王阿慧，孫曉鷗，劉青，胡婷婷，韓婷，金亞，譚文（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006）

西地那非對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄誘導(dǎo)大鼠心肌肥大的保護(hù)作用

王阿慧，孫曉鷗，劉青，胡婷婷，韓婷，金亞，譚文
（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/生物醫(yī)藥前孵化器研究中心/廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006）

目的探討西地那非對(duì)大鼠心肌肥大疾病發(fā)展過程中的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法 采用主動(dòng)脈弓縮窄法（TAC）建立大鼠心肌肥大模型，假手術(shù)組（Sham）、模型組（TAC）、西地那非組（SIL）各取3、6、9周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)后分離左心室，測(cè)定脛骨長度。大鼠左心室心肌組織經(jīng)HE染色和天狼星紅染色后，顯微鏡下觀察大鼠心肌細(xì)胞肥大和纖維化程度。熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime PCR）檢測(cè)各組大鼠的左心室心肌組織心鈉肽（ANP）的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組3、6、9周組大鼠的左心質(zhì)量/脛骨長度、心肌細(xì)胞橫截面積、心肌纖維化、ANP mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，西地那非組這些指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05）；ANP mRNA表達(dá)具有時(shí)間依賴性，隨著3、6、9周時(shí)間的增加表達(dá)水平逐漸降低。結(jié)論西地那非在大鼠心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中具有保護(hù)作用，能增強(qiáng)心功能，抑制心肌纖維化，并且隨著時(shí)間的延長發(fā)揮作用越明顯，其作用機(jī)制可能與阻止胚胎基因ANP的再激活有關(guān)。

西地那非；心肌肥大；Wistar大鼠；心鈉肽

心肌肥大是高血壓、冠心病等多種心血管疾病的一種共同的病理生理變化，是心肌對(duì)各種刺激產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)，可使心肌缺血、心律失常、心力衰竭和猝死的幾率增加6～10倍［1-2］。心肌肥大多以心肌細(xì)胞增生肥大、心肌成纖維細(xì)胞增殖和心肌間質(zhì)膠原合成增多為主要病變［3-4］。對(duì)心肌肥大的病理機(jī)制和有效的藥物治療研究具有重要的理論和臨床意義。

西地那非（sildenafil，SIL）在臨床上作為治療男性性功能障礙藥物已有多年歷史，近年來SIL作為心肌保護(hù)藥進(jìn)行開發(fā)，對(duì)心血管疾病的應(yīng)用備受關(guān)注。研究表明，SIL能夠抑制主動(dòng)脈弓縮窄（transverse aortic constriction，TAC）誘導(dǎo)小鼠心肌肥大［5］，其作用機(jī)制可能是通過抑制5型磷酸二酯酶（PDE5）的活性，使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量增加，cGMP激活PKG等下游通路，達(dá)到治療心肌肥大的作用。但是不同的動(dòng)物，甚至同一種動(dòng)物不同種系（大鼠、小鼠）在實(shí)施手術(shù)后，其疾病發(fā)展進(jìn)程、心功能改變等都不盡相同，并且已有的研究中并未表明血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和心肌細(xì)胞橫截面積在疾病發(fā)展過程和治療過程中的變化。目前，SIL在大鼠心肌肥大發(fā)展過程中是否起到與其在小鼠心肌肥大模型中相同的心肌保護(hù)作用及相應(yīng)的作用機(jī)制尚不清楚。

近年來研究表明，心肌肥厚、心力衰竭等患者心鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平顯著升高，已成為診斷和評(píng)估疾病嚴(yán)質(zhì)量程度的生物指標(biāo)［6-8］。進(jìn)一步研究證實(shí)，ANP是心肌肥大的代表性標(biāo)志物之一［9-11］。心肌肥大是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其中ANP的動(dòng)態(tài)表達(dá)是否參與SIL對(duì)心肌肥大的保護(hù)作用有待深入研究。

本研究旨在通過TAC法建立大鼠心肌肥大動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)SIL藥物治療后3、6、9周的心指數(shù)、血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)、心肌細(xì)胞橫截面積、心肌纖維化多個(gè)指標(biāo)的變化，并同時(shí)檢測(cè)肥大基因ANP的mRNA表達(dá)水平，探索SIL在TAC誘導(dǎo)的大鼠心肌肥大發(fā)展過程中的保護(hù)作用及初步的作用機(jī)制，為SIL治療心肌肥大的基礎(chǔ)和臨床研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，8～10周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（粵）2013-0034。

1.2主要儀器

手術(shù)器械（廣州器化醫(yī)療設(shè)備有限公司）；小動(dòng)物呼吸機(jī)（Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA）；PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（AD Instruments Inc.）；組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)冷臺(tái)、石蠟包埋機(jī)熱臺(tái)、旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)、多功能染色機(jī)（德國 Leica）；NANODROP 2000型超微量生物檢測(cè)器（美國Thermo）；7500型熒光定量 PCR儀（美國 life technology）

1.3主要試劑

戊巴比妥鈉（德國Merck）；枸櫞酸西地那非（進(jìn)口分裝原料藥）；伊紅-蘇木素染色液（Merk，進(jìn)口分裝）；天狼星紅染色液（華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；RE-03011型RNA提取試劑盒（FOREGENE）；6210A型逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒（美國life technology）

1.4方法

1.4.1大鼠心肌肥大TAC模型建立［12］大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上；經(jīng)口氣管插管接呼吸機(jī)控制呼吸；手術(shù)區(qū)域備皮消毒，逐層剪開皮、胸大肌、胸小??；在第2～3肋骨間開胸，分離胸腺，暴露主動(dòng)脈弓；穿線，將主動(dòng)脈結(jié)扎于外徑為0.8 mm的針頭；抽出針頭，各組織歸位，關(guān)胸，縫皮，放回鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不結(jié)扎主動(dòng)脈弓以外，其他步驟與模型組相同。

1.4.2分組與給藥 將45只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為9組:假手術(shù)組、模型組、西地那非組各取3、6、9周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組5只。西地那非組在TAC手術(shù)后3 d開始灌胃給藥SIL（70 mg/kg/d），另外6組以等量的空白溶劑每日灌胃，早晚給藥2次，12 h明暗交替。

1.4.3手術(shù)3、6、9周后血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 取出手術(shù)后3周、6周、9周的Wistar大鼠，稱質(zhì)量后腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉；固定于手術(shù)臺(tái)上，通過16通道的Powerlab監(jiān)測(cè)心電圖；鈍性分離左側(cè)股動(dòng)脈，導(dǎo)管經(jīng)左側(cè)股動(dòng)脈插管，監(jiān)測(cè)并記錄動(dòng)脈壓；鈍性分離頸總動(dòng)脈，導(dǎo)管經(jīng)頸總動(dòng)脈到達(dá)左心室，監(jiān)測(cè)并記錄左心室壓［13］。

1.4.4手術(shù)3、6、9周后大鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量、脛骨的測(cè)定和組織處理 麻藥處死大鼠，迅速開胸，剪下心臟并放入冰凍的生理鹽水中，把心腔內(nèi)的血液擠出，用干凈的濾紙吸干水分，記錄心臟的濕質(zhì)量，分離左心室游離壁，稱質(zhì)量后橫切左心室，一部分放進(jìn)10%（φ）中性甲醛溶液中固定保存，其余組織液氮急凍后保存于-80℃?zhèn)溆?，測(cè)定脛骨長度。

1.4.5病理學(xué)觀察 左心室心肌組織石蠟包埋切片后進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色，顯微鏡下觀察，用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算每只大鼠心肌細(xì)胞橫截面積大小和膠原面積占整個(gè)心肌面積的百分比，評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞肥大和纖維化程度。

1.4.6熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR） 在每組5只大鼠中隨機(jī)選取3只，每只大鼠取20 mg左心室心肌組織，嚴(yán)格按照RNA試劑盒提取總RNA。Nanodrop測(cè)定RNA的濃度和純度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，以GAPDH為內(nèi)參基因，△△Ct法檢測(cè)肥大基因ANP mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。按照試劑盒說明書所示，配制熒光定量的反應(yīng)體系。其中，cDNA的模板上樣量約為2 ng，最終的反應(yīng)體系為10 μL。Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)?50℃ 2 min；95℃2 min；95℃ 15 s；60℃ 1 min；40個(gè)循環(huán)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如下: GAPDH上游:5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游:5′-CACCAGTGGATGCAGGGAT-3′；ANP上游: 5′-CATAACCAAGGGCTTCTTCCTCTTC-3′，下游:5′-TTATCTTCGGTACCGGAAGCTGTTG-3′。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1大鼠心肌肥大不同時(shí)間點(diǎn)的左心質(zhì)量/體質(zhì)量和左心質(zhì)量/脛骨長度指標(biāo)

如圖1，與Sham組相比，TAC 3周、6周、9周組大鼠的左心質(zhì)量/體質(zhì)量（LV/BW）、左心質(zhì)量/脛骨長度（LV/TL）均顯著增加（P＜0.01或P＜0.05），說明3、6、9周后，大鼠心肌肥大模型建立成功。SIL組與TAC組相比，LV/BW在SIL 3周組中P＜0.05，在6周組中P＜0.01，在9周組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從圖1-B得出，LV/TL在SIL 3、6、9周中均顯著降低（P＜0.05）。

圖1　手術(shù)3、6、9周后各組大鼠的LV/BW（A）、LV/TL（B）Figure 1 　Ratio of left ventricular weight/body weight，left ventricular weight/tibial length in three groups after 3，6 and 9 week surgery（s，n=5）

2.2大鼠心肌肥大不同時(shí)間點(diǎn)的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

如表1所示，與Sham組相比，TAC 3周、6周、9周組大鼠的左心室壓力最大上升速率（dp/dtmax）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與TAC組相比，SIL治療9周后dp/dtmax顯著降低（P＜0.01）。TAC 3、6周時(shí)左心室壓力最大下降速率（dp/dtmin）的絕對(duì)值顯著升高（P＜0.05），9周時(shí)增加不顯著。左心室舒張末壓（LVEDP）在TAC 6、9周時(shí)顯著升高（P＜0.01），在3周組中升高不顯著。相對(duì)應(yīng)的給予SIL治療 6周、9周中均能顯著降低 LVEDP （P＜0.05）。TAC 3、6、9周中平均左心室壓（Mean LVP）顯著升高（P＜0.01），SIL治療后能降低平均左心室壓。TAC 9周后平均動(dòng)脈壓（MAP）與Sham組相比顯著升高（P＜0.01）；SIL治療后能降低TAC組的平均動(dòng)脈壓（P＜0.05）。

表1　手術(shù)3、6、9周后各組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)Table 1 Cardiac function parameters in three groups after 3，6 and 9 week surgery（s，n=5）

表1　手術(shù)3、6、9周后各組大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)Table 1 Cardiac function parameters in three groups after 3，6 and 9 week surgery（s，n=5）

與Sham組比較:*P＜0.05，**P＜0.01；與TAC組比較:#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　Mean LVP/ mmHg LVEDP/ mmHg MAP/ mmHg （dp/dtmax）/ （×103mmHg·s-1）（dp/dtmin）/ （×103mmHg·s-1）3周　Sham組　76.38±5.35　5.21±0.43　136.30±5.86　8.65±1.52　-6.78±0.66 TAC組　106.20±3.37**　5.87±0.35　148.50±4.66　12.24±0.36*　-9.10±0.35*SIL組　91.59±4.54#　6.12±0.31　144.00±16.98　11.78±1.81　-8.29±0.10 6周　Sham組　61.68±4.33　6.11±0.47　104.30±5.14　7.65±0.66　-5.92±0.52 TAC組　96.64±3.50**　10.75±0.32**　143.30±5.35*　11.34±0.18**　-8.80±0.32**SIL組　93.96±4.66　9.02±0.60#　141.40±4.84　12.97±1.04　-9.96±0.54 9周　Sham組　68.49±3.55　7.23±0.53　128.50±7.92　7.97±0.78　-7.03±0.56 TAC組　97.02±6.60**　13.89±1.21**　163.60±6.64**　12.87±1.12**　-7.65±0.57 SIL組　86.20±1.74　10.85±0.39#　130.00±10.80#　8.55±0.61##　-8.08±0.57

2.3大鼠心肌肥大不同時(shí)間點(diǎn)的心肌細(xì)胞橫截面積大小

由圖2、圖3可知，與Sham組相比，TAC 3、6、9周后的大鼠心肌細(xì)胞橫截面積均顯著增加（P＜0.01），說明TAC手術(shù)后，心肌細(xì)胞明顯肥大，造模成功；與TAC組相比，SIL組均明顯降低心肌細(xì)胞的橫截面積（P＜0.01），說明給予SIL治療3、6、9周時(shí)均能顯著抑制心肌肥大。

圖2　心肌組織HE染色結(jié)果（400×）Figure 2 Cardiac tissues stained by H&E staining in three groups（400×）

2.4大鼠心肌肥大不同時(shí)間點(diǎn)的心肌纖維化程度

由圖4、圖5可知，與Sham組相比，TAC 3、6、9周后的大鼠心肌纖維化面積均明顯增加（P＜0.01），說明TAC引起大鼠心肌膠原分泌，導(dǎo)致心肌纖維化，造模成功；與TAC組相比，給予SIL治療3、6、9周均能顯著抑制心肌纖維化（P＜0.01或P＜0.05）。

圖3　手術(shù)3、6、9周后各組大鼠心肌細(xì)胞橫截面積（μm2）大小Figure 3 Myocyte cross-sectional area in three groups after 3，6 and 9 week surgery（，n=5）

圖4　心肌組織天狼星紅染色觀察心肌纖維化結(jié)果Figure 4 Myocardial fibrosis by Sirius red staining in three groups（200×）

圖5　手術(shù)3、6、9周后各組大鼠心肌纖維化面積百分比Figure 5 Myocardial fibrosis area in three groups after 3，6 and 9 week surgery（，n=5）

2.5大鼠心肌肥大不同時(shí)間點(diǎn)的ANP mRNA相對(duì)表達(dá)量

由圖6可知:與Sham組相比，TAC 3、6、9周的ANP mRNA的相對(duì)表達(dá)量均升高，其中6周組表達(dá)量最高。與TAC組相比，給予SIL能降低TAC 6周、9周組ANP mRNA的表達(dá)水平，且隨著時(shí)間的延長逐漸降低，具有一定的時(shí)間依賴性。

圖6　手術(shù)3、6、9周后各組心肌組織的ANP mRNA相對(duì)表達(dá)量Figure 6 Expression of ANP mRNA in three groups after 3，6 and 9 week surgery（，n=3）

3　討論

當(dāng)前，心肌肥大已被公認(rèn)是心衰、猝死等心血管疾病主要的危險(xiǎn)致病因素，同時(shí)由心肌肥大導(dǎo)致的心衰是全世界發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一［14］，對(duì)其深入研究具有重要意義。

本研究中，SIL組與TAC組相比，TAC組3周、6周組LV/BW中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，9周組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是由于TAC 9周組大鼠心臟質(zhì)量增加的同時(shí)體質(zhì)量也顯著增加。此外，LV/TL在TAC 3、6、9周中均顯著降低，結(jié)果表明，當(dāng)體質(zhì)量變化顯著時(shí)，用LV/BW評(píng)價(jià)心肌肥大可能缺乏可靠性。脛骨長度的生長曲線不受疾病和體質(zhì)量變化的影響，LV/TL可作為判斷心肌肥大程度的可靠指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，TAC 3、6、9周組大鼠的LV/TL、心肌細(xì)胞橫截面積、心肌纖維化、ANP mRNA表達(dá)水平均顯著升高，說明大鼠心肌肥大模型建立成功；與TAC組相比，給予SIL治療能夠降低LV/TL比值，改善心肌肥大大鼠的血流動(dòng)力學(xué)，增強(qiáng)心功能，抑制心肌纖維化。

已有研究表明，心臟負(fù)荷增加可誘導(dǎo)組蛋白去乙酰化酶-4出核信號(hào)、組蛋白去甲基和異染色質(zhì)蛋白-1分解，促使ANP等胚胎基因的再表達(dá)［11］。本研究中，TAC 3、6、9周后，ANP mRNA的相對(duì)表達(dá)量均升高，說明心肌肥大時(shí)內(nèi)源性心臟激素系統(tǒng)的代償作用使ANP分泌增多。ANP mRNA表達(dá)具有時(shí)間相關(guān)性。其中6周組表達(dá)量最高，9周組有所下降可能是由于心臟開始進(jìn)入失代償期，心功能開始下降所致。給予SIL治療后ANP mRNA的表達(dá)量在3周組比TAC組有所上升，在6周和9周組中均比相應(yīng)的TAC組有所下降，并且給予SIL治療的3、6、9周中ANP mRNA的表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長逐漸降低，具有一定的時(shí)間依賴性，推測(cè)可能由于給予SIL治療后誘發(fā)ANP應(yīng)激性反應(yīng)，ANP與其相應(yīng)的受體結(jié)合，舒張血管進(jìn)而降低血壓、減輕心臟負(fù)荷，但隨著時(shí)間的延長，ANP過表達(dá)導(dǎo)致心肌損傷加重，SIL能夠通過抑制ANP的表達(dá)達(dá)到治療作用。提示給予SIL治療可能隨著時(shí)間的延長發(fā)揮作用越明顯。

綜上結(jié)果提示，SIL可能通過抑制心臟負(fù)荷誘導(dǎo)組蛋白去乙酰化酶-4出核信號(hào)、組蛋白去甲基和異染色質(zhì)蛋白-1分解，阻止胚胎基因ANP的再激活，改善心肌肥大大鼠血流動(dòng)力學(xué)，增強(qiáng)心功能，抑制心肌纖維化，并且可能隨著時(shí)間的延長發(fā)揮作用越明顯。但也有文獻(xiàn)表明，SIL對(duì)臨床心衰病人的左心室舒張功能和肺動(dòng)脈收縮壓沒有明顯的改善［15］，其長期的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。后期將同時(shí)設(shè)置小鼠模型進(jìn)行對(duì)比，為心肌肥大動(dòng)物模型的最佳選擇提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

Protective effect of Sildenafil on rat cardiac hypertrophy induced by transverse aortic constriction

WANG Ahui，SUN Xiaoou，LIU Qing，HU Tingting，HAN Ting，JIN Ya，TAN Wen
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Pre-incubator for Innovative Drugs and Medicine Center，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering，Guangzhou 510006，China）

Objective To explore the protective effect and mechanism of Sildenafi（SIL）on rat cardiac hypertrophy induced by transverse aortic constriction（TAC）.Methods TAC method was used to establish the model of cardiac hypertrophy in rats.The rats were randomly divided into three groups，including the sham group，the TAC group and the SIL group.At 3，6 and 9 weeks，hemodynamic parameters were measured in rats，followed by separation of left ventricle and measurement of tibial length.After H&E staining and Sirius red staining，cardiac myocyte hypertrophy and fibrosis were observed by microscopy.The expression of ANP mRNA was detected by real-time PCR.Results Compared with the sham group，left ventricular weight/tibia length，cross-sectional area of myocardial cells，myocardial fibrosis and ANP mRNA expression were significantly higher in TAC rats（P＜0.05）.Compared with the TAC group，these indicatorswere significantly reduced in rats after SIL treatment（P＜0.05）.Meantime，the expression of ANP mRNA was gradually reduced at 3，6 and 9 weeks in a time-dependent manner.Conclusion SIL can inhibit rat cardiac hypertrophy with enhancement of cardiac function and suppression of myocardial fibrosis at different time points，which may be associated with inhibition of embryonic tissue gene ANP re-activation.

Sildenafil；cardiac hypertrophy；Wistar rats；ANP

R965；R543.1

A

1006-8783（2016）04-0475-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051801

2016-05-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31400798）；2015年度廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（FJ2015004）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（2015ZZ121）

王阿慧（1991—），女，2013級(jí)碩士研究生，Email:791573406@qq.com；通信作者:金亞，女，副教授，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)研究，Email:yajin@scut.edu.cn；譚文，男，教授，主要從事醫(yī)藥生物學(xué)研究，Email:went@scut.edu.cn。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-04 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160704.1541.006.html