yáng)軍（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

河蜆肉抗氧化肽的分離及活性研究

劉晶晶，湯會(huì)芳，郭芝琳，韓曜平，王雪鋒，戴陽(yáng)軍
（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

目的：為制備具有抗氧化活性的河蜆肉抗氧化肽。方法：河蜆肉酶解液經(jīng)膜分離后，采用Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱進(jìn)行分離，得到抗氧化性最強(qiáng)的組分經(jīng)CM Sepharose FF離子交換層析柱進(jìn)一步分離，并對(duì)各組分的體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：經(jīng)Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱分離得到5個(gè)活性組分A、B、C、D和E，其中組分C的抗氧化活性較強(qiáng)，其總抗氧化能力A700 nm、羥自由基清除率和DPPH自由基清除率分別為1.79、83.33%和26.35%。組分C經(jīng)CM Sepharose FF離子交換層析柱進(jìn)一步分離得到2個(gè)活性組分C1和C2，其中C2的抗氧化活性最強(qiáng)，總抗氧化能力A700 nm、羥自由基清除率和DPPH自由基清除率分別為2.03、92.34%和35.94%。結(jié)論：河蜆酶解液抗氧化肽的羥自由基清除能力突出，該研究為河蜆肉抗氧化肽的開(kāi)發(fā)提供理論技術(shù)依據(jù)。

河蜆肉，抗氧化肽，分離

目前，食品行業(yè)由于利益驅(qū)使，普遍使用化學(xué)合成的抗氧化劑，其本身具有毒副作用，因此，天然抗氧化劑的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。世界各國(guó)科學(xué)家開(kāi)發(fā)出的各種天然抗氧化劑產(chǎn)品，受到了人們的廣泛歡迎。近年來(lái)，從水產(chǎn)蛋白中提取抗氧化活性肽的研究也逐漸展開(kāi)，如已從鱗魚(yú)、鯖魚(yú)、巨魷魚(yú)皮、白蝦頭和黃鰭金槍魚(yú)骨架蛋白中提取出具有顯著抗氧化活性的肽段［1］，這充分證明水產(chǎn)品中的優(yōu)質(zhì)蛋白具有制備抗氧化肽的潛力。

河蜆，學(xué)名（Corbicula fluminea），又稱黃蜆、金蚶、扁螺等，是雙殼類軟體動(dòng)物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一。它們生長(zhǎng)速度快、繁殖能力強(qiáng)，養(yǎng)殖方法簡(jiǎn)單，資源極為豐富［2］。河蜆肉蛋白酶解物中含有大量短肽、多肽及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，并產(chǎn)生了一些具有特殊生理功能的生物活性肽，具有廣泛應(yīng)用前景。邱春江等［3］利用木瓜蛋白酶水解花蜆蛋白，得到的酶解物具有很強(qiáng)的清除羥自由基能力。劉杰等［4］研究了河蜆酶解液具有顯著的清除超氧陰離子自由基和羥自由基作用。張磊等［5］探討了河蜆提取物可能通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)酒精性肝損傷有保護(hù)作用。吳立峰等［6］報(bào)道河蜆糖蛋白對(duì)小鼠化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用。王一錚等［7］研究了河蜆湯對(duì)小鼠急性乙醇肝損傷的保護(hù)作用。JS Tsai等［8］研究了河蜆肌肉蛋白水解物對(duì)血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶具有一定的抑制作用。而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)河蜆抗氧化肽的分離未見(jiàn)報(bào)道，本論文通過(guò)對(duì)河蜆肉酶解液中抗氧化肽進(jìn)行分離，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析，為河蜆天然抗氧化肽的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，從而提高河蜆深加工產(chǎn)品的品質(zhì)和附加值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

速凍河蜆肉江蘇省宿遷楠景水產(chǎn)品有限公司；中性蛋白酶（60000 U/g） 上海奧宇生物科技有限司公司；氫氧化鈉、鹽酸、DPPH、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris（三羥基氨基甲烷）、氫氧化鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、乙醇、乙酸、過(guò)氧化氫、鄰氮二菲、氯化鈉以上試劑均為分析純。

EL104電子天平梅特勒—托利多儀器有限公司；BCD-216TDXZA超低溫冰箱青島海爾股份有限公司；BSZ-30自動(dòng)部分收集器、DHL-B電腦數(shù)顯定式恒流泵上海滬西分析儀器廠；高速組織搗碎機(jī)上海比朗儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；pHS-2F型數(shù)字pH計(jì)、UV-754紫外分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；ALPHA1-4冷凍干燥機(jī)德國(guó)MARTIN CHRIST公司；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AKTA自動(dòng)快速蛋白純化系統(tǒng)、HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱（Φ5.0 cm×100 cm）、CM Sephrose FF離子交換層析柱（Φ26 cm×30 cm） 美國(guó)GE公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1河蜆肉酶解液的制備按照參考文獻(xiàn)［9］制備河蜆酶解液。

1.2.1.1工藝流程新鮮河蜆肉→流水解凍→勻漿→調(diào)節(jié)pH→加入中性蛋白酶→酶解→滅酶→冷卻→4000 r/min離心20 min→上清液→濾膜超濾→濾過(guò)液（河蜆肉酶解液）→冷凍干燥→粗肽。

1.2.1.2操作要點(diǎn)河蜆肉預(yù)處理：將新鮮河蜆肉常溫流水解凍，在低溫條件下，按1∶2（g/mL）的料液比加水后用組織搗碎機(jī)勻漿，即可得到河蜆肉勻漿液。

河蜆肉酶解工藝：取一定量的河蜆肉勻漿液，調(diào)節(jié)pH至6.0，按照0.94%（以河蜆肉計(jì)）的比例添加中性蛋白酶，在55.36℃酶解4 h，酶解完成，100℃下滅酶20 min，低溫條件（10℃）下4000 r/min離心20 min，取出上清液，經(jīng)5000 u濾膜超濾后，即可獲得河蜆肉酶解液。

酶解液冷凍干燥：將河蜆肉酶解液真空冷凍干燥10 h，即可得到河蜆肉酶解液粉末，冷藏備用。

1.2.2河蜆肉酶解液中抗氧化肽的分離純化參照參考文獻(xiàn)［10-12］分離河蜆酶解液的抗氧化肽。

取河蜆肉酶解液冷凍干燥粉末，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/mL的溶液，通過(guò)高速冷凍離心機(jī)在低溫下離心30 min，取上清液，經(jīng)濾膜過(guò)濾后，利用Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱對(duì)該溶液進(jìn)行分離純化。上樣量為2 mL，以蒸餾水為洗脫液，通過(guò)自動(dòng)部分收集器分管收集，流速為0.5 mL/min，每5 min收集一管，在檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm處測(cè)定收集洗脫液的吸光值，合并同一分離峰的洗脫液，將合并的洗脫液冷凍干燥制成粉末，冷藏待用。

將Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱分離得到的抗氧化性較強(qiáng)組分C配制成50 mg/mL的溶液經(jīng)CM Sephrose FF離子交換層析柱進(jìn)一步分離純化。上樣量為0.5 mL，用1 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，每5 min收集一管，通過(guò)自動(dòng)收集器分管收集活性成分。在檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm處測(cè)定收集洗脫液的吸光值，合并同一分離峰的洗脫液，將合并的洗脫液冷凍干燥制成粉末，冷藏待用。

1.2.3各組分抗氧化活性的測(cè)定稱取一定量經(jīng)Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱分離得到的五個(gè)組分A、B、C、D、E和經(jīng)CM Sepharose FF離子交換層析柱進(jìn)一步分離得到的兩個(gè)組分C1和C2的凍干粉，配制成0.5 mg/mL的溶液。根據(jù)劉杰［13］、吳燕燕等［14］的方法對(duì)其總抗氧化性、羥自由基的清除率和DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3.1總抗氧化性的測(cè)定（三價(jià)鐵離子還原力） 取1 mL樣品，加入0.2 mol/L的pH6.6的PBS溶液1 mL，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，混合物置于50℃水浴中保溫20 min，再添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液1 mL，充分混合后1000 r/min離心4 min。取1 mL上清液，加入1 mL去離子水和0.1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的三氯化鐵溶液0.2 mL，振蕩混勻后在50℃下保溫10 min。在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，以去離子水代替樣品作為空白。

1.2.3.2羥自由基的清除率的測(cè)定取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液0.5 mL，加入0.2 mol/L的PBS（pH7.4）1.0 mL，充分混勻，加入0.5 mL樣品溶液以及0.75 mmol/L的硫酸亞鐵0.4 mL，充分混勻，加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為0.01%的雙氧水，混勻后，37℃水浴1 h，測(cè)定樣品液在波長(zhǎng)536 nm處的吸光度A樣品。按照上述操作，采用去離子水代替樣品測(cè)定損傷管吸光度A損，采用去離子水代替樣品液和雙氧水測(cè)得未損傷管吸光度A未損。等體積的樣品PBS和去離子水在536 nm處的吸光值為A參。等體積的去離子水和PBS在536 nm出的吸光值為A空。羥自由基清除率計(jì)算公式為：

1.2.3.3DPPH自由基清除能力測(cè)定取1.0 mL的樣品，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液1.0 mL，混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min，1000 r/min低溫離心10 min，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值A(chǔ)i?？瞻捉M為0.5 mL無(wú)水乙醇代替DPPH乙醇溶液，加入0.5 mL去離子水，測(cè)定其在517 nm處的吸光值A(chǔ)j。對(duì)照組為0.5 mL DPPH乙醇溶液，加入0.5 mL的去離子水代替樣品，在517 nm處測(cè)定其吸光值A(chǔ)0。DPPH自由基清除率按以下公式計(jì)算：

2　結(jié)果與分析

2.1河蜆肉酶解液中抗氧化肽的分離純化

圖1　河蜆肉酶解液經(jīng)Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱洗脫曲線Fig.1　Elution profile of enzymatic hydrolysates of Corbicula flumineaon by Sephacryl S-100 HR

圖1為河蜆肉酶解液經(jīng)丙烯葡萄糖凝膠Sephacryl S-100的洗脫曲線。丙烯葡萄糖凝膠層析，是將樣品經(jīng)過(guò)丙烯葡萄糖凝膠層析柱，以丙烯葡萄糖凝膠作為固定相，選擇合適的液體作為流動(dòng)相，樣品隨著流動(dòng)相移動(dòng)，不同分子量的樣品由于受到凝膠的阻力不同，隨流動(dòng)相流出層析柱所需的時(shí)間也會(huì)不同，由此就可以達(dá)到分離目的。由圖1可知，河蜆肉酶解液經(jīng)Sephacryl S-100分離，共得到五個(gè)清晰的洗脫峰，按出峰順序，分別命名為A、B、C、D和E。對(duì)每一個(gè)分離峰進(jìn)行收集。

圖2　組分C經(jīng)CM Sepharose FF離子交換層析柱洗脫曲線Fig.2　Elution profile of component C by CM Sepharose FF ion-exchange chromatography

圖2為組分C經(jīng)CM Sepharose FF離子交換層析柱的洗脫曲線。CM Sepharose FF離子交換層析柱是通過(guò)利用離子交換劑與原樣之間電荷相反的性質(zhì)，從而使原樣中帶某種電荷的分子被分離基質(zhì)所吸附，然后用梯度的鹽濃度將樣品從離子交換層析柱中洗脫下來(lái)，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離純化的目的。由圖2可知，組分C經(jīng)CM Sepharose FF離子交換層析柱分離，共得到兩個(gè)清晰的峰，記為C1和C2，合并同一分離峰的洗脫液。

2.2各組分的抗氧化活性分析

2.2.1總抗氧化活性分析圖3為各組分的總抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果，由圖3可知，河蜆肉酶解液經(jīng)丙烯葡萄糖凝膠Sephacryl S-100分離后得到的五個(gè)組分A、B、C、D和E都表現(xiàn)出抗氧化活性，在700 nm處的吸光值分別為0.45、1.32、1.79、0.82和0.51，組分B 和C的總抗氧化性能明顯高于A、D、E三個(gè)組分；組分C經(jīng)CM Sepharose FF離子交換層析柱后得到的C1 和C2在700 nm處的吸光值分別為0.98和2.03，且組分C和C1、C2之間的抗氧化活性都存在顯著性差異（p＜0.05）。

圖3　各分離組分總抗氧化活性比較Fig.3　Comparation the antioxidant activity between different fractions

2.2.2羥自由基清除能力的分析圖4為各組分的羥自由基清除能力結(jié)果，由圖4可知，組分C2清除羥自由基的活性最強(qiáng)，高達(dá)92.34%；其次為組分C和C1，羥自由基清除率分別為83.33%和74.51%；組分A、B、D和E羥自由基清除率分別為68.71%、67.22%、19.44% 和23.89%。

圖4　各分離組分羥自由基清除能力比較Fig.4　The hydroxyl radicals scavenging activity of different fractions

2.2.3清除DPPH自由基能力的分析圖5為河蜆肉酶解液分離各組分的DPPH自由基清除能力結(jié)果，由圖5可知，C2組分清除DPPH的能力最強(qiáng)，高達(dá)35.94%；其次為B、C和C1，DPPH自由基清除能力分別為27.15%、26.35%和28.65%，且三者之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05）；組分A、D和E清除DPPH自由基清除率也沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），分別為23.04%、21.43%和20.63%。

圖5　各分離組分DPPH自由基清除能力比較Fig.5　DPPH radical scavenging abilities of different fractions

3　結(jié)論

河蜆肉酶解液經(jīng)膜分離后，采用Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱和CM Sepharose FF離子交換層析柱進(jìn)行分離，得到7個(gè)不同組分，即A、B、C、D、E、C1和C2，其中C2的抗氧化活性最強(qiáng)，總抗氧化能力A700 nm、羥自由基清除率和DPPH自由基清除率分別為2.03、92.34%和35.94%。由此可見(jiàn)，河蜆酶解液抗氧化肽的羥自由基清除能力突出，為開(kāi)發(fā)河蜆天然抗氧化產(chǎn)品提供了很好的依據(jù)。

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Separation and activity assay of antioxidant peptides from Corbicula fluminea meat

LIU Jing-jing，TANG Hui-fang，GUO Zhi-ling，HAN Yao-ping，WANG Xue-feng，DAI Yang-jun
（Department of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，China）

Objective：In order to separate the antioxidant peptides from Corbicula fluminea meat.Methods：In this experiment，enzymatic hydrolysates of Corbicula fluminea meat were isolated by Sephacryl S-100 HR gel chromatography after membrane separation，the oxidation resistance of the strongest components was further purified by CM Sepharose FF ion exchange chromatography and antioxidant activity in vitro of each group was measured.Results：The result showed that the enzymatic hydrolysates of Corbicula fluminea meat was fractionated into five active fractions by ephacryl S-100 HR gel chromatography，named as A，B，C，D and E. Among these，the fraction C showed the higher antioxidant activity，the total antioxidant capacity，scavenging ability of hydroxyl and DPPH radical were 1.79，83.33%，26.35%，respectively.Component C was further separated into two active components by CM Sepharose FF ion exchange chromatography，named as C1 and C2，the fraction C2 showed the highest antioxidant activity，the total antioxidant capacity，scavenging ability of hydroxyl and DPPH radical were 2.03，92.34%，35.94%，respectively.Conclusions：The radical scavenging ability of Corbicula fluminea meat was outstanding，which provides a theoretical basis for the deep processing of the peptide.

Corbicula fluminea meat；antioxidant peptide；separation

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0169-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.025

2015－06－15

劉晶晶（1978-），女，碩士，副教授，研究方向：食品加工和天然產(chǎn)物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用，E-mail：ljj@cslg.edu.cn。

2013年度江蘇省蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201303）。