馬景蕃，劉喜明，陳小紅（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖64012；2.福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖64012；.龍巖學(xué)院藝術(shù)與設(shè)計(jì)學(xué)院，福建龍巖64012）

不結(jié)球白菜體外抗氧化活性部位的篩選與研究

馬景蕃1，2，劉喜明3，陳小紅1，2
（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；
2.福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建龍巖364012；3.龍巖學(xué)院藝術(shù)與設(shè)計(jì)學(xué)院，福建龍巖364012）

應(yīng)用DPPH自由基清除法、羥自由基清除法、超氧陰離子自由基清除法、ABTS+·清除法四個抗氧化指標(biāo)對不結(jié)球白菜的5個不同極性部位石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)，同時考察了總酚和總黃酮的含量與抗氧化能力的關(guān)系，并對活性最強(qiáng)部位進(jìn)行了脂質(zhì)抗氧化研究。結(jié)果表明，除水相外，不結(jié)球白菜其他4個極性部位均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力?？偡雍涂傸S酮的含量與各部位的抗氧化能力具有顯著相關(guān)性。乙酸乙酯相清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基、ABTS+·的EC50值分別為（0.64±0.05）、（1.17±0.12）、（1.02±0.15）、（0.78±0.07）mg/mL；乙酸乙酯相的抗氧化能力最高，其總酚的含量為（151.32±1.87）mg GAE/g DW，總黃酮含量為（32.97±0.56）mg rutin/g DW；10 mg/mL的乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化的抑制率達(dá)到62.11%，對H2O2誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制率為51.26%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不結(jié)球白菜乙酸乙酯相具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是天然抗氧化活性物質(zhì)的良好來源。

不結(jié)球白菜，抗氧化活性，總酚，總黃酮，脂質(zhì)過氧化

已有研究表明，由于自由基的增多，會引起機(jī)體脂質(zhì)過氧化的增強(qiáng)，自由基及其所介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生［1］。占當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域前三位的心血管疾病、腫瘤和衰老均與自由基引起的脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)［2］。因此，預(yù)防和治療這些疾病，自由基清除劑或抗氧化劑的研究應(yīng)用是非常重要的。人工合成的抗氧化劑，如二丁基羥基甲苯（BHT）等，雖然具有一定抗氧化效果，但研究表明也可能會引起肝臟損壞，甚至?xí)T發(fā)癌癥［3］。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，很多的中草藥［4］、蔬菜和水果［5］都具有抗氧化活性，從這些藥用或食用植物中找尋低毒安全的天然抗氧化劑己成為抗氧化劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）是長江中下游地區(qū)主栽蔬菜品種之一［6］，中醫(yī)認(rèn)為不結(jié)球白菜微寒味甘，有養(yǎng)胃生津、除煩解渴、利尿通便、清熱解毒之功效［7］。國內(nèi)外學(xué)者從不結(jié)球白菜中分離得到一系列復(fù)雜的化學(xué)成分，其中相當(dāng)一部分具有生理活性［8］。最新研究還發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜提取物能提升血中“好”雌激素代謝物—2羥雌酮的水平，對預(yù)防乳腺癌有益［9］。有關(guān)不結(jié)球白菜提取物清除自由基的研究多集中于乙醇總提物及多糖等成分［10］，為了系統(tǒng)的評價(jià)不結(jié)球白菜總提物不同極性部位的抗氧化活性，本文用不同極性溶劑提取不結(jié)球白菜，利用體外抗氧化活性體系篩選出活性部位，并對其總酚和總黃酮含量進(jìn)行測定，旨在為系統(tǒng)開發(fā)不結(jié)球白菜資源在食品、藥品和保健品領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持，以延長產(chǎn)業(yè)鏈，為不結(jié)球白菜的深度利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

不結(jié)球白菜品種“蘇州青” 由龍巖學(xué)院生物技術(shù)課題組提供；2，2’-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑－6－磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美國Sigma公司；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、FeSO4、H2O2、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、鄰苯三酚、NaNO2、Al（NO3）3、沒食子酸、蘆丁等均為國產(chǎn)分析純；ICR雄性小鼠實(shí)驗(yàn)動物許可號［SCXK-（京）-2012-001］，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

WFM-10型振動中藥磨粉機(jī)江陰市昶衡機(jī)械設(shè)備有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；UV762紫外可見分光光度計(jì)上海儀電分析儀器有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；FA1004電子天平長沙科怡儀器設(shè)備有限公司；Scientz-18ND冷凍干燥機(jī)上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不結(jié)球白菜不同極性部位的制備不結(jié)球白菜采收后，用聚乙烯膜真空包裝，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎過60目篩。稱取100 g干燥粉末，用500 mL 75%乙醇超聲提取35 min，再回流提取3 h，抽濾，濾渣重復(fù)以上操作一次，合并兩次濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，即為不結(jié)球白菜提取物（16.57 g）。將提取物用蒸餾水超聲溶解35 min，得到水懸液，將其轉(zhuǎn)入500 mL的分液漏斗中，依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，合并各自的萃取液并保留最后的水相，依次得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的萃取物［11］。各部位經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥至恒重，置于4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抗氧化活性測定

1.2.2.1清除DPPH自由基能力測定按照文獻(xiàn)［12］的方法略作改動，配制6.5×10-5mol/L DPPH的乙醇溶液，分別吸取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品和DPPH的乙醇溶液置于試管中，搖勻，黑暗條件下室溫反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定吸光度值（A）i；分別吸取2 mL DPPH的乙醇溶液與無水乙醇于試管中，反應(yīng)后于517 nm處測定其吸光度值（A）c；再分別吸取2 mL待測樣品液和無水乙醇于試管中，反應(yīng)后在517 nm處測定吸光度值（A）j。用VC為陽性對照，按式（1）計(jì)算其清除率，并計(jì)算待測樣品液的半數(shù)抑制濃度（EC5）0。

1.2.2.2清除羥自由基能力測定參照Chaieb等［13］的方法略作改動，取0.2 mL 10 mmol/L的FeSO4-EDTA混合液于試管中，加入0.5 mL 10 mmol/L的α-脫氧核糖溶液，再加入0.2 mL不同濃度的待測樣品液，用pH7.4的0.1 mol/L磷酸緩沖液定容至1.8 mL，然后加入0.2 mL 10 mmol/L的H2O2，混勻后于37℃恒溫水浴中反應(yīng)1 h，再加入2.8%的三氯乙酸（TCA）溶液1 mL，1%的硫代巴比妥酸（TBA）溶液1 mL，混勻后于沸水浴中反應(yīng)15 min，冷卻后在532 nm處測定吸光值為Ai，用0.2 mL蒸餾水代替待測樣品液，測得吸光值（Ac），用磷酸緩沖液代替脫氧核糖溶液測得吸光值（Aj）。用VC為陽性對照，按式（1）計(jì)算其清除率，并計(jì)算待測樣品液的半數(shù)抑制濃度（EC50）。

1.2.2.3清除超氧陰離子能力測定參照文獻(xiàn)［14］的方法略加改動，取0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH=8.0）2.25 mL于試管中，分別加入0.5 mL不同濃度的待測樣品液和25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.2 mL，充分混勻后在25℃水浴中反應(yīng)5 min，再加入0.5 mL 80 mmol/L 的HCl終止反應(yīng)，在420 nm處測定吸光值A(chǔ)i，用0.5 mL 1%二甲基亞砜（DMSO）的無水乙醇代替樣品液，測得吸光值（Ac）；為排除供試液顏色干擾，用0.5 mL的無水乙醇代替鄰苯三酚溶液，測得吸光值（Aj）。用VC為陽性對照，按式（1）計(jì)算其清除率，并計(jì)算待測樣品液的半數(shù)抑制濃度（EC50）。

1.2.2.4清除ABTS+·能力測定參考Saiga等［15］的方法并加以改進(jìn)，將7 mmol/L ABTS溶液10 mL與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液10 mL混合，旋渦均勻后置于室溫黑暗條件下12～16 h，用以制備ABTS+·。用95%乙醇將制備的ABTS+·溶液稀釋至其在波長734 nm處的吸光值為0.70±0.02。將l00 μL不同質(zhì)量濃度（0.025～0.4 mg/mL）的待測樣品溶液加入3.9 mL ABTS+·溶液中，旋渦均勻后室溫放置10 min，測量其在波長734 nm處的吸光度值（Ai）。用l00 μL 95%的乙醇液代替樣品液，測得吸光值（Ac）；用3.9 mL 95%的乙醇溶液代替ABTS+·溶液，測得吸光值（Aj）。用VC為陽性對照，按式（1）計(jì)算其清除率，并計(jì)算待測樣品液的半數(shù)抑制濃度（EC50）。

1.2.3總酚含量測定依據(jù)福林酚比色法原理，采用Kima等［16］的方法并加以改進(jìn)，0.1 mL一定質(zhì)量濃度的待測樣品液置于4 mL，加入1 mL福林酚試劑，充分混合5 min后加入1 mL 7%（w/v）Na2CO3溶液振蕩，混勻后于25℃黑暗條件下溫育3 h，于波長760 nm處測得吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。根據(jù)以上相同步驟，以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中總酚的含量，結(jié)果以mg GAE/g DW表示，GAE （gallic acid equivalent）表示沒食子酸等效物。

1.2.4總黃酮含量測定采用三氯化鋁顯色法測定總黃酮含量，將0.5 mL一定質(zhì)量濃度的待測樣品液置于2 mL離心管中，加入5%NaNO2溶液50 μL，放置5 min，再加入50 μL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，繼續(xù)放置5 min，再加入250 μL的NaOH（1 mol/L）溶液，放置20 min后于510 nm處測吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值。根據(jù)以上相同步驟，以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中總黃酮的含量，結(jié)果以mg rutim/g DW表示。

1.3不結(jié)球白菜活性部位對H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

用前期實(shí)驗(yàn)中清除自由基活性最強(qiáng)的部位為研究對象，用含1%DMSO的無水乙醇分別配成0.1、0.5、1、2、3、5、10 mg/mL的溶液［17］，置于4℃冰箱冷藏備用。

1.3.1不結(jié)球白菜活性部位對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化的抑制作用小鼠于眼眶取血，抗凝后離心除去上層液體，紅細(xì)胞繼續(xù)用冰冷的生理鹽水洗滌3次后配制成0.5%的細(xì)胞懸液。取懸液2 mL，分別加入0.2 mL不同濃度的樣品，再加入50 mmol/L的H2O22 mL，充分混勻，于37℃恒溫溫育1 h后用生理鹽水稀釋成4倍的體積，4000 r/min離心10 min，410 nm處測定上清液的OD值，其中空白對照用等體積的蒸餾水代替樣品［18］。

H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化的抑制率（%）=（1-A/A0）×100式（2）

式中，A為樣品的三次平均OD值，A0為空白對照的三次平均OD值。

1.3.2不結(jié)球白菜活性部位對H2O2誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制作用小鼠頸椎脫臼致死，肝臟用預(yù)冷的生理鹽水洗凈，加生理鹽水冰浴勻漿，制成10%的肝臟勻漿液。取勻漿液2 mL，分別加入1 mL不同濃度的樣品液，充分混勻，于37℃恒溫溫浴20 min，加入100 mmol/L的H2O20.2 mL，充分混勻，于37℃恒溫溫浴30 min，再加入20%的三氯乙酸2 mL，加入0.7%的硫代巴比妥酸溶液2 mL，充分混勻后沸水浴20 min，再4000 r/min離心10 min，532 nm處測定各上清液的OD值（A），空白對照用等體積的蒸餾水代替樣品，測定OD值（A0）［18］。按式（2）計(jì)算不結(jié)球白菜活性部位對H2O2誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制率（%）。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析和線性回歸?？寡趸钚苑椒ㄩg的相關(guān)性以樣品濃度為5 mg/mL的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同極性部位清除DPPH自由基的能力

由圖1和表1可知，不結(jié)球白菜不同極性部位對DPPH自由基均具有清除能力，且在一定濃度范圍內(nèi)（0.1～5 mg/mL）呈明顯的量效關(guān)系，其中乙酸乙酯相對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，EC50值為（0.64± 0.05）mg/mL，雖然顯著高于對照VC的EC50值（0.012± 0.003）mg/mL，但當(dāng)乙酸乙酯相濃度為5 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到98.83%，與VC的清除率（99.01%）無顯著性差異（p＞0.05）；正丁醇相的EC50值為（4.07±0.38）mg/mL，顯著高于乙酸乙酯相EC50值（0.64±0.05）mg/mL；石油醚相與氯仿相清除DPPH自由基的能力相當(dāng)，且活性較小，而水相對DPPH自由基幾乎沒有清除作用。

圖1　不結(jié)球白菜不同極性部位清除DPPH·的能力Fig.1　DPPH radical scavenging activity of different extracts from non-heading Chinese cabbage

表1　不結(jié)球白菜不同極性部位清除四種自由基的EC50值Table 1　EC50of scavenging capacities for free radicals of different extracts from non-heading Chinese cabbage

2.2不同極性部位清除羥自由基的能力

由圖2可知，不同極性部位表現(xiàn)出強(qiáng)弱不同的清除羥自由基能力，其所有部位清除羥自由基能力均小于對照VC，且具有顯著性差異（p＜0.05）；由表1可知，乙酸乙酯相、氯仿相清除羥自由基能力的EC50值分別為（1.17±0.12）、（1.04±0.23）mg/mL，兩者無顯著性差異（p＞0.05），但都顯著低于其他三個部位（p＜0.05）；結(jié)合圖2與表1，不同極性部位清除羥自由基能力順序?yàn)槁确孪啵疽宜嵋阴ハ啵菊〈枷啵臼兔严啵舅唷?/p>

圖2　不結(jié)球白菜不同極性部位清除·OH的能力Fig.2　Hydroxyl radical scavenging activity of different extracts from non-heading Chinese cabbage

2.3不同極性部位清除超氧陰離子的能力

由圖3和表1可知，不結(jié)球白菜乙酸乙酯相提取物對超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除能力，當(dāng)濃度大于2.5 mg/mL時，其對超氧陰離子的清除率高于對照VC；不結(jié)球白菜正丁醇相提取物在濃度小于2.5 mg/mL時，其對超氧陰離子的清除率小于對照VC（p＜0.05），但隨著濃度的增大，清除率則大于對照VC（p＞0.05）；石油醚相和氯仿相提取物的清除能力均較弱，其EC50值均大于10 mg/mL，其中，水相對超氧陰離子自由基幾乎沒有清除作用。綜合圖3和表1清除能力順序?yàn)橐宜嵋阴ハ啵菊〈枷啵韭确孪啵臼兔严啵舅唷?/p>

圖3　不結(jié)球白菜不同極性部位清除O2-·的能力Fig.3　Superoxide radical scavenging activity of different extracts from non-heading Chinese cabbage

2.4不同極性部位清除ABTS+·的能力

由圖4和表1可知，除水相外，其他四個極性部位對ABTS+·均具有一定的清除能力，且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。低濃度時，乙酸乙酯相對ABTS+·的清除率低于對照VC，但隨著濃度的增大，乙酸乙酯相的清除活性增強(qiáng)，當(dāng)濃度大于2.5 mg/mL時，其對ABTS+·的清除能力與對照VC差異不顯著（p＞0.05），當(dāng)各極性部位濃度為5 mg/mL時，對ABTS+·的清除率分別為乙酸乙酯相98.76%，正丁醇相67.38%，氯仿相54.73%，石油醚相39.26%，水相6.4%。結(jié)合各極性部位的EC50值（表1），其清除ABTS+·的能力順序?yàn)橐宜嵋阴ハ啵菊〈枷啵韭确孪啵臼兔严啵舅唷?/p>

圖4　不結(jié)球白菜不同極性部位清除ABTS+·的能力Fig.4　ABTS radical scavenging activity of different extracts from non-heading Chinese cabbage

2.5不結(jié)球白菜不同極性部位總酚含量測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.9745X+0.0064 （R2=0.9972）。不結(jié)球白菜各極性部位的總酚含量見表2，可以看出，乙酸乙酯相總酚含量最多，為（151.32± 1.87）mg GAE/g DW，含量最少的為水相（2.77± 0.36）mg GAE/g DW的54.6倍；含量居中的分別為正丁醇相（39.78±0.91）mg GAE/g DW、氯仿相（34.76± 0.57）mg GAE/g DW、石油醚相（29.89±0.73）mg GAE/g DW。

2.6不結(jié)球白菜不同極性部位總黃酮含量測定

不同極性部位的總黃酮含量由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Y= 20.17X+0.065（R2=0.998）計(jì)算得來，如表2所示，各極性部位的總黃酮含量中乙酸乙酯相的含量最高，為（32.97±0.56）mg rutin/g DW，水相的含量最低，僅（1.58±0.17）mg rutin/g DW；含量居中的正丁醇相、氯仿相及石油醚相的總黃酮含量依次為（26.19±0.37）、（21.46±0.38）、（10.42±0.13）mg rutin/g DW。

表2　不結(jié)球白菜不同極性部位總酚和總黃酮的含量Table 2　Total phenolics and flavonoids content in different extracts from non-heading Chinese cabbage

2.7四種抗氧化活性方法間的相關(guān)性分析

目前還沒有一種抗氧化體系可以全面的評價(jià)一種物質(zhì)的抗氧化能力［17］，為了研究不結(jié)球白菜不同極性部位的抗氧化活性，選用了清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子、ABTS+·等四個指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)。運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行抗氧化活性方法間的相關(guān)性分析，結(jié)果見表3，ABTS+·清除法與DPPH·清除法的相關(guān)性最好，相關(guān)系數(shù)為0.963；DPPH·清除法與O2-·、·OH清除法，ABTS+·清除法與·OH、O2-·清除法的相關(guān)性均顯著，相關(guān)系數(shù)分別為0.922、0.885、0.939、0.942；結(jié)合表3分析，不結(jié)球白菜活性提取物對清除DPPH·、·OH、O2-·與ABTS+·的能力基本一致。

表3　四種抗氧化活性方法的相關(guān)性分析Table 3　Correlation analysis of four methods of antioxidant activity

2.8總酚與總黃酮含量與抗氧化活性間的相關(guān)性分析

很多研究表明，植物源活性提取物的抗氧化活性與其總酚和總黃酮的含量具有很大關(guān)系［19］，分析不同極性部位的總酚和總黃酮含量是否與其抗氧化活性密切相關(guān)，預(yù)知不結(jié)球白菜提取物的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)，可為進(jìn)一步分離有效單體成分提供理論依據(jù)。

由表4可知，在不結(jié)球白菜各極性部位濃度為5 mg/mL時，其總黃酮含量與抗氧化能力間有較好的相關(guān)關(guān)系，其中總黃酮含量與ABTS+·清除能力的相關(guān)系數(shù)為0.979，極顯著相關(guān)（p＜0.01），與·OH、O2-·、DPPH·清除能力也顯著相關(guān)（p＜0.05）；因此可以認(rèn)為不結(jié)球白菜各極性部位總黃酮的含量高低可直接反映出其抗氧化能力的大小。各極性部位總酚的含量與DPPH·的清除能力極顯著相關(guān)（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.964，總酚含量與ABTS+·、O2-·的清除能力也顯著相關(guān)（p＜0.05），因此各極性部位總酚的含量與抗氧化活性間也具有一定的相關(guān)性，提示總酚和總黃酮類化合物可能是不結(jié)球白菜抗氧化能力的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表4　不結(jié)球白菜不同極性部位總酚和總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 4　Correlation analysis between content of the total phenolics and flavonoids and the antioxidant activity of different extracts from non-heading Chinese cabbage

2.9不結(jié)球白菜乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的抑制作用

綜合本實(shí)驗(yàn)中4種清除自由基抗氧化體系評價(jià)的不結(jié)球白菜5種不同極性部位的抗氧能力（圖1～圖4），乙酸乙酯相的抗氧化能力最強(qiáng)，因此選擇乙酸乙酯相作為脂質(zhì)過氧化抑制作用的研究對象。

2.9.1不結(jié)球白菜乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化的抑制作用研究表明，過量的H2O2攻擊紅細(xì)胞，脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，H2O2對膜內(nèi)巰基進(jìn)行攻擊，破壞了膜的完整性，脂質(zhì)膜受損，形成膜孔，內(nèi)液外漏，細(xì)胞破壞，變形性下降，引起細(xì)胞損傷［17］。圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不結(jié)球白菜乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化具有抑制作用，隨著乙酸乙酯相濃度的增大，抑制作用越明顯，濃度為5 mg/mL時的抑制率達(dá)到60.03%，與濃度10 mg/mL（62.11%）時的抑制率無顯著性差異（p＞0.05）。由此可見，不結(jié)球白菜乙酸乙酯相在細(xì)胞水平上能夠有效抑制氧化損傷。

圖5　不結(jié)球白菜乙酸乙酯部對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化的抑制作用Fig.5　Inhibition effects of the ethyl acetate fraction on hemolysis of mice erythrocytes induced by H2O2

2.9.2不結(jié)球白菜乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制作用H2O2會刺激肝臟發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是其產(chǎn)物之一，通常利用它作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，其產(chǎn)量的多少可以代表組織損害的程度［20］。圖6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乙酸乙酯相為0.1～2 mg/mL的低濃度范圍內(nèi)，其對H2O2誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制作用并無顯著性差異（p＞0.05）；在濃度為2 mg/mL時，乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制率為21.13%；但隨著乙酸乙酯相濃度的增大，抑制作用迅速加強(qiáng)，當(dāng)濃度為10 mg/mL時，抑制率達(dá)到了51.26%，約是濃度為0.1 mg/mL時的2.8倍。說明不結(jié)球白菜乙酸乙酯相能夠有效保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化。

圖6　不結(jié)球白菜乙酸乙酯部對H2O2誘導(dǎo)肝臟脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.6　Inhibition effects of the ethyl acetate fraction on lipid peroxidation of mice liver homogenate induced by H2O2

已有研究表明，活性氧自由基增加能引起肝臟脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而誘發(fā)許多肝臟疾病，如肝硬化、急、慢性肝炎、內(nèi)毒素性肝損害和肝腫瘤等［20］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，不結(jié)球白菜乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血及小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化均有較好的抑制作用，乙酸乙酯相對實(shí)驗(yàn)中四種自由基的清除效果最好，可推斷其過氧化抑制機(jī)理可能為活性提取物與H2O2反應(yīng)，阻止機(jī)體過氧化的發(fā)生及進(jìn)行，但不結(jié)球白菜乙酸乙酯相的具體成分及作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

3　結(jié)論

不結(jié)球白菜不同極性部位的體外抗氧化研究結(jié)果表明，除水相外，其他四個極性部位對四種自由基均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，且DPPH自由基清除法、羥自由基清除法、超氧陰離子自由基清除法、ABTS+·清除法四種方法間的相關(guān)性基本一致，乙酸乙酯相的抗氧化活性最強(qiáng)，提示乙酸乙酯相是不結(jié)球白菜提取物抗氧化活性的主要部位。經(jīng)抗氧化活性與總酚和總黃酮含量的相關(guān)性分析表明，不結(jié)球白菜各極性部位抗氧化活性與總酚和總黃酮含量密切相關(guān)，提示總酚和總黃酮類化合物可能是不結(jié)球白菜抗氧化能力的物質(zhì)基礎(chǔ)。不結(jié)球白菜乙酸乙酯相對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血及小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化均有較好的抑制作用，提示乙酸乙酯相可阻止機(jī)體過氧化的發(fā)生及進(jìn)行，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)將對乙酸乙酯相的具體成分進(jìn)行分析。本文可望為不結(jié)球白菜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)的理論依據(jù)，為深入挖掘不結(jié)球白菜資源在食品及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

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Antioxidant activity-guided fractionation of non-heading Chinese cabbage

MA Jing-fan1，2，LIU Xi-ming3，CHEN Xiao-hong1，2
（1.School of Life Sciences，Longyan University，Longyan 364012，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Veterinary Biotechnology，Longyan 364012，China；3.School of Art Design，Longyan University，Longyan 364012，China）

This study was carried out to explore the antioxidant activities of five extracts obtained from nonheading Chinese cabbage by using different polarity solvents，including petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n-butyl alcohol and water.The antioxidant activities of the five fractions were evaluated by the scavenging power of four free radicals，namely DPPH·，·OH，O2-·and ABTS+·.The relationship between the antioxidant activity and the content of total phenolics and total flavonoids were also analysed.The results showed that four fractions except water fraction had great antioxidant activity and the content of total phenolics and total flavonoids had a highly significant correlation with the antioxidant activity.The ethyl acetate fraction was the most effective fraction.The EC50values based on DPPH·，·OH，O2-·and ABTS+·were（0.64±0.05），（1.17±0.12），（1.02±0.15）mg/mL and（0.78±0.07）mg/mL，respectively.The highest contents of total phenolics and total flavonoids were in the ethyl acetate fraction and their contents were（151.32±1.87）mg gallic acid equivalent/g DW and（32.97±0.56）mg rutin equivalent/g DW，respectively.Effect of the ethyl acetate fraction on anti-lipid peroxidation was investigated.The inhibition of the ethyl acetate fraction on hemolysis of mice erythrocytes and lipid perexidation of mice liver homogenate induced by H2O2were 62.11%and 51.26%when the ethyl acetate fraction concentration was 10 mg/mL.The ethyl acetate fraction of non-heading Chinese cabbage，a strong ability to act as antioxidant，might be considered as a natural source of active compounds.

non-heading Chinese cabbage；antioxidant activity；total phenolics；total flavonoids；lipid peroxidation

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0132-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.017

2015－06－12

馬景蕃（1978-），女，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：m_jingfan@163.com。

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2012N0020）；福建省教育廳A類項(xiàng)目（JA12320）；國家自然科學(xué)基金培育項(xiàng)目（LG2014014）。