甘　科，趙　暉，王海英，王朝元，梁曉聲，*（.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430074；.湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，湖北武漢430050）

基于巰基磷酸和巰基環(huán)糊精雙修飾納米金的修飾電極測定微囊藻毒素的研究

甘科1，趙暉2，王海英1，王朝元1，梁曉聲1，*
（1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430074；2.湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，湖北武漢430050）

為了快速靈敏的檢測微囊藻毒素（MC）的含量，本研究根據(jù)微囊藻毒素LR亞型（MC-LR）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對納米金進(jìn)行了巰基β-環(huán)糊精和巰基磷酸的雙修飾，建立了一種基于雙修飾納米金材料的微分脈沖伏安電化學(xué)分析方法檢測MC。結(jié)果表明雙修飾的納米金對MC具有良好的吸附性能，其吸附量達(dá)到2.125 μg/mL，靜態(tài)分布系數(shù)為5.67。利用電聚合中性紅修飾的玻碳電極表面正電荷吸附雙修飾納米金材料制備電化學(xué)傳感器，測定MC，結(jié)果表明該電極對MC-LR的線性范圍為26 nmol/L～213 μmol/L，檢測限為（3σ/S）19 nmol/L，且具有良好的抗干擾能力。

微囊藻毒素，納米金，巰基磷酸，巰基環(huán)糊精，修飾電極

近年來地表水富營養(yǎng)化引起有害藍(lán)藻水華的發(fā)生日益頻繁，其中微囊藻毒素（MC）是目前已知的藍(lán)藻水華污染過程中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴(yán)重的藻毒素種類［1-2］，可污染飲用水或通過生物富集進(jìn)入食物鏈中，具有多器官毒性、遺傳毒性和致癌性［3］。

目前MC檢測方法中，蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）和免疫學(xué)檢測方法多存在一定的誤差，只能用于樣品的粗篩選［4］；高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法使用的儀器設(shè)備貴重且需專業(yè)的技術(shù)人員［5-6］。研究和建立簡單、快速、靈敏的微囊藻毒素的電化學(xué)分析新方法具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前鮮有運(yùn)用納米金修飾電極來增強(qiáng)微囊藻毒素檢測靈敏度的電化學(xué)分析的研究報(bào)道。

本研究根據(jù)MC的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，由圖1所示，對納米金表面進(jìn)行巰基磷酸和巰基環(huán)糊精的雙修飾，修飾過的納米金的表面的巰基環(huán)糊精的疏水空腔可與MC的疏水的苯環(huán)結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)可與MC結(jié)構(gòu)中帶正電荷的精氨酸的胍基發(fā)生靜電反應(yīng)并特異性結(jié)合，從而使MC能夠和表面雙修飾的納米金粒子牢固結(jié)合。當(dāng)電極用表面雙修飾的納米金粒子進(jìn)行修飾后，在適宜條件下，MC可通過特異性結(jié)合作用吸附于表面雙修飾的納米金修飾的電極表面，顯著提高反應(yīng)面積及特異性富集能力，從而提高對MC的檢出率和檢測的靈敏度，這將為MC的快速準(zhǔn)確的檢測提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

TW-ALGAE微囊藻毒素色譜純，臺灣藻研有限公司；氯金酸光譜，Sigma公司；對甲基苯磺酰氯、乙腈、硫脲、三氯乙烯、β-CD、中性紅、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、尿素、dNTP、乙酸、K3Fe（CN）6、K4Fe（CN）6、甲醇等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

CHI 660E電化學(xué)工作系統(tǒng)上海辰華儀器有限公司；UV6100紫外分光光度計(jì)上海美普達(dá)；超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1納米金的表面修飾

1.2.1.1單-（6-巰基）β-環(huán)糊精的制備將55 g β-環(huán)糊精（β-CD）加入435 mL的蒸餾水中，將溶有5.2 g NaOH的蒸餾水緩慢加入到β-CD的懸浮液中，一邊滴加一邊攪拌，滴加時(shí)間為8～10 min，最后β-CD完全溶于NaOH中，懸浮液變成透明的β-CD溶液。再將溶有7.96 g對甲基苯磺酰氯的24 mL乙腈逐滴滴到透明的β-CD溶液中，一邊滴加一邊用玻璃棒攪拌，滴加時(shí)間為10～12 min。滴加結(jié)束后，透明的β-CD溶液變成渾濁液。然后于恒溫磁力攪拌器22℃下1000 r/min攪拌2.5 h。反應(yīng)結(jié)束后離心分離得到上清液。將上清液于4℃放置半天，會有大量白色沉淀析出。再將白色沉淀以蒸餾水為溶劑75℃下重結(jié)晶兩次，再冷凍干燥，得到干燥高純度的磺化產(chǎn)物（β-CD-OTS）。將1.5 g磺化產(chǎn)物加入到75 mL的含有1.5 g硫脲的甲醇溶液（甲醇與水的配比為4∶1）中，于85℃的恒溫水浴鍋中冷凝回流兩天。反應(yīng)結(jié)束后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓去除溶劑，最后得到白色的粉末，再用一定體積的無水甲醇洗滌白色粉末。用52 mL的10%的氫氧化鈉溶液溶解洗滌后的白色粉末，在50℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)300 min，再用鹽酸溶液將pH調(diào)到2，最后加入3.75 mL的三氯乙烯，在23℃攪拌反應(yīng)1 d，抽濾得到白色固體，經(jīng)過2次重結(jié)晶得到純度較高的單-（6-巰基）β-環(huán)糊精［7-8］。

1.2.1.2納米金溶膠的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金顆粒［6］。具體步驟為：用milliQ超純水配制500 mL 1 mmol/L的氯金酸溶液，把配好的氯金溶液轉(zhuǎn)移至三口圓底燒瓶，機(jī)械攪拌下加熱至劇烈沸騰。一旦氯金酸溶液開始劇烈回流（回流量1滴/s），拔出三口燒瓶上的玻璃塞，迅速加入配制的所有檸檬酸鈉溶液（50 mL 38.8 mmol/L），重新塞好玻璃塞，回流15 min。此時(shí)可見溶液由黃色變透明再變黑再變紫最后變成酒紅色，15 min后，關(guān)掉加熱，反應(yīng)溶液自然冷卻至室溫，使用50 mL注射器和Millipore 0.22 μm無菌濾器過濾冷卻的金溶膠，過濾后的金溶膠轉(zhuǎn)移至干凈玻璃瓶，并用錫箔包被4℃保存。合成的納米金519 nm吸收峰通過朗伯-比爾定律進(jìn)行定量，對于13 nm納米金，消光系數(shù)為2.7×108M-1·cm［9-10］。

1.2.1.3納米金的巰基磷酸和巰基環(huán)糊精雙修飾取13 nmol/L的納米金20 mL，加入11.49 mg單-（6-巰基）β-環(huán)糊精，充分搖勻待固體溶解后加入1 mmol/L巰基磷酸100 μL，混勻，避光靜置，2 h后使用。

1.2.2瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳（Agarose Gel Electrophoresis）用來表征不同修飾納米顆粒的表面電荷情況。電泳在0.8%的瓊脂糖凝膠，緩沖液為TAE（40 mmol/L Tris-acetate，1 mmol/L EDTA，pH7.0），100 V的恒壓模式條件下進(jìn)行。

1.2.3微囊藻毒素LR亞型（MC-LR）的吸附量的測定取20 μL MC-LR（125 μg/mL）分別加入1 mL蒸餾水，1 mL未修飾的納米金，1 mL修飾的納米金中，充分混勻，離心取上清液進(jìn)行吸光度測定（239 nm），計(jì)算吸附量和靜態(tài)分配系數(shù)，吸附量=MC-LR總濃度-上清液中MC-LR濃度。

1.2.4識別吸附特性表示方法［11］識別性能通常用靜態(tài)分配系數(shù)KD來表征。靜態(tài)分配系數(shù)KD的定義為KD=Cp/Cs，Cp表示聚合物結(jié)合底物的濃度（μmol/g，相當(dāng)于單位質(zhì)量的吸附量），Cs表示溶液中底物的平衡濃度（μmol/L）。

1.3修飾電極的制備

1.3.1玻碳電極的預(yù)處理［12］直徑為3 mm的玻碳電極先在金相砂紙上打磨，再依次用0.3、0.05 μm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面。然后用水超聲清洗數(shù)分鐘后取出，依次用1∶1乙醇、1∶1 HNO3和超純水超聲清洗。置于0.5 mol/L硫酸（H2SO4）溶液中，在-0.2～1.5 V的電位范圍內(nèi)以0.5 V·s-1反復(fù)掃描至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。最后在含1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.2 mol/L KCl溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，以測試電極性能，掃描速度50 mV/s，掃描范圍0.6～-0.1 V。

1.3.2聚中性紅膜修飾納米金電極的制備［13］預(yù)處理后的電極在0.025 mol/L磷酸緩沖液（pH5.5），0.5 mol/L KCl和1.0×10-4mol/L中性紅溶液中于-1.0～1.4 V電位下引發(fā)10圈，再于-0.8～0.8 V電位下聚合30圈，即制成中性紅聚合物修飾電極。

圖1　雙修飾納米金特異性結(jié)合MC示意圖Fig.1　An illustration of specific binding with bi-modified gold nanoparticles for MC

1.3.3表面修飾納米金電極的制備聚合物修飾電極表面滴入雙修飾納米金，4℃放置12 h。

1.4電極伏安行為的測試

采用三電極體系：金電極為工作電極，飽和KCl甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極。電極聚合前后及聚合電極修飾前后電極于1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.2 mol/L KCl溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描速度50 mV/s，掃描范圍0.6～-0.1 V。中性紅聚合物修飾電極于pH5.5的磷酸緩沖液中以不同的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描掃描范圍-0.8～0.8 V。

表面修飾納米金電極微分脈沖伏安法（DPV）檢測：聚合物修飾電極表面修飾雙修飾納米金后，置于含不同藻毒素濃度的1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行，掃描范圍-0.2～0.6 V，其余條件默認(rèn)。

2　結(jié)果與分析

2.1修飾納米金對微囊藻毒素的識別吸附特性

圖2　不同修飾納米金的瓊脂凝膠電泳Fig.2　Agarose gel electrophoresis of the different modified gold nanoparticles

如圖2所示，經(jīng)過巰基環(huán)糊精修飾的納米金在凝膠中的遷移速率比沒有修飾納米金的遷移速率要快，納米顆粒表面負(fù)電荷變多或水化半徑變小會引起凝膠電泳運(yùn)動速率變快。環(huán)糊精修飾在納米金表面不帶電荷，則說明環(huán)糊精修飾使得納米顆粒水化半徑變??；2和3泳道比較可知，經(jīng)過巰基環(huán)糊精修飾后的納米金再經(jīng)過巰基磷酸修飾，運(yùn)動速率變快，是由于磷酸化修飾使納米金帶上了更多負(fù)電荷，使巰基環(huán)糊精和巰基磷酸雙修飾的納米金的遷移速率要大于巰基環(huán)糊精修飾的納米金；3和4泳道比較可知，加入微囊藻毒素之后遷移速度減慢，說明雙修飾后的納米金能夠與微囊藻毒素結(jié)合，結(jié)合后的相互作用導(dǎo)致納米顆粒水化半徑變大，在電場下在凝膠中運(yùn)動時(shí)空間位阻變大導(dǎo)致遷移速度減慢。

圖3　雙修飾納米金對MC的識別吸附特性Fig.3　Absorption characteristics of bi-modified gold nanoparticles for MC

2.2納米金對微囊藻毒素的識別吸附特性

如圖3所示，雙修飾納米金與納米金對微囊藻毒素的吸附量和靜態(tài)分配系數(shù)有明顯差異，其吸附量達(dá)到2.125 μg/mL，靜態(tài)分布系數(shù)為5.67，雙修飾納米金的靜態(tài)分配系數(shù)為未修飾納米金靜態(tài)分配系數(shù)的123倍，說明納米粒子表面進(jìn)行修飾的巰基環(huán)糊精和巰基磷酸能夠分別與MC中的疏水苯環(huán)結(jié)構(gòu)和精氨酸的胍基相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對MC的特異性的結(jié)合，從而富集水樣或食品樣品中的MC。

2.3中性紅聚合物膜修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)

圖4　中性紅聚合物膜修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)Fig.4　Electrochemical behavior of polymerization of neutral red

為了實(shí)現(xiàn)雙修飾納米金對玻碳電極的修飾，先對玻碳電極進(jìn)行中性紅聚合物膜的修飾，聚中性紅在中性pH下通常帶正電，可以很好的吸附帶負(fù)電的納米金或修飾納米金。圖4為中性紅聚合物膜修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)。圖4a中隨著在中性紅溶液中循環(huán)伏安掃描圈數(shù)增加，0.2 V附近和-0.4 V附近峰電流逐漸增加，說明隨著掃描圈數(shù)增加電極表面形成了中性紅聚合物膜。其聚合機(jī)理主要是高電位引發(fā)中性紅形成自由基，自由基進(jìn)一步相互碰撞形成二聚體，進(jìn)而形成低聚物和聚中性紅聚合物膜。在-0.8～0.8 V內(nèi)，峰電流均隨掃描周數(shù)的增加而增大，說明中性紅聚合物膜為導(dǎo)電膜。

圖4b為中性紅聚合物膜修飾電極在pH5.5濃度為0.1 mol/L的醋酸緩沖液（含0.1 mol/L KCl作為支持電解質(zhì)）中，于-0.8～0.8 V電位范圍內(nèi)不同掃速下的伏安曲線。從圖4b可以看出，隨著掃描速度的不斷增加，峰電流值也不斷的增加，仍能得到對稱性良好的CV圖，表明固定在電極表面的中性紅呈現(xiàn)出良好的氧化還原可逆性。同時(shí)峰電流與掃速成線性關(guān)系，這表明修飾電極在緩沖液中的電化學(xué)過程受表面控制。

2.4雙修飾納米金/中性紅聚合物膜修飾電極的電化學(xué)響應(yīng)

圖5　修飾電極的循環(huán)伏安圖Fig.5　Cyclic voltammogram of the modified electrode

圖5為各種電極的電化學(xué)響應(yīng)圖。從圖5中可見中性紅聚合物在電極表面形成后，由于中性紅聚合物膜導(dǎo)電，導(dǎo)致電極溶液的界面變大，從而峰電流也相應(yīng)變大，吸附修飾納米金后，電流顯著變小，是因?yàn)槲郊{米金后表面帶負(fù)電，阻止了同樣帶負(fù)電的六氰合鐵基團(tuán)的進(jìn)入從而使電流變小。上述循環(huán)伏安表征表明，電極表面聚中性紅修飾和該修飾電極進(jìn)一步吸附帶負(fù)電荷的雙修飾納米金顆粒均取得了成功。

2.5雙修飾納米金/中性紅聚合物膜修飾電極的線性范圍和檢測限

聚中性紅修飾電極結(jié)合雙修飾的納米金后于含不同藻毒素濃度的1×10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行微分脈沖伏安法掃描，結(jié)果見圖6a，得到單一的峰，峰電流隨藻毒素濃度增大而變小。以藻毒素濃度對數(shù)對峰電流見圖6b，在26 nmol/L～213 μmol/L范圍內(nèi)，可得到線性良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.4764x+ 6.6915，R2=0.9966。檢測限為（3σ/S）19 nmol/L。

2.6干擾物質(zhì)對雙修飾納米金/中性紅聚合物膜修飾電極的影響

當(dāng)溶液中藻毒素濃度為1×10-6mol/L時(shí)，在1× 10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行微分脈沖伏安法掃描時(shí)，加入濃度為10倍的苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、尿素、dNTP、乙酸無顯著干擾。

將吸附雙修飾納米金后的中性紅聚合修飾的玻碳電極在pH7.0的PBS中循環(huán)掃描50圈，再置于1× 10-3mol/L K3Fe（CN）6的0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行微分脈沖伏安法掃描，峰電位不變，峰電流下降了4.2%。同一條件下，連續(xù)10次測定同一支電極對1× 10-6mol/L藻毒素的響應(yīng)電流，RSD為3.40%，表明該電極有較好的重現(xiàn)性。該電極不使用時(shí)，放置于4℃的PBS溶液（pH7.0）中保存。2周后電極的響應(yīng)下降約8.5%。

3　結(jié)論

圖6　微分脈沖伏安法（DPV）對不同濃度MC的信號響應(yīng)Fig.6　Responses signal of differential pulse voltammetric analysis to different concentrations MC

通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)及吸附量的測定，表明針對微囊藻毒素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的β-環(huán)糊精和磷酸雙修飾納米金顆粒實(shí)現(xiàn)了微囊藻毒素的特異性吸附。將雙修飾的納米金吸附于中性紅修飾的玻碳電極表面制備了微囊藻毒素檢測電極，在26 nmol/L～213 μmol/L范圍內(nèi)，可得到線性良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有良好的選擇性，抗干擾能力強(qiáng)，使用方便，為水樣及食品樣品中MC的快速檢測提供了新的方法。

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Determination of microcystins by electrode modified with bi-modified gold nanoparticles with mono-6-thio-β-cyclodextrin and thiol phosphate modification

GAN Ke1，ZHAO Hui2，WANG Hai-ying1，WANG Chao-yuan1，LIANG Xiao-sheng1，*
（1.Collage of Life Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China；2.Hubei Inspection and Quarantine Technology Center，Wuhan 430050，China）

In order to determinate microcystins fast and sensitively，an electrochemistry determination method of differential pulse voltammetry was established with bi-modified gold nanoparticles.The bi-modified gold nanoparticles were prepared by modifying gold nanoparticles with mono-6-thio-β-cyclodextrin and thiol phosphate based on the structural characteristics of microcystins.The bi-modified gold nanoparticles had an absorbance capability of 2.125 μg/mL and a static allocation coefficient of 5.67，respectively.Then microcystin was determined with the electrochemical sensor prepared with a glassy carbon electrode which modified with toluylene red polymer to get a positive charged surface for absorbing the bi-modified gold nanoparticles.The result showed that this method had a strong resisting interference ability with a linear range of determination from 26 nmol/L to 213 μmol/L and a detection limit of 19 nmol/L，respectively.

microcystins；gold nanoparticles；mono-6-thio-β-cyclodextrin；thiol phosphate；modified electrode

TS207.3

A

1002-0306（2016）04-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.001

2015－05－29

甘科（1988-），男，在讀碩士研究生，研究方向：微藻生物技術(shù)，E-mail：agan.201@163.com。

梁曉聲（1984-），男，博士，講師，研究方向：納米生物技術(shù)，E-mail：liangxs@mail.scuec.edu.cn。

國家質(zhì)檢總局公益基金（201310141）。