尤琪，張卉寧，黎昆東，張巨峰（廣東藥科大學(xué).中藥學(xué)院；.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州50006）

雙氫青蒿素促胃癌細胞凋亡的作用

尤琪1，張卉寧2，黎昆東2，張巨峰2
（廣東藥科大學(xué)1.中藥學(xué)院；2.生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的研究雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）對人胃癌細胞 （SGC-7901、HGC-27）生長抑制和促凋亡的作用。方法用WST-1方法檢測DHA處理后的胃癌細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡情況，細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。結(jié)果 不同濃度的DHA可以抑制胃癌細胞（SGC-7901、HGC-27）的增殖，且呈現(xiàn)濃度依賴性增長趨勢。DHA作用48 h后，胃癌細胞的周期阻滯在S期，同時有誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的作用；DHA作用24 h和48 h后，對胃癌細胞的遷移能力有抑制作用。結(jié)論DHA可有效地抑制胃癌細胞的增殖，并促進其凋亡。

雙氫青蒿素；胃癌細胞；細胞增殖；細胞凋亡

根據(jù)2013年“全球癌癥負擔(dān)系列研究”統(tǒng)計的癌癥數(shù)據(jù)顯示，在中國，胃癌的發(fā)病率26.84%，死亡率23.55%，均高于全球水平，分別位居腫瘤發(fā)病率的第2位、死亡率的第3位［1］。目前，治療胃癌以手術(shù)并結(jié)合藥物化療為主，但較高的復(fù)發(fā)率以及化療藥物引起的并發(fā)癥等缺點［2］，使多靶點治療、毒副作用較小的中藥及其單體成為潛在的抗腫瘤藥物［3-4］。青蒿素是中藥植物青蒿中提取的環(huán)狀倍半萜類化合物，具有良好的抗惡性瘧疾作用，由于難溶于水，影響了其療效的發(fā)揮，因此合成了抗瘧效價高、速效、低毒的青蒿素衍生物——雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）。近年來發(fā)現(xiàn)，DHA對肝癌、宮頸癌、骨肉瘤等腫瘤細胞的生長有明顯的抑制作用［5-8］，但關(guān)于胃癌細胞的研究尚未報道。本實驗以人胃癌細胞系作為研究對象，研究DHA抑制胃癌細胞增殖的作用，為中藥抗腫瘤藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑

雙氫青蒿素（奧倫生物公司）；Opti-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（Life TechnologiesTM公司）；0.25%胰酶溶液（美國Technologies公司）；PBS磷酸緩沖液（美國ThermoFisher公司）；WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天公司）。

1.2方法

1.2.1WST-1實驗 取對數(shù)生長期的胃癌細胞，調(diào)整細胞的濃度為105/mL，取100 μL接種于96孔板。細胞貼壁后，加入不同濃度的DHA（0.78、1.56、3.13、6.25、12.50 μmol/L），每個濃度設(shè)4個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL WST-1溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h，測定450 nm處的各孔吸光值 （A值）。按照公式，抑制率=1-×100%，計算細胞增殖抑制率。繪制以濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標的細胞增殖抑制圖。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞周期 采用PI染色法檢測細胞周期，取胃癌細胞3×105/孔接種于6孔板中，設(shè)未處理的胃癌細胞為對照組，經(jīng)過DHA處理的作為處理組。分別以DHA濃度為6.25 μmol/L的作用于SGC-7901細胞，濃度為1.56 μmol/L的作用于HGC-27細胞，經(jīng)過48 h處理后，收集細胞，用PBS洗滌細胞3次，加入預(yù)冷的70%（φ）乙醇，4℃固定過夜，加入PBS洗滌2次，棄上清后每管加入PI工作液，混勻細胞，然后在室溫下避光孵育30 min后上流式細胞儀檢測。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡 取胃癌細胞3× 105/孔接種于6孔板中，分別設(shè)置對照組和處理組，作用于細胞48 h后，收集細胞于流式管中，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育10～20 min，上流式細胞儀進行檢測。

1.2.4劃痕實驗 用記號筆在6孔板背后用直尺均勻地劃橫線，每條線相隔約0.5～1 cm，橫穿過每孔。其中每孔至少穿過5條線。取對數(shù)生長期的胃癌細胞，調(diào)整細胞濃度3×105/mL，以每孔2 mL的接種量接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加入DHA后分別培養(yǎng)24 h、48 h，在顯微鏡下觀察細胞遷移情況。采用軟件Image-Pro Plus測量細胞劃痕的距離，劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-12 h或24 h劃痕寬度）/ 0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DHA對胃癌SGC-7901、HGC-27細胞增殖的抑制作用

與對照組相比，DHA能顯著抑制胃癌細胞SGC-7901、HGC-27細胞的生長，且隨著藥物濃度的增加，具有明顯的劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01）。DHA對SGC-7901、HGC-27細胞的生長抑制曲線見圖1、圖2。

圖1　DHA對SGC-7901細胞增殖的抑制作用Figure 1 Effect of DHA on SGC-7901 cell growth

圖2　DHA對HGC-27細胞增殖的抑制作用Figure 2 Effect of DHA on HGC-27 cell growth

2.2DHA對胃癌SGC-7901、HGC-27細胞周期的影響

與對照組相比，DHA作用48 h后，SGC-7901和HGC-27細胞的S期比例增加，分別增加了22.66%、9.03%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果表明，DHA可促使SGC-7901和 HGC-27細胞阻滯在S期。見圖3、4。

圖3　流式細胞儀檢測DHA對SGC-7901細胞周期的影響Figure 3 Effect of DHA on cell cycle of SGC-7901 cells by FCM

圖4　流式細胞儀檢測DHA對HGC-27細胞周期的影響Figure 4 Effect of DHA on cell cycle of HGC-27 cells by FCM

2.3DHA對胃癌SGC-7901、HGC-27細胞凋亡的影響

經(jīng)過48 h的DHA處理后，與對照組相比，SGC-7901細胞凋亡細胞增加了7.59%，HGC-27細胞凋亡增加了12.65%，提示DHA對胃癌細胞具有明顯的凋亡作用（P＜0.01）。

圖5　流式細胞儀檢測DHA對SGC-7901細胞凋亡的影響Figure 5 Effect of DHA on cell apoptosis in SGC-7901 cells by FCM

圖6　流式細胞儀檢測DHA對HGC-27細胞凋亡的影響Figure 6 Effect of DHA on cell apoptosis in HGC-27 cells by FCM

2.4DHA對胃癌SGC-7901、HGC-27細胞遷移的影響

與對照組相比，DHA分別作用24、48 h后，SGC-7901和HGC-27細胞的愈合速度明顯變慢（P＜0.05）。結(jié)果表明，DHA能明顯降低SGC-7901和HGC-27細胞遷移能力，見表1。

表1　DHA對胃癌細胞遷移能力的影響Table 1 Effect of DHA on the migration of gastric cancer cells （s，%）

表1　DHA對胃癌細胞遷移能力的影響Table 1 Effect of DHA on the migration of gastric cancer cells （s，%）

與對照組比較:*P＜0.05。

組別　24 h 48 h SGC-7901　HGC-27SGC-7901　HGC-27對照組　32.09±0.1　25.81±2.1　65.19±2.7　63.61±2.1處理組　17.22±2.2*16.25±1.9*36.78±1.9*32.68±1.5*

3　討論

DHA是青蒿素類衍生物，被世界衛(wèi)生組織推選為一線強效治療惡性瘧疾的藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，DHA具有抗腫瘤、抗炎、增強免疫力等作用，特別在抗腫瘤的作用中，具有多靶點、多通路、對正常細胞毒副作用小等優(yōu)點［9-10］，為其臨床應(yīng)用開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

癌癥發(fā)生的實質(zhì)是細胞周期調(diào)控的紊亂，使機體細胞無間斷的進入細胞周期，失去自主凋亡能力，惡性增殖失控的結(jié)果。因此抑制胃癌細胞增殖，并促使細胞凋亡是治療胃癌的重要方面。本研究提示DHA可以明顯抑制胃癌細胞的增殖，且呈濃度依賴性趨勢，說明DHA對不同分化程度的胃癌細胞均具有抑制增殖的作用。當(dāng)DHA濃度為6.25 μmol/L時，中分化SGC-7901細胞的抑制率是44.07%，而低分化HGC-27細胞的抑制率達到了63.64%，提示不同分化程度的胃癌細胞對相同濃度的DHA的敏感度也不同。

相關(guān)文獻［14-17］表明，Bcl-2基因是一種原癌基因，其參與了胃癌細胞分化的過程，在不同分化程度的胃癌組織中均高表達，且在高分化胃癌組織中的表達明顯高于低分化胃癌組織，從而提高了胃癌的發(fā)病率。本實驗中，DHA可以使胃癌細胞的周期進程阻滯在S期，并且誘導(dǎo)胃癌細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，說明DHA可以通過延長細胞周期并促使細胞發(fā)生凋亡的方式，達到減緩細胞增殖的目的。但DHA促使胃癌細胞凋亡的具體作用機制是否與調(diào)控Bcl-2蛋白表達有關(guān)還需進一步的深入研究。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

Effect of dihydroartemisinin on the apoptosis of gastric cancer cells

YOU Qi1，ZHANG Huining2，LI Kundong2，ZHANG Jufeng2
（1.School of Traditionnal Chinese Medicine；2.School of Life Science&Biopharmacology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To investigate the growth inhibitory and apoptosis effects of DHA on gastric cancer cells.Methods The proliferation of gastric cancer cells was detected using WST-1.The cell cycle progression and cell apoptosis were determined by flow cytometry.The cell migration ability was detected by wound-healing assay.Results The different concentrations of DHA inhibited the proliferation of gastric cancer cells（SGC-7901，HGC-27）in a concentration-dependent manner.DHA arrested the cell cycle of gastric cancer cells at S phase and promoted the apoptosis of gastric cancer cells at 48 h.After treatment with DHA for 24 h and 48 h，the metastasis ability of gastric cancer cells were declined.Conclusion DHA can effectively inhibit the proliferation of gastric cancer cells and promote cell apoptosis.

DHA；gastric cancer cells；proliferation；apoptosis

R735.2

A

1006-8783（2016）04-0466-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050301

2016-05-03

國家自然科學(xué)基金項目（81171447）；廣東省科技計劃項目（2014A020212303）；廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項資金項目（pdjh2016b0262）

尤琪（1993—），女，2014級中藥學(xué)專碩研究生；通信作者:張巨峰（1973—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤基因治療和分子標記物篩選的研究，Email:jfzhanglll@163.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-08 14:52 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160708.1452.003.html