薛艷鋒，郝力壯，劉書杰（青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與生態(tài)國家重點實驗室培育基地，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，青海高原牦牛研究中心，青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016）

不同地區(qū)牦牛肉中FABP基因Real-time PCR表達差異分析

薛艷鋒，郝力壯，劉書杰*
（青海省高原放牧家畜營養(yǎng)與生態(tài)國家重點實驗室培育基地，青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，青海高原牦牛研究中心，青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海西寧810016）

為了研究不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)的差異，本實驗從大通、九龍、河南、迪慶、紅原五個地區(qū)采集4歲公牦牛肌肉樣品，提取總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的作用下生成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用Real-time PCR檢測牦牛肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的表達水平。將迪慶地區(qū)牦牛作為對照組，肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的cDNA實時熒光定量的2-ΔΔCt值設定為1，則大通、九龍、河南、紅原地區(qū)的牦牛肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的cDNA實時熒光定量的2-ΔΔCt值分別為4.18、2.94、9.95、10.73，從而得出不同地區(qū)牦牛肌肉中脂肪酸結(jié)合蛋白基因的相對表達水平，在分子水平上更加準確地評估不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)。實驗結(jié)果表明，紅原和河南地區(qū)的牦牛肉品質(zhì)最優(yōu)，而迪慶地區(qū)牦牛肉品質(zhì)較差。

脂肪酸結(jié)合蛋白，實時定量PCR，基因表達，牦牛肉品質(zhì)

牦牛肉蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低［1-2］，富含人體所必需的各種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素，是一種高品質(zhì)的肉類［3］。但牦牛肉由于肌纖維較粗［4］，且肌間脂肪和肌內(nèi)脂肪含量較低，使牦牛肉的大理石花紋評分低，嫩度差，導致牦牛肉的整體感官和口感次于其他牛肉［5］。

牦牛肉品質(zhì)受到多種因素的影響，包括營養(yǎng)水平［6］、飼養(yǎng)方式［7］、屠宰運輸［8］、加工手段［9］等非遺傳因素和牦牛品種［10］、基因調(diào)控等遺傳因素。目前，已經(jīng)有很多學者通過測定牦牛肉的常規(guī)營養(yǎng)成分和食用品質(zhì)對牦牛肉進行研究和評定［11］，但還很少有人通過基因表達的層面來評定牦牛肉品質(zhì)以及通過基因調(diào)控來改善牦牛肉品質(zhì)。脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty Acid Binding Protein，F(xiàn)ABP）基因是調(diào)控肉品質(zhì)的主效基因［12-15］，F(xiàn)ABP是一類存在于細胞質(zhì)中的小分子量蛋白質(zhì)，易與脂肪酸和其他有機溶解物相結(jié)合，而作為脂肪酸運輸?shù)妮d體，在細胞內(nèi)脂肪酸的代謝過程中起到重要作用［16］。FABP廣泛存在于各種組織當中，其中以心肌和骨骼肌中含量最為豐富。

如果能夠通過基因調(diào)控的方法，提高FABP基因在牦牛肌肉中的表達量，就可以增加牦牛肉肌內(nèi)脂肪含量，提高牦牛肉的嫩度和適口性，使牦牛肉風味鮮嫩、柔軟多汁，提高牦牛肉的營養(yǎng)價值和食用品質(zhì)，增加牧民經(jīng)濟收入，促進藏區(qū)的穩(wěn)定和繁榮。本實驗通過熒光定量技術(shù)測定FABP基因在不同地區(qū)的牦牛肉中的相對表達量，從基因的水平評定不同地區(qū)牦牛肉的品質(zhì)差異，為利用基因調(diào)控的手段改善牦牛肉的品質(zhì)奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

公牦牛背最長肌樣品分別從大通（青海）、河南（青海）、九龍（四川）、紅原（四川）、迪慶（云南）五個地區(qū)采集現(xiàn)殺的4歲放牧公牦牛第12～13肋骨間的背最長肌樣品（所用的鑷子、手術(shù)刀、剪刀等都嚴格滅菌），裝于5 mL凍存管中，迅速存放于液氮中，帶回實驗室后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中，備用；利用GenBank中介紹的牦牛（Bos grunniens）FABP基因（GenBank Accession No：EU815937.1）和β-ACTIN基因（GenBank Accession No：BT030480），通過核心序列利用Premier 5.0軟件設計5’和3’端特異性引物（見表1），引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成；Total RNA提取試劑盒北京Solarbio公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量染料大連TaKaRa公司；無水乙醇（99.7%）上?？低鼗び邢薰?，用以洗滌RNA；微量吸頭、無菌手套、無菌口罩上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。

表1　牦牛FABP基因cDNA克隆引物Table 1　cDNA clone primers of yak FABP gene

移液槍德國Eppendorf公司；PCR擴增儀、Realtime PCR儀、核酸電泳儀美國BIO-RAD公司；高速冷凍離心機美國Sigma公司；凝膠成像系統(tǒng)英國SYNGENE公司。

1.2實驗方法

1.2.1Total RNA的提取取出-80℃凍存的肌肉樣品，稱量100 mg左右，錫紙包好，置于液氮中；將肌肉樣品轉(zhuǎn)移到2 mL的tube管中，加入1 mL裂解液，勻漿器勻漿；室溫靜置5 min，使核酸蛋白質(zhì)完全分離；加入0.2 mL的氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3～5 min；2～8℃，12000 r/min，離心10 min；將包含有RNA的上層無色水相轉(zhuǎn)移到新的tube管中；吸附柱前處理：在吸附柱中加入500 μL的洗柱液，室溫靜置2 min，2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；向上清水相中加入200 μL的乙醇，轉(zhuǎn)入吸附柱靜置2 min；2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；向吸附柱中加入600 μL的漂洗液，2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；向吸附柱中加入600 μL的漂洗液，2～8℃，12000 r/min，離心2 min，棄廢液；12000 r/min，離心2 min，棄掉收集管；將吸附柱置于室溫條件下1 min，使殘余的漂洗液去除；將吸附柱放入新的2 mL的tube管中，向膜中央加入50～100 μL的RNase free H2O，室溫靜置5 min；20℃，12000 r/min，離心2 min，即得到RNA于tube管中。

1.2.2cDNA的合成參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦的方法，將提取到的牦牛肌肉樣品的Total RNA進行反轉(zhuǎn)錄（冰上操作），通過PCR得到cDNA。采用20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×Primescript?Buffer 4 μL；Primescript?RT Enzyme MixⅠ1 μL；Oligo dT primer 1 μL；Random 6 mers 1 μL；Total RNA 1 μL；RNase free H2O 12 μL。反轉(zhuǎn)錄反應條件如下：37℃，15 min（反轉(zhuǎn)錄反應）；85℃，5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應）。

1.2.3DNA的合成利用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，通過普通PCR擴增成DNA（冰上操作）。采用25 μL反應體系：Template 1 μL；FABP primer F 0.5 μL；FABP primer R 0.5 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTP 2 μL；Taq DNA polymerase 1 μL；ddH2O 17.5 μL。PCR擴增條件：Cycle 1：預變性94℃30 s；Cycle 33：變性95℃5 s，退火59℃30 s，延伸72℃30 s；Cycle 1：72℃3 min。

1.2.4Real-time PCR反應參考TaKaRa試劑盒推薦方法，以合成的牦牛肌肉樣品的cDNA為模板，通過Real-time PCR反應得到不同地區(qū)牦牛肌肉樣品的Ct值（冰上操作）。采用25 μL反應體系：Template 2 μL；FABP primer F 1 μL；FABP primer R 1 μL；SYBR 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL。同時還是選擇內(nèi)參β-ACTIN F-β-ACTIN R進行Real-time PCR作為對照。Realtime PCR反應條件：Cycle 1：預變性94℃30 s；Cycle 39：變性94℃5 s，退火60℃30 s。

1.2.5數(shù)據(jù)分析通過比較閾值法（2-ΔΔC）t進行相對定量［17］。Ct為樣品的PCR擴增反應的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。以迪慶地區(qū)的牦牛肌肉樣品作為對照樣，并將其FABP基因的2-ΔΔCt值設為1進行閾值比較，根據(jù)公式：2-ΔΔCt=2-（［實驗組FABP Ct-實驗組β-ACTINCt）-（對照組FABP Ct-對照組β-ACTIN Ct）］計算大通、九龍、河南、紅原四個地區(qū)FABP基因的相對表達水平。采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計處理，SAS 9.1.3軟件中Anova程序進行單因素方差分析，采用SPSS 17.0進行各組之間的顯著性檢驗和p值的計算。

2　結(jié)果與分析

2.1提取的Total RNA的檢測

不同地區(qū)牦牛肌肉樣品提取的Total RNA在1%的瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果。

從RNA電泳圖上可以清楚地看到28S、18S兩條亮帶，并且28S條帶的亮度大約是18S條帶亮度的2倍，無拖帶、雜帶，因此所提取的RNA質(zhì)量較高。

2.2克隆出的FABP基因DNA的檢測

不同地區(qū)牦牛肌肉樣品FABP基因克隆出的DNA在1%的瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果。

圖1　不同地區(qū)牦牛肌肉樣品RNA電泳圖Fig.1　RNA electrophoretogram of yak muscle samples from different regions

圖2　FABP基因克隆出的DNA的電泳圖Fig.2　Electrophoretogram of DNA cloned from FABP gene

此圖由提取的Total RNA反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，再通過普通PCR擴增成DNA得到的電泳圖。利用在編碼區(qū)兩側(cè)設計的牦牛FABP引物擴增目的DNA，獲得約310 bp［18］的DNA片段，本實驗應用DL2000的Marker可以清楚地看出條帶在250～500 bp之間。

2.3FABP基因Real-time PCR熒光定量

由1.2.5中提供的公式計算得出不同地區(qū)FABP基因的相對定量的拷貝數(shù)（見圖3）。

圖3　FABP基因相對定量拷貝數(shù)Fig.3　Relative quantitative copy number of FABP gene

本實驗以大通、九龍、河南、迪慶、紅原這五個地區(qū)的牦牛背最長肌為樣品，通過對FABP基因的cDNA重復3次進行熒光定量PCR檢測法，測出它們的平均△Ct值，再根據(jù)比較閾值法進行相對定量得到最后的結(jié)果。

表2　不同地區(qū)牦牛FABP基因熒光定量PCRTable 2　Fluorogenic quantitative PCR of yak FABP gene from different regions

根據(jù)測定的各個地區(qū)的Ct值，利用SPASS 17.0分析軟件計算得出五個地區(qū)FABP基因表達量的差異顯著性如表4所示。

表4　不同地區(qū)FABP基因表達量差異顯著性分析Table 4　Significant analysis of FABP gene’s expression quantity in different regions

根據(jù)計算的結(jié)果和圖3可以看出，紅原和河南牦牛背最長肌中FABP基因的2-△△Ct值最高，分別為10.73、9.95，接下來依次是大通、九龍、迪慶，分別為4.18、2.94、1.00。結(jié)合表4，可以看出，紅原和河南兩個地區(qū)牦牛背最長肌中FABP基因的2-△△Ct值與迪慶FABP基因的2-△△Ct值之間的差異顯著（p＜0.05）。

3　結(jié)論與討論

郝稱莉等［19］的研究表明，不同部位肌肉的FABP基因的表達量與肌肉內(nèi)脂肪含量出現(xiàn)不同程度的正相關，F(xiàn)ABP基因?qū)?nèi)脂肪沉積具有正調(diào)控作用。Michal等［20］，Jurie等［21］，Lee等［22］的研究表明，F(xiàn)ABP基因與牛肉大理石花紋密切相關，影響牛肉品質(zhì)。Hoashi等［23］，Cho等［24］，Barendse等［25］，Narukami等［26］的研究表明FABP基因調(diào)控牛肉脂肪酸的組成和脂肪的沉積，是調(diào)控牛肉品質(zhì)的主效基因。因此本實驗通過FABP基因的表達水平反應牦牛肌內(nèi)脂肪含量，評估不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)。謝榮清等［27］測定4.5歲紅原牦牛肌肉的脂肪含量為5.34%；邱翔等［28］測定3～4歲九龍牦牛肌肉的脂肪含量為2.84%；張永輝［29］和劉勇［30］研究成年大通牦牛的肌肉脂肪含量分別為2.05%和1.83%。眾多學者從營養(yǎng)成分層面的研究結(jié)果與本實驗的紅原、河南、大通、九龍、迪慶五個地區(qū)牦牛背最長肌中FABP基因的表達水平依次降低基本一致，再次證明了本研究結(jié)果的可信度。

表3　不同地區(qū)牦牛FABP基因的Ct值對比Table 3　Ct values’comparison of yak FABP gene from different regions

紅原、河南、大通、九龍、迪慶五個地區(qū)牦牛背最長肌中FABP基因熒光定量ΔCt的平均值分別為-0.43、-0.32、0.93、1.44、2.99，2-ΔΔCt值分別為10.73、9.95、4.18、2.94、1.000，也就是說紅原、河南、大通、九龍、迪慶五個地區(qū)牦牛背最長肌中FABP基因的表達水平依次下降，導致肌內(nèi)脂肪含量和嫩度依次下降。因此，單從牦牛FABP基因的表達量考慮，紅原、河南地區(qū)牦牛肉的品質(zhì)最高，而迪慶地區(qū)牦牛肉的品質(zhì)最差。牦牛肉品質(zhì)的進一步評定還需要結(jié)合大理石花紋、吸水率、蒸煮率、剪切力、其他相關基因表達水平等指標。不同地區(qū)牦牛肉品質(zhì)的差異可能是由于牦牛品種、牧草營養(yǎng)水平等因素造成的。因此，不同營養(yǎng)水平、不同能量水平、不同添加劑水平、不同飼養(yǎng)方式、不同牦牛品種對FABP基因表達量和肌內(nèi)脂肪沉積量，以及最終對牦牛肉品質(zhì)的影響，將成為未來研究的重點和熱點，不斷優(yōu)化牦牛品種，確定最佳營養(yǎng)水平、能量水平、飼養(yǎng)方式，從而提高牦牛肉品質(zhì)，增加牦牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益，對于促進藏區(qū)穩(wěn)定和繁榮都有著深遠的意義。

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Analysis of FABP gene’s expression difference in yak meat from different regions by Real-time PCR

XUE Yan-feng，HAO Li-zhuang，LIU Shu-jie*
（State Key Laboratory of Cultivating Base of Plateau Grazing Animal Nutrition and Ecology of Qinghai Province，Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province，Qinghai Plateau Yak Research Center，Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine，Xining 810016，China）

In order to research the difference of yak meat’s quality in different regions，total RNA was extracted from 4-year-old male yak’s muscle samples of Datong，Jiulong，Henan，Diqing，Hongyuan，and then cDNA was generated under the action of reverse transcription polymerase，at last，the production of reserve transcription reaction was utilized to carry out RT-PCR and detect the expression levels of FABP gene.The results were that if the yak muscle sample of Diqing was taken as the control group and the 2-ΔΔCtvalue of it was set to 1，the fluorescence quantitative 2-ΔΔCtvalue of Datong，Jiulong，Henan，Hongyuan yak muscles were 4.18，2.94，9.95，10.73 respectively.So that the relative expression quantity of FABP gene in yak muscles could be obtained to evaluate yak meat’s quality in different regions on molecular level.The yak meat’s quality of Hongyuan and Henan was the best while that of Diqing was the worst.

FABP；Real-time PCR；expression；yak meat quality

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0147-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.020

2015－05－29

薛艷鋒（1990-），男，碩士研究生，研究方向：動物營養(yǎng)與飼料科學，E-mail：945982845@qq.com。

劉書杰（1966-），男，研究員，研究方向：高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼草料開發(fā)，E-mail：mkylshj@126.com。

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973項目）（2012CB722906）；國家科技支撐計劃（2009BAC61B03-1）。