戴良成，袁保紅，羅曉春，黃萍，尹輝（.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州50080；.廣東藥科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州50006）

黃芪甲苷促M(fèi)2型巨噬細(xì)胞極化的作用研究

戴良成1，袁保紅2，羅曉春2，黃萍2，尹輝2
（1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510080；2.廣東藥科大學(xué) 基礎(chǔ)學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006）

目的探討黃芪甲苷對M2型巨噬細(xì)胞極化的影響。方法黃芪甲苷體外作用小鼠原代巨噬細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測其表面分子（CD206、MHCII和CD80/86）表達(dá)，Real time-PCR檢測M1/M2型巨噬細(xì)胞特征基因（iNOS、YM1和Arg1）的表達(dá)，ELISA測定炎癥相關(guān)細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、TGF-β）的表達(dá)。結(jié)果黃芪甲苷單獨(dú)處理未能誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞生成，但其與IL-13聯(lián)合處理可明顯上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD206、YM1和Arg1的表達(dá)，下調(diào)抗原提呈相關(guān)分子MHCII和CD80/86的表達(dá)，促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子TGF-β的分泌。結(jié)論黃芪甲苷通過協(xié)同作用方式促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

黃芪甲苷；巨噬細(xì)胞；M1/M2型極化；TGF-β

巨噬細(xì)胞是造血系統(tǒng)中可塑性最強(qiáng)的一類細(xì)胞，具有極強(qiáng)的功能多樣性，在機(jī)體正常發(fā)育、體內(nèi)平衡、組織修復(fù)和抗病原體感染中發(fā)揮重要作用［1-3］。根據(jù)表型和功能差異，巨噬細(xì)胞分M1型即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞和M2型即替代性活化的巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞參與促炎反應(yīng)，在防御病原體感染中發(fā)揮核心作用；M2型巨噬細(xì)胞與抗炎反應(yīng)、組織重構(gòu)及腫瘤疾病發(fā)展相關(guān)［4-5］。黃芪甲苷

（astragaloside IV，AS-IV）作為黃芪主要活性成分，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、促損傷組織修復(fù)中起重要作用，然而其促組織巨噬細(xì)胞M2型極化的影響尚不清楚［6-7］。本文從黃芪甲苷對巨噬細(xì)胞M1/M2型分化、特征及功能影響進(jìn)行研究，為明確黃芪甲苷在組織修復(fù)重塑中的免疫機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量20～25 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2008-0002。

1.1.2試劑 AS-IV（純度≥98%，阿拉丁公司）；TRIzol試劑、SYBR Green qPCR kit（美國Invitrogen公司）；ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）；熒光素標(biāo)記CD206、MHCII和CD80/86單克隆抗體（美國Biolegend公司）。

1.1.3主要儀器 相差倒置顯微鏡CKX41SF（日本Olymbus公司）；酶標(biāo)儀Model 680（美國BIO-RAD公司）；PCR儀T3000（美國Biometra公司）；流式細(xì)胞儀FACS CALIBUR（美國BD公司）。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓來源原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)［8］分離C57BL/6小鼠股骨，用DMEM沖洗骨髓腔獲得單個骨髓細(xì)胞；篩網(wǎng)過濾，離心棄上清，裂解紅細(xì)胞；DMEM（含10%FBS）洗滌1次并重懸細(xì)胞，接種至培養(yǎng)皿，37℃、5%（φ）CO2進(jìn)行培養(yǎng)；4 h后，收集未貼壁細(xì)胞，用含巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)培養(yǎng)至7 d，即可獲得成熟的原代巨噬細(xì)胞。

1.2.2巨噬細(xì)胞極化實(shí)驗(yàn) 調(diào)整巨噬細(xì)胞密度為1 ×106/mL，并鋪于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1 mL/孔）中，培養(yǎng)過夜。分5組誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，包括PBS對照組、100 ng/mL脂多糖（LPS）處理組、20 ng/mL IL-13處理組、30 μg/mL黃芪甲苷（AS-IV）處理組、20 ng/mL IL-13聯(lián)合30 μg/mL黃芪甲苷處理組。37℃培養(yǎng)24 h或48 h后，收集巨噬細(xì)胞和培養(yǎng)上清，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.3流式細(xì)胞儀測定巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志 重懸巨噬細(xì)胞，加入不同熒光標(biāo)記的anti-CD80 mAb、anti-CD86 mAb、anti-MHCII mAb和anti-CD206 mAb，室溫孵育30 min；流式細(xì)胞儀CALIBUR檢測細(xì)胞表面標(biāo)志。

1.2.4Real-time PCR檢測基因表達(dá) TRIzol提取巨噬細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，SYBR Green qPCR檢測iNOS、YM1和Arg1基因的表達(dá)水平。運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各組基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

1.2.5ELISA測定細(xì)胞因子表達(dá) 收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA kit操作步驟，測定TNF-α、IL-6 和TGF-β水平。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示，兩組間變量差異比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1巨噬細(xì)胞M1/M2型極化后形態(tài)學(xué)變化

小鼠骨髓巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，LPS、IL-13和AS-IV處理48 h，巨噬細(xì)胞形態(tài)變化見圖1。LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向經(jīng)典M1型極化，細(xì)胞形態(tài)呈樹枝狀，有明顯絲狀偽足突起；IL-13誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，細(xì)胞形態(tài)類似未極化的巨噬細(xì)胞，成橢圓形或紡錘狀。AS-IV單獨(dú)或協(xié)同IL-13處理巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)呈M2型極化。

2.2AS-IV對M2型巨噬細(xì)胞特征性標(biāo)志CD206表達(dá)的作用

AS-IV處理48 h后，流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志的變化情況見圖2。LPS刺激能增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)抗原提呈分子（MHCⅡ）和共刺激分子（CD80和CD86）的水平；而IL-13、AS-IV處理后上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞表面CD206的表達(dá)，兩者協(xié)同作用更為明顯。

表1　PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

2.3 AS-IV對M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

AS-IV處理24 h后，Real time-PCR檢測M1/M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的變化情況見圖3。LPS刺激能上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞iNOS基因的表達(dá)；而AS-IV協(xié)同IL-13作用時(shí)，能明顯上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞YM1和Arginase-1基因表達(dá)，AS-IV單獨(dú)處理未能影響相關(guān)基因的表達(dá)。

2.4AS-IV對M2型巨噬細(xì)胞TGF-β表達(dá)的影響

AS-IV處理48 h后，收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA測定上清液中細(xì)胞因子含量結(jié)果見圖4。LPS刺激能上調(diào)M1型巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)；IL-13、AS-IV能上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子TGF-β的表達(dá)，兩者協(xié)同效應(yīng)尤為明顯。

圖1　巨噬細(xì)胞極化后的形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 Morphology of macrophages after polarization（400×）

圖2　巨噬細(xì)胞極化后表面標(biāo)志的表達(dá)水平Figure 2 Expression of surface markers of macrophages after polarization

圖3　巨噬細(xì)胞極化后的基因表達(dá)水平Figure 3 Gene expression of macrophages after polarization

圖4　巨噬細(xì)胞極化后細(xì)胞因子表達(dá)水平Figure 4 　Levels of cytokines produced by macrophages after polarization

3　討論

黃芪是我國傳統(tǒng)的補(bǔ)益類中藥，具有健脾補(bǔ)中、補(bǔ)氣固表、升陽舉陷、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效［9-10］。AS-IV作為黃芪主要活性成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低血糖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的藥理作用，但目前有關(guān)AS-IV調(diào)節(jié)組織創(chuàng)面愈合的免疫機(jī)理尚不清楚［11-12］。

巨噬細(xì)胞作為一種具有高度可塑性和多能性的細(xì)胞群體，在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中，表現(xiàn)出獨(dú)特的表型和功能。根據(jù)活化狀態(tài)和功能差異，巨噬細(xì)胞分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞通過分泌促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，并專職提呈抗原信號，參與正向免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能；M2型巨噬細(xì)胞僅有較弱的抗原提呈能力，并通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10和/或TGF-β等下調(diào)免疫應(yīng)答，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［4-5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:AS-IV協(xié)同IL-13處理，能明顯上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞特征性標(biāo)志CD206、YM1和Arg1表達(dá)；下調(diào)MHCII和CD80/ 86表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞的抗原提呈能力，并促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子TGF-β的分泌。TGF-β作為一種轉(zhuǎn)化生長因子，可促進(jìn)傷口修復(fù)過程中相關(guān)細(xì)胞和因子的產(chǎn)生，如促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和促進(jìn)角化細(xì)胞遷移從而縮小創(chuàng)面面積并加快愈合速度，還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成，抑制輔助性T細(xì)胞的活化，緩解炎癥反應(yīng)對組織的損傷作用［13］。

Peng等［14］報(bào)道AS-IV通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)正常皮膚組織傷口修復(fù)。AS-IV可促進(jìn)糖尿病小鼠組織創(chuàng)面愈合，與上調(diào)促M(fèi)2型巨噬細(xì)胞極化關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-13的表達(dá)相關(guān)，但其機(jī)理有待明確［15］。本研究發(fā)現(xiàn)相對AS-IV單獨(dú)處理，其協(xié)同IL-13更能有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，并表現(xiàn)相應(yīng)的功能活性。因此，在探討AS-IV調(diào)節(jié)損傷組織修復(fù)的免疫機(jī)理時(shí)，應(yīng)考慮體內(nèi)微環(huán)境對組織巨噬細(xì)胞極化的潛在影響。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

Effect of astragalus IV on M2 macrophage polarization in vitro

DAI Liangcheng1，YUAN Baohong2，LUO Xiaochun2，HUANG Ping2，YIN Hui2
（1.Intensive Care Unit，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China；2.Guangdong Province Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the effect of astragalus IV on M2 macrophage polarization in vitro.Methods Primary macrophages were isolated from mice，and treated with astragalus IV.The surface markers of CD206，MHCII and CD80/86 were analyzed by flow cytometry.M1/M2-associated genes iNOS，YM1 and Arginase-1 were detected by real time-PCR.Levels of IL-6，TNF-α and TGF-β were measured by ELISA. Results Astragalus IV combined with IL-13 significantly increased the expression of M2-associated markers CD206，YM1 and Arginase-1，decreased MHCII and CD80/86 expression and upregulated the level of TGF-β in macrophages.Conclusion Astragalus IV contributes to M2 macrophage polarization in vitro in a synergistic manner.

astragalus IV；macrophages；M1/M2 type polarization；TGF-β

R285

A

1006-8783（2016）04-0494-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016052501

2016-05-25

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014A030313581，2015A030313581）；廣東藥學(xué)院科技處—附屬第一醫(yī)院聯(lián)合自然科學(xué)培育基金項(xiàng)目（GYFYLH201320）

戴良成（1968—），男，副主任醫(yī)師，主要從事ICU重癥醫(yī)學(xué)研究，Email:13798101830@163.com；通信作者:尹輝（1975—），教授，主要從事炎癥相關(guān)免疫性疾病研究，Email:huiyin0103@163.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-04 15:19 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160704.1519.002.html