丁靜，王玉芝，沈娟，朱家勇，金小寶（.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗科，廣東 廣州 5060；.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東廣州5000；.廣東藥學(xué)院廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州50006）

抗菌肽LL-37對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的抑制作用

丁靜1，王玉芝2，沈娟3，朱家勇3，金小寶3
（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗科，廣東 廣州 510260；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東廣州510010；3.廣東藥學(xué)院廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006）

目的研究人抗菌肽LL-37對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）生物膜的相關(guān)作用，為MRSA的預(yù)防治療以及新藥物開發(fā)應(yīng)用提供新策略。方法 運用微量肉湯稀釋法測定LL-37對臨床MRSA菌株的最小抑菌濃度；建立96孔板及6孔板生物膜體外模型；通過結(jié)晶紫定量法以及激光共聚焦熒光染色法檢測LL-37對MRSA生物膜形成的影響。結(jié)果 微量肉湯稀釋法測得LL-37對臨床MRSA菌株的MIC為12.5 μmol/L。不同濃度LL-37作用后，結(jié)晶紫定量法結(jié)果表明1/20 MIC亞抑菌濃度的LL-37即可抑制生物膜形成（P＜0.01），且抑制率隨用藥濃度增加也隨之提高，在1/4 MIC條件下生物膜形成抑制率可達(dá)到63%。與生理鹽水對照組相比，激光共聚焦掃描顯微鏡下可見，用藥組生物膜排列稀疏，厚度變薄，組成菌量明顯減少。結(jié)論 低濃度的LL-37能夠抑制MRSA生物膜的形成，并且對成熟生物膜結(jié)構(gòu)也具有一定的破壞作用。

人抗菌肽LL-37；生物膜；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistant Staphylococcus aureus，MRSA）因“超級細(xì)菌”一詞被公眾熟知。日前，Yao等［1］研究發(fā)現(xiàn)廣州地鐵7條線路不同的公共設(shè)施上采集到的320份樣本中，MRSA占2.5%。MRSA是臨床常見耐藥菌的一種，主要造成院內(nèi)感染以及社區(qū)感染。由于其表現(xiàn)多重耐藥，使得臨床感染治療較為棘手。一直以來，世界范圍內(nèi)MRSA的致死率居高不下，嚴(yán)重威脅了人類健康以及社會公共衛(wèi)生的安全。MRSA耐藥機(jī)制復(fù)雜，目前有研究［2］發(fā)現(xiàn)生物膜的形成可以增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性。細(xì)菌生物膜（biofilm，BF）是多個細(xì)菌黏附于非生物或生物表面，分泌多聚物基質(zhì)并將自身包裹其中形成的一種有組織的細(xì)菌集團(tuán)。一旦細(xì)菌定植在人體生命組織表面（心臟、肺、腸、尿道等）或醫(yī)學(xué)生物材料表面（人工心臟瓣膜、人工關(guān)節(jié)、植入導(dǎo)管等），均可能造成細(xì)菌生物膜感染［3］。生物膜形式的細(xì)菌有了多聚基質(zhì)的保護(hù)，可以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊以及抗菌藥物的殺傷，耐藥性增強(qiáng)，同時生物膜還能持續(xù)釋放細(xì)菌，造成感染反復(fù)發(fā)作并且久治不愈。因此，尋求一種能夠有效預(yù)防或控制細(xì)菌生物膜感染的藥物成為研究者關(guān)注的熱點之一。

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一類由生物免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性多肽，能夠抵抗多種病原體的感染。與傳統(tǒng)抗生素相比，AMPs具有抗菌譜廣、抗菌活性高等優(yōu)點。LL-37是Cathelicidin抗菌肽家族的一員，由37個氨基酸組成而得名。LL-37表達(dá)分泌于人體內(nèi)多種上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、體液、創(chuàng)傷分泌物等處，能夠發(fā)揮抗微生物活性，參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，是一個具有多種功能的活性小分子肽［4-5］。除了殺死游離細(xì)菌，LL-37對生物膜形式的表皮葡萄球菌［6］、綠膿桿菌［7］、鮑曼不動桿菌［8］等也能發(fā)揮抑制活性，而對于MRSA生物膜是否有相應(yīng)作用還尚未見報道。本實驗初步探討了LL-37對MRSA生物膜的作用及相關(guān)機(jī)制，為臨床預(yù)防控制MRSA感染提供參考依據(jù)，同時也為小分子抗菌多肽的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株 MRSA來自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床分離（編號:1491601）。

1.1.2主要試劑 人抗菌肽LL-37（純度＞90%）由本實驗室原核表達(dá)純化獲得；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSBg）購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；LIVE/DEAD BacLightTM Bacterial Viability Kits購自Invitrogen公司。其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1最小抑菌濃度測定 采用微量肉湯稀釋法檢測 LL-37對 MRSA臨床株的最小抑菌濃度（MIC）。取無菌96孔板，每孔加入濃度為2×106CFU/mL的對數(shù)生長期菌液100 μL。調(diào)整LL-37溶液濃度如下:200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39 μmol/L。無菌生理鹽水為陰性對照，每孔加入LL-37溶液100 μL（每個濃度6個復(fù)孔）。混合均勻后37℃過夜培養(yǎng)。加入0.5%（ρ）氯化三苯四氮唑溶液（TTC）5 μL，37℃溫育后觀察結(jié)果，有細(xì)菌生長孔顯現(xiàn)紅色。無細(xì)菌生長孔對應(yīng)的最小用藥濃度即為MIC值。

1.2.2成膜能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)［9］方法，選取聚苯乙烯96孔板為非生命載體，1%葡萄糖的TSBg培養(yǎng)基為空白對照。調(diào)節(jié)對數(shù)生長期MRSA濃度至1×106CFU/mL。每孔加入菌液200 μL，置于37℃培養(yǎng)24 h。棄去孔中溶液，洗板。99%（φ）甲醇溶液固定生物膜。2%（φ）結(jié)晶紫溶液染色，洗板，再加入33%（φ）冰乙酸溶液160 μL。待結(jié)晶紫完全溶解后，酶標(biāo)儀測定570 nm吸光度值（A）。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.3LL-37對MRSA生物膜形成的影響

（1）結(jié)晶紫染色法 無菌96孔板中接種MRSA菌液100 μL，菌濃為2×106CFU/mL。每孔各加入LL-37溶液100 μL，濃度分別為6.25、3.13、0.625、0.0625、0 μmol/L（每個濃度6個復(fù)孔）；37℃培養(yǎng)24 h后按照“1.2.2”操作。使用酶標(biāo)儀測定570 nm吸光度值（A）。每組實驗重復(fù)3次。

（2）激光共聚焦熒光染色法 無菌6孔板孔底平放無菌蓋玻片（18 mm×18 mm）作為生物膜載體。接種濃度為1×106CFU/mL的MRSA菌液，每孔各1 mL；以1%葡萄糖的TSBg為陰性對照，用藥組加入3.13 μmol/L LL-37溶液1 mL，各設(shè)3個復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24 h；無菌生理鹽水清洗玻片，去除表面游離的細(xì)菌；4℃條件下2.5%（φ）戊二醛固定1.5 h；再次用無菌生理鹽水清洗玻片，使用 LIVE/DEAD BacLightTMBacterial Viability Kits對生物膜進(jìn)行染色；抗熒光淬滅劑封片后，利用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）觀察MRSA生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4LL-37對MRSA初始附著的影響 無菌96孔板中接種MRSA菌液100 μL，菌濃為2×106CFU/mL。每孔各加入LL-37溶液100 μL，濃度分別為6.25、3.13、0.625、0.0625、0 μmol/L（每個濃度6個復(fù)孔）；37℃培養(yǎng)1 h；棄去孔中的溶液，按照“1.2.2”操作。使用酶標(biāo)儀測定570 nm吸光度值（A）。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.5LL-37對成熟生物膜的作用 無菌96孔板中接種MRSA菌液100 μL，菌濃為2×106CFU/mL。37℃培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水洗板，去除表面游離的細(xì)菌；每孔各加入LL-37溶液100 μL，濃度分別為6.25、3.13、0.625、0.0625、0 μmol/L（每個濃度6個復(fù)孔）；37℃培養(yǎng)24 h；棄去孔中的溶液，按照“1.2.2”操作。使用酶標(biāo)儀測定570 nm吸光度值（A）。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件分析處理，經(jīng)方差分析之后t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1LL-37對MRSA的最小抑菌濃度

微量肉湯稀釋實驗測得，LL-37對本實驗選取的MRSA臨床株的MIC為12.5 μmol/L。

2.2MRSA體外生物膜形成檢測

結(jié)晶紫染色后，MRSA臨床株組96孔板底部肉眼可見紫色膜狀物質(zhì)；MRSA臨床株組A570與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1　MRSA體外生物膜形成分析Figure 1 Analysis of the biofilm formation of MRSA

2.3LL-37抗MRSA生物膜活性分析

結(jié)晶紫染色法結(jié)果顯示，在0.625 μmol/L作用濃度下，LL-37對MRSA臨床株生物膜的抑制活性為27%，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。LL-37的抑制活性隨著用藥濃度增加隨之增強(qiáng)，當(dāng)用藥濃度達(dá)到3.13 μmol/L時，LL-37對MRSA生物膜形成的抑制率達(dá)到63%，而此時用藥濃度僅為MIC的1/4。見圖2。

圖2　LL-37抗MRSA生物膜活性分析Figure 2 Effect of LL-37 on MRSA biofilms

激光共聚焦顯微鏡掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSBg對照組與LL-37組差異顯著。TSBg對照組生物膜熒光信號強(qiáng)，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)菌排列致密，成型生物膜平均厚度統(tǒng)計為（20±5）μm，生物膜發(fā)育較為成熟。LL-37組生物膜熒光信號弱，排列疏松，成熟菌斑總量明顯減少，厚度偏薄（5±2）μm，僅為對照組的1/4（圖3）。由以上結(jié)果可知，亞抑菌濃度的LL-37能夠發(fā)揮較強(qiáng)的抑制MRSA生物膜形成的活性作用。

圖3　CLSM觀察LL-37抗MRSA生物膜活性Figure 3 Effect of LL-37 on MRSA biofilms of by CLSM

2.4結(jié)晶紫染色法分析LL-37對MRSA初始附著的影響

細(xì)菌黏附于載體表面是生物膜形成的第一步，也是比較重要的一個環(huán)節(jié)。細(xì)菌初始附著量決定了細(xì)菌能否形成成熟的生物膜。定量結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)MRSA生物膜形成初期細(xì)菌附著總量明顯減少。與陰性對照組相比，0.625 μmol/L（1/20 MIC）LL-37組細(xì)菌附著量降低明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。即LL-37在1/20 MIC用藥濃度下即能抑制MRSA的初始附著行為，并且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性增強(qiáng)。見圖4。

圖4　LL-37抗MRSA初始生物膜附著分析Figure 4 Effect of LL-37 on the intial attachment of MRSA biofilms

2.5結(jié)晶紫染色法分析LL-37對成熟MRSA生物膜的作用

結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，不同濃度LL-37組生物膜總量出現(xiàn)不同程度降低，1/20 MIC用藥濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。由此表明LL-37在亞MIC濃度下可對已形成的生物膜造成影響，并且呈現(xiàn)劑量依賴性增強(qiáng)。見圖5。

圖5　LL-37對MRSA已形成的生物膜作用分析Figure 5 Effect of LL-37 on the formed MRSA biofilms

3　討論

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生是臨床治療感染時最常遇到的棘手問題，原因眾多，而細(xì)菌生物膜是較為重要的原因之一。生物膜形式的細(xì)菌與浮游狀態(tài)相比，集團(tuán)數(shù)目龐大、排列密度高、生長相對緩慢，對抗生素、機(jī)體免疫分子等的抗性大大提高，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床感染問題。據(jù)統(tǒng)計，生物膜內(nèi)細(xì)菌較其浮游狀態(tài)對抗生素的耐藥性可提高100～1 000倍［10］。臨床上治療細(xì)菌生物膜感染采取抗生素單獨給藥往往不能獲得理想療效。在這種情況下，研究細(xì)菌生物膜就為臨床控制生物膜感染特別是相關(guān)難治性、慢性感染疾病提供新的有效途徑。

文獻(xiàn)［11-12］顯示，LL-37作為Cathelicidin家族唯一一個人源抗菌肽，對細(xì)菌、真菌、病毒、支原體均有抑制作用。除了廣譜抗菌，參與機(jī)體免疫反應(yīng)，LL-37在體外還能有效發(fā)揮抗細(xì)菌生物膜的活性。Overhage等［7］研究發(fā)現(xiàn)低濃度LL-37能夠刺激綠膿桿菌Ⅳ型菌毛的合成，促進(jìn)菌體運動，減少菌體之間的接觸，干預(yù)綠膿桿菌生物膜的形成，同時還干擾生物膜的群體感應(yīng)，發(fā)揮抗生物膜活性。史鵬偉等［8］研究證實，LL-37能夠破壞鮑曼不動桿菌生物膜結(jié)構(gòu)，這種活性在2.5 μg/mL即可出現(xiàn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其MIC濃度。Chennupati等［13］建立銅綠假單胞菌生物膜感染的新西蘭兔鼻竇炎模型，證實24個氨基酸的LL-37肽衍生物能夠有效消除模型的假單胞菌生物膜，并且能顯著降低細(xì)菌的總負(fù)荷量。

本研究建立了MRSA 96孔板及6孔板生物膜體外模型，通過結(jié)晶紫定量法以及激光共聚焦顯微鏡定性法分別證實了LL-37具有抗MRSA生物膜的活性。根據(jù)實驗結(jié)果，筆者認(rèn)為，LL-37以劑量依賴的方式抑制MRSA生物膜的形成，主要是通過以下3條途徑:①LL-37存在的情況下，MRSA菌體初始附著率顯著降低，這就直接減少了載體表面初始附著的菌體數(shù)量，LL-37在生物膜形成的第一步就發(fā)揮了重要的干預(yù)作用；②在生物膜形成過程中，LL-37抑制細(xì)菌聚集成團(tuán)，在1/4 MIC 3.13 μmol/L濃度條件下，可以抑制臨床耐藥株MRSA 63%生物膜的形成，且抑制率與用藥濃度呈正比，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果也證實了LL-37對生物膜形成過程的抑制作用，用藥組形成的生物膜厚度顯著比對照組薄，且結(jié)構(gòu)稀疏。③LL-37對已形成的生物膜具有破壞作用，我們首先在96孔板中接種MRSA，培養(yǎng)24 h，待生物膜形成后，加入LL-37作用24 h后，結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，1/4 MIC濃度的LL-37組已成形的生物膜總量與對照組相比顯著降低。實驗中LL-37能夠發(fā)揮抗生物膜活性的有效濃度低于MRSA的MIC （12.5 μmol/L），也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于LL-37對宿主出現(xiàn)毒性作用的濃度（15～25 μmol/L）［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的LL-37能夠抑制MRSA生物膜的形成，并且對于成熟生物膜也具有一定的破壞作用，證實了人抗菌肽LL-37體外具有抗MRSA生物膜的活性。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

Effect of human antimicrobial peptide LL-37 on methicillin-resistant Staphylococcus aureus biofilms

DING Jing1，WANG Yuzhi2，SHEN Juan3，ZHU Jiayong3，JIN Xiaobao3
（1.Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China；2.General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010；3.Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006，China）

Objective To investigate the effect of human cathelicidin antibacterial peptide LL-37 on biofilm formation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA），and provide a new strategy for clinical prevention and treatment of drug-resistant biofilm infection.Methods The minimal inhibitory concentration of LL-37 was determined by broth microdilution assay.The model of MRSA biofilms in vitro was established in 96-and 6-well plates.The biofilm production was quantified by crystal violet and the biofilm morphology was observed by confocal laser scanning microscopy（CLSM）.Results The minimal inhibitory concentration of LL-37 was 12.5 μmol/L.The model of MRSA biofilms in vitro was successfully established.LL37 treatment inhibited the attachment and biofilm formation of MRSA in a dose-dependent way.A low concentration of LL37（1/20 MIC）decreased the biofilm formation of MRSA，and even the inhibition rate of 1/4 MIC reached to 63%.After LL-37 treatment，the bacterial biofilm mass was significantly reduced andthe biofilm was thinner and looser observed by CLSM.Conclusion LL37 with a low concentration far below MIC may decrease the bacteria attachment and the biofilm mass in vitro.

human antibacterial peptide LL-37；biofilm；methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Q51

A

1006-8783（2016）04-0498-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041202

2016-04-12

廣州醫(yī)科大學(xué)青年科研項目（2013A09）

丁靜，女，碩士，檢驗技師，主要從事藥用生物活性研究，Email:xdj.djx@163.com；通信作者:朱家勇，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事藥用生物活性物質(zhì)篩選、結(jié)構(gòu)功能與應(yīng)用研究，Email:zhujy@gdpu.edu.cn。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-04 15:35 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160704.1535.004.html