張團(tuán)結(jié)，熊道陵，許光輝，陳　超，陳金洲（江西理工大學(xué)冶金與化學(xué)工程學(xué)院，江西贛州341000）

油茶籽餅中茶皂素定量檢測(cè)方法研究

張團(tuán)結(jié)，熊道陵，許光輝，陳超，陳金洲
（江西理工大學(xué)冶金與化學(xué)工程學(xué)院，江西贛州341000）

本文建立了一種快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確測(cè)定油茶籽餅中茶皂素含量的方法。結(jié)果表明：采用分光光度法和高效液相色譜法對(duì)同含量的茶皂素測(cè)定結(jié)果較為吻合，相比之下分光光度法更為簡(jiǎn)單快捷。分光光度法是以香草醛-高氯酸作為顯色劑，通過茶皂素甙元顯色，于554 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在樣品待測(cè)液中，加入香草醛-高氯酸1.0 mL，在溫度為60℃的條件下反應(yīng)15 min，顯色效果最佳。該方法精密度高，顯色后在40 min內(nèi)吸光度穩(wěn)定，平均加標(biāo)回收率為98.28% （RSD=3.86%）。本實(shí)驗(yàn)建立了分光光度法測(cè)定茶皂素含量的方法，具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性，可用于茶皂素含量的測(cè)定。

分光光度法，高效液相色譜法，茶皂素，甙元

油茶籽餅中的茶皂素是一類五環(huán)三萜類齊墩果烷型皂甙，不僅具有天然優(yōu)良的表面活性作用，還有殺滅細(xì)菌、殺滅害蟲、抑制細(xì)菌、消炎等作用［1-3］，故而被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)藥、建材、化工等方面［2-5］。

從油茶籽餅中提取出的茶皂素含有蛋白質(zhì)、多糖、單寧、油脂、樹脂等雜質(zhì)，使得茶皂素產(chǎn)品質(zhì)量差，色澤深黑，且不同地域的茶籽中茶皂素因品種、栽培環(huán)境等不同而存在差異，給茶皂素定量研究帶來很多的困難，因此迄今為止國(guó)內(nèi)尚未見統(tǒng)一的檢測(cè)方法。

茶皂素定量分析方法研究有：重量法［6］、顯色法［7-9］、薄層掃描法［10］（TLC）、高效液相色譜法［11-12］（HPLC）等。其中重量法測(cè)定具有數(shù)值穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但是存在分析時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，水解得到的皂甙存在纖維素等雜質(zhì)，使得測(cè)定結(jié)果偏大等問題。顯色法測(cè)定茶皂素的含量是一種快捷的方法，但是從油茶籽餅中提取出的茶皂素含有蛋白質(zhì)、單寧、茶多酚、多糖等雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)有很大的影響，常需要對(duì)這些雜質(zhì)進(jìn)行除雜方可進(jìn)行顯色檢測(cè)。薄層掃描法和高效液相色譜法測(cè)定茶皂素的含量，對(duì)設(shè)備要求高，存在操作復(fù)雜，分析費(fèi)用大等問題。本實(shí)驗(yàn)以茶皂素水解后的甙元含量來測(cè)定茶皂素的含量，有效的避免茶皂素中雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，提高了茶皂素含量定量的準(zhǔn)確性，無需對(duì)茶皂素進(jìn)行復(fù)雜的提純。本文測(cè)定方法比高效液相色譜法更為簡(jiǎn)單、方便、快捷，為開發(fā)油茶籽餅中茶皂素含量測(cè)定提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

無水甲醇、乙醇南昌全友化工原料有限公司（分析純）；甲醇西隴化工股份有限公司（色譜純）；香草醛天津市巴斯夫化工有限公司（分析純）；高氯酸濟(jì)寧恒泰化工有限公司（分析純）；冰醋酸濟(jì)寧佰一化工有限公司（分析純）；鹽酸深圳市慶茂化工有限公司（分析純）；茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品阿拉丁試劑有限公司（純度＞98%）；樣品茶皂素陜西帕尼爾生物科技有限公司（純度＞40%）；超純水實(shí)驗(yàn)室自制。

Agilent高效液相色譜儀美國(guó)安捷倫公司；ATX324分析天平上海圣科儀器設(shè)備有限公司；101系列數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海葉拓儀器儀表有限公司；UV-6300紫外分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司；HH恒溫水浴鍋江蘇金壇市中大儀器廠；JJ-1電動(dòng)攪拌器江蘇金壇市中大儀器廠；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器山海申生科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1甙元的制備取3.0 g茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品加入2.5 mol/L濃度的鹽酸甲醇溶液在沸水浴中水解1 h，水解后得到灰色的茶皂素甙元，在80℃干燥箱內(nèi)烘1 h得到茶皂素甙元，取29.0 mg甙元，用甲醇溶解并定容到50.0 mL容量瓶中，獲得濃度為0.58 mg/mL的標(biāo)品甙元溶液，用同樣的方法可得到濃度為1.38 mg/mL的樣品甙元溶液。1.2.2顯色方法茶皂素結(jié)構(gòu)屬于齊墩果烷型，將皂素水解成甙元后利用分光光度法測(cè)定甙元的含量確定茶皂素的含量。茶皂素在沸水浴的鹽酸甲醇溶液中水解1 h得到甙元，再和香草醛上的醛基發(fā)生反應(yīng)形成縮醛，成為新的共軛體系而顯色。

1.2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇分別精密吸取標(biāo)品甙元溶液和樣品甙元溶液各0.50 mL于10.0 mL帶有塞子的顯色管中，水浴蒸干溶劑，加入香草醛-高氯酸（體積比1∶4）1.0 mL，搖勻，在60℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，反應(yīng)后冰水浴5 min，加入冰醋酸5.0 mL，以不加皂素甙元為空白試劑，在400～700 nm處掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4顯色條件的確定通過對(duì)影響顯色的因素（顯色劑用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度）進(jìn)行考察，得到最佳的顯色條件。

取標(biāo)品甙元溶液0.30 mL，80℃水浴揮干溶劑，冷卻后，加入不同量的顯色劑（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL），搖勻，在不同溫度（45、50、55、60、65、70℃）水浴中加熱不同時(shí)間（5、10、15、20、25、30 min），迅速冷卻至室溫，加入5 mL冰醋酸，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，確定最佳顯色條件。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密吸取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品甙元溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70 mL，分別置于10.0 mL帶塞子的顯色管中，加香草醛-高氯酸1.0 mL，搖勻，在60℃水浴鍋中反應(yīng)15 min。冷卻后冰水浴5 min，加入冰醋酸5.0 mL，以不加皂素甙元為空白試劑，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。茶皂素含量計(jì)算公式見下式

式中：C為甙元含量（mg）；換算系數(shù)0.4921是茶皂素水解后產(chǎn)生的不溶于水的甙元占整個(gè)茶皂素的分子量百分比，茶皂素平均分子量為1203，甙元分子量為592；m為茶皂素樣品的質(zhì)量（mg）。

1.3高效液相色譜法測(cè)定茶皂素的含量

按照參考文獻(xiàn)［13］方法改進(jìn)，色譜條件為：色譜柱，Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水（v∶v=9∶1）；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；柱溫：25℃。

標(biāo)準(zhǔn)品處理：精密稱取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品0.5 g（精確到0.0001 g），用甲醇超聲溶解并定容到100 mL容量瓶中。分別移取1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL于5個(gè)50 mL容量瓶中，并用甲醇定容溶解。經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾后上機(jī)分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程。

哦，他說得很有道理，想求真情真愛，首先要把愛的立足點(diǎn)建立在對(duì)方身上，自己奉獻(xiàn)再多，最終還離不開這個(gè)“我”字，怎么讓別人無私地愛自己呢？對(duì)，人想活得比一般人更有意義，必須讓自己的思想脫俗……對(duì)，對(duì)，古為今用，傳統(tǒng)文化所包含的深刻的人生哲理，的確值得我們借鑒……想著想著，不知不覺便向老人頻頻點(diǎn)起頭來。忽然又有難題涌上心頭，說道：“可是，婚前的戀愛路子已經(jīng)走錯(cuò)了，既然夫妻過不來，就得打離婚的譜。”

樣品茶皂素含量的測(cè)定：用分析天平稱取樣品茶皂素0.058 g（精確到0.0001 g），用甲醇超聲溶解并定容于50 mL容量瓶中。經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)試分析。

茶皂素含量計(jì)算公式見下式：

式中：χ為樣品溶液中濃度（g/mL），V為樣品定容的體積（mL），m為樣品的質(zhì)量（g）。

2　結(jié)果與分析

2.1甙元顯色測(cè)定結(jié)果

2.1.1最大吸收波長(zhǎng)的確定從圖1中可以看出在波長(zhǎng)為554 nm時(shí)吸光度最大，因此確定測(cè)定茶皂素甙元的波長(zhǎng)為554 nm。

2.1.2顯色劑用量的確定顯色劑用量與吸光度的關(guān)系如圖2所示，實(shí)驗(yàn)表明，隨著顯色劑用量的增加，吸光度在用量為1.0 mL之前上升較快。當(dāng)顯色劑用量在1.0 mL之后吸光度趨于穩(wěn)定，即反應(yīng)已經(jīng)完全，確定最佳用量為1.0 mL。

2.1.3反應(yīng)時(shí)間的確定不同反應(yīng)時(shí)間與吸光度值的關(guān)系如圖3所示。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于15 min時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增大，吸光度值隨之增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，吸光度值達(dá)到最大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過15 min時(shí)，吸光度值有所下降，這是因?yàn)闀r(shí)間過長(zhǎng)會(huì)破壞顯色體系，所以，選擇15 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖1　皂素甙元掃描圖Fig.1　Saponin aglycone scan

表1　樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1　Recovery and precision data of sample

圖4　反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響Fig.4　Effect of reaction temperature on the absorbance

2.1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立以吸光度值為橫坐標(biāo)，茶皂素甙元含量（mg）為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。計(jì)算線性回歸方程為：C=0.4231A+ 0.0037（R2=0.9976）。

圖5　皂素甙元標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5　Aglucone standard curve

2.1.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取6份標(biāo)品甙元溶液0.20 mL。實(shí)驗(yàn)表明，連續(xù)6次測(cè)的吸光度值分別為0.251、0.250、0.249、0.251、0.252、0.250，其RSD為0.105%，表明該方法具有良好的精密度。

2.1.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密取標(biāo)品甙元溶液0.30 mL。實(shí)驗(yàn)表明，標(biāo)品甙元溶液在顯色結(jié)束后的40 min內(nèi)吸光度值保持在0.426左右，表明標(biāo)品溶液顯色結(jié)束后的40 min內(nèi)吸光度值是穩(wěn)定的。

2.1.8加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)方法，分別對(duì)5組不同含量的樣品甙元中加入相同含量的標(biāo)準(zhǔn)品甙元進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1，由表1可知平均回收率為98.28%，其RSD為3.86%，表明分光光度法檢測(cè)茶皂素含量具有較好的準(zhǔn)確性。

2.2高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過紫外掃描實(shí)驗(yàn)可知，茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品在210 nm處有最大吸收峰，見圖6，因此本實(shí)驗(yàn)采用210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。用標(biāo)準(zhǔn)品配制的5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液分別得出不同濃度下的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖7，得到回歸方程為y=1.15×106χ+3.0×106，R2=0.9981（y表示峰面積，χ表示濃度）。

圖6　茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品紫外吸收光譜圖Fig.6　UV absorption spectrum of tea saponin standard

圖7　茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線（HPLC法）Fig.7　Tea saponin standard curve（HPLC）

2.3樣品含量測(cè)定

分別使用兩種方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，平行五次，結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，在根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中茶皂素含量，結(jié)果分別見表2、表3。

表2　分光光度法測(cè)定五個(gè)平行樣品結(jié)果Table 2　Determination results of 5 parallel samples by UV spectrophotometry

表3　HPLC法測(cè)定五個(gè)平行樣品結(jié)果Table 3　Determination results of 5 parallel samples by HPLC

3　結(jié)論

經(jīng)過兩種方法的測(cè)定結(jié)果比較可知，采用分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定同一含量的茶皂素樣品，其結(jié)果大致相同。本文建立的分光光度法操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低，通過精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方法的可靠性，該方法測(cè)定時(shí)間短，方便、快捷，可用于茶皂素含量的測(cè)定，適合推廣。

［1］W N Hao，G H Zhong，M Y Hu，et al．Control of citrus postharvest green and blue mold and sour rot by tea saponin combined with imazalil and prochloraz［J］．Postharvest Biology and Technology，2010，56（1）：39-43．

［2］W N Hao，H Li，M Y Hu，et al．Integrated control of citrus green and blue mold and sour rot by Bacillus amyloliquefaciens in combination with tea saponin［J］．Postharvest Biology and Technology，2011，59（3）：316-323．

［3］Y Masayuki，M Toshio，N Seikou，et al．Bioactive saponins and glycosides．XXV．a(chǎn)cylated oleanane type triterpene saponins from the seeds of tea plant（Camellia sinensis）［J］．Chemistry Pharmaceutical Bulletin，2007，55（1）：57-63．

［4］H L Mao，J K Wang，Y Y Zhou，et al．Effects of addition of tea saponins and soybean oil on methane production，fermentation and microbial population in the rumen of growing lambs［J］．Livestock Science，2010，129（1-3）：56-62．

［5］MYoshikawa，TMorikawa，KYamamoto，et al．Floratheasaponins AC，acylated oleanane-type triterpene oligoglycosides with antihyperlipi demic activities from flowers of the tea plant （Camelliasinensis）［J］．Journal of Natural Products，2005，68（9）：1360-1365．

［6］朱全芬，田潔華．茶皂素定量方法的研究［J］．中國(guó)茶葉，1983（4）：13-15．

［7］傅春玲，洪奇華，阮輝．茶皂素定量測(cè)定方法的研究［J］．杭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1997（3）：239-242．

［8］謝秋英，黃玉英，宋振榮．茶皂素的提取純化及成品中茶皂素含量的測(cè)定［J］．福建水產(chǎn)，2010（2）：14-17．

［9］劉紅梅，周新躍，周建平，等．油茶皂素定量分析的研究［J］．生命科學(xué)儀器，2008，6（10）：13-16．

［10］田世雄，吳莉，張友杰．薄層掃描法測(cè)定茶皂素中皂甙的含量［J］．華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1995（1）：65-68．

［11］張海龍，張維農(nóng)，齊玉堂．高效液相色譜法定量分析茶籽粕中的茶皂素［J］．食品科學(xué)，2013，34（8）：153-156．

［12］陳瑩，劉松柏，何良興，等．油茶籽粕和茶皂素中皂苷的定量檢測(cè)方法研究［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2012，27（2）：105-111．

［13］譚搏，曹福祥，趙瑩．油茶餅中茶皂素的定量分析［J］．精細(xì)化工中間體，2009，39（2）：67-69．

Quantitative analysis of tea saponin from seed cake

ZHANG Tuan-jie，XIONG Dao-ling，XU Guang-hui，CHEN Chao，CHEN Jin-zhou （School of Metallurgy and Chemical Engineering，Jiangxi University of Science&Technology，Ganzhou 341000，China）

In order to establish a rapid，simple and accurate method of determining the content of tea saponin，spectrophotometry and HPLC methods were used.The quantitative analysis results for the same content of tea saponins from the two improved analysis methods were very accordant and the former was more simple.The employed coloring reagents was vanillin-acetic acid and the color determination of saponin content based on aglycone at the wavelength of 554 nm.Optimal color condition for sample solution were obtained as follows：color reagents 1.0 mL，temperature 60℃，reaction time 15 min.The color of the samples were stabled within 40 min and the average recovery was 98.28%（RSD=3.86%）with high precision.The method based on spectrophotometry including high accurate，precision and stability，it could be used for quantitative determination of tea saponin.

spectrophotometry；HPLC；tea saponins；aglycone

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0053-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.002

2015－05－25

張團(tuán)結(jié)（1989-），男，碩士研究生，研究方向：再生資源綜合利用，E-mail：zhangtj0175@126.com。

熊道陵（1965-），男，博士，教授，研究方向：再生資源綜合利用，E-mail：dlxiongcs@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51364014）；江西省科技廳資助項(xiàng)目（2013BBG70003）；江西省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310407037，201310407057，201410407030）；江西省高校專業(yè)綜合改革試點(diǎn)項(xiàng)目（SZG-14-01-01）資助。