林麗君，鐘燕珠，雷旭，區(qū)炳雄，林華（.深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 5800；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州500）

HPLC-ELSD法測(cè)定西藏林芝地區(qū)野生瓦布貝母中3種生物堿的含量

林麗君1，鐘燕珠2，雷旭2，區(qū)炳雄2，林華2
（1.深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518001；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州510120）

目的以貝母辛、西貝母堿、貝母素乙3種生物堿成分為指標(biāo)，考察西藏林芝地區(qū)不同產(chǎn)地野生瓦布貝母的品質(zhì)情況，為今后林芝地區(qū)川貝母人工種植種質(zhì)選育奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法采用HPLC-ELSD法，色譜柱為Welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%（體積分?jǐn)?shù)）二乙胺（體積比70∶30），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。結(jié)果林芝地區(qū)6批野生瓦布貝母中的貝母辛、西貝母堿和貝母素乙質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是川貝母對(duì)照藥材的1.79～2.70倍、2.13～3.64倍和1.88～2.37倍。結(jié)論林芝地區(qū)的野生瓦布貝母品質(zhì)較好，可作為人工種植育種的種質(zhì)來源。

林芝地區(qū)；瓦布貝母；生物堿

川貝母為百合科（Liliaceae）貝母屬（Fritillaria）川貝母等6種植物的干燥鱗莖，為清熱潤(rùn)肺、祛痰止咳良藥，供臨床配方和中成藥生產(chǎn)，需求量巨大，但藥材來源所依賴的野生資源嚴(yán)重不足，供需矛盾日益突出，價(jià)格迅速攀升。對(duì)川貝母野生藥材的過度采收已導(dǎo)致其資源日漸枯竭，現(xiàn)已被列入國(guó)家3級(jí)保護(hù)植物名單。為緩解供需矛盾和有效保護(hù)野生資源，藥學(xué)工作者在人工種植川貝母方面做了較多有益的探索［1-2］。經(jīng)筆者對(duì)西藏林芝地區(qū)實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)有一定量的野生川貝母（瓦布貝母）分布，表明其具備種植川貝母的地理環(huán)境和氣候。瓦布貝母是自2010年版《中國(guó)藥典》開始新增收的川貝母來源之一，且總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高［3］?，F(xiàn)代研究表明，川貝母中主要活性成分生物堿類化合物藥理作用廣泛，其中西貝母堿在貝母類生物堿中止咳作用最強(qiáng)［4-5］，因此筆者以川貝母生物堿類成分中共有的、具代表性的有效成分貝母辛、西貝母堿、貝母素乙質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用 HPLC-ELSD法［6-8］考察林芝市不同縣區(qū)野生瓦布貝母的品質(zhì)，為其能否作為人工種植種質(zhì)選育來源提供試驗(yàn)依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器

LC-20AT Prominence高效液相色譜儀，包括LC-20AT二元泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、Varian380-LC蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、LCsolution色譜工作站（日本島津公司），Sartorius CP225D分析天平（德國(guó)賽多利斯公司，十萬分之一），SG8200HE型超聲清洗儀（上海冠特超聲儀器有限公司，頻率40 kHz、功率600 W）。

1.2試藥

川貝母對(duì)照藥材（批號(hào)121000-201108、中國(guó)食品藥品檢定研究院），西貝母堿對(duì)照品（批號(hào)X-021-150320、質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%、成都瑞芬思生物科技有限公司），貝母辛對(duì)照品（批號(hào)111892-201402、質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.9%、中國(guó)食品藥品檢定研究院），貝母素乙對(duì)照品（批號(hào)PD151113-04、質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.9%、Stanford Analytical Chemicals Inc），乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

實(shí)驗(yàn)所用1號(hào)樣品為從中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)得的川貝母對(duì)照藥材，2～7號(hào)川貝母樣品采自西藏林芝市不同縣區(qū)，由筆者親自或委托他人向當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)收購(gòu)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)譚樹輝副教授鑒定為瓦布貝母 Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C. Hsia var.wabuensis（S.Y.Tang et S.C.Yue）Z.D. Liu，S.Wang et S.C.Chen的干燥鱗莖，8～10號(hào)樣品由藥材生產(chǎn)加工企業(yè)提供，經(jīng)譚樹輝副教授鑒定為川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don的干燥鱗莖。樣品詳細(xì)信息見表1。

表1　川貝母對(duì)照藥材及9批樣品的詳細(xì)信息表Table 1 The detailed information table of reference Bulbus F. Cirrhosae and 9 batches of samples

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱:Welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相:乙腈-0.1%（體積分?jǐn)?shù)）二乙胺（體積比70∶30），流速:1.0 mL/min，柱溫:30℃；采用ELSD檢測(cè)，漂移管溫度:45℃，載氣壓力:1.65× 105Pa，進(jìn)樣量:20 μL，以貝母辛質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算理論塔板數(shù)不低于2 000。在上述色譜條件下，混合對(duì)照品儲(chǔ)備液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液中的貝母辛、西貝母堿和貝母素乙均能得到良好分離。見圖1。

2.2混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

分別精密稱取貝母辛、西貝母堿和貝母素乙對(duì)照品9.90、9.92、9.95 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.198 0、0.198 4、0.199 0 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3供試品、對(duì)照藥材溶液的制備

將表1中瓦布貝母和企業(yè)提供的川貝母樣品粉碎過80目篩，分別取2 g，精密稱定，置于50 mL離心管中，加濃氨水4 mL浸潤(rùn)1 h，加入三氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）混合液40 mL，超聲1 h，4 400 r/min離心10 min，除去氨水后濾過。濾液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，作為供試品溶液。取川貝母對(duì)照藥材2 g，精密稱定，按上述方法制備對(duì)照藥材溶液。

圖1　混合對(duì)照品（A）、川貝母對(duì)照藥材（B）與瓦布貝母供試品（C）溶液的HPLC-ELSD色譜圖Figure 1 The HPLC-ELSD chromatogram of mixed reference substances（A），Bulbus F.Cirrhosae（B）and Bulbus Fritillariae wabuensis（C）

2.4線性關(guān)系的考察

分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.8、1.2、1.8、3.0、6.0 mL，置10 mL容量瓶中，分別補(bǔ)加甲醇至10.0 mL，制得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取各質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄峰面積。以峰面積的對(duì)數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得到貝母辛、西貝母堿、貝母素乙的回歸方程:Y1=1.262 4X1+13.827 2，r1=0.999 9；Y2=1.275 5X2+13.548 2，r2=0.999 9；Y3=1.303 3X3+13.367 6，r3= 0.999 6。結(jié)果表明，三者分別在7.920～118.800、7.936～119.040、7.960～119.400 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液（貝母辛、西貝母堿和貝母素乙質(zhì)量濃度分別為23.760、23.808、 23.880 μg/mL）20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各成分的峰面積，連續(xù)測(cè)定6次，得貝母辛、西貝母堿和貝母素乙峰面積的RSD值分別為0.93%、0.87%、1.04%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2號(hào)供試品溶液20 μL，分別于制備0、2、4、8、12、24 h后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各成分峰面積，結(jié)果得貝母辛、西貝母堿和貝母素乙峰面積的RSD值分別為1.72%、1.22%、1.51%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取2號(hào)瓦布貝母供試品6份，每份2 g，精密稱定，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各成分峰面積，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果樣品中貝母辛、西貝母堿和貝母素乙三者的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)和 RSD值分別為0.015 9%、1.37%，0.027 6%、1.10%，0.015 4%、1.62%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知貝母辛、西貝母堿和貝母素乙3種生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)（分別為0.015 9%、0.015 1%、0.015 4%）的2號(hào)供試品6份，每份2 g，精密稱定，分別精密加入3種生物堿對(duì)照品適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2～表4。

2.9樣品的測(cè)定

分別取表1中川貝母對(duì)照藥材及9批樣品2 g，精密稱定，分別按取“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定貝母辛、西貝母堿和貝母素乙的峰面積，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表5。

表2　瓦布貝母中貝母辛的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 　Recovery results of peimisine in wild Bulbus F. wabuensis（n=6）

表3　瓦布貝母中西貝母堿的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 　Recovery results of sipeimine in wild Bulbus F.wabuensis（n=6）

表4　瓦布貝母中貝母素乙的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery results of peiminine of wild Bulbus F.wabuensis（n=6）

表5　川貝母對(duì)照藥材及9批樣品中3種生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 　Determination results of three alkaloids in the reference of Bulbus F.Cirrhosae and 9 batches of samples （s，n=3）　w/%

表5　川貝母對(duì)照藥材及9批樣品中3種生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 　Determination results of three alkaloids in the reference of Bulbus F.Cirrhosae and 9 batches of samples （s，n=3）　w/%

樣品編號(hào)　　貝母辛　　西貝母堿　　貝母素乙1　0.008 7±0.000 2 0.006 9±0.000 2　0.008 2±0.000 2 2　0.015 9±0.000 3 0.015 1±0.000 2　0.015 4±0.000 3 3　0.015 6±0.000 3 0.014 7±0.000 1　0.015 7±0.000 3 4　0.020 4±0.000 2 0.019 5±0.000 4　0.017 5±0.000 3 5　0.021 1±0.000 4 0.020 8±0.000 3　0.017 7±0.000 2 6　0.023 5±0.000 3 0.025 1±0.000 4　0.019 4±0.000 4 7　0.019 9±0.000 3 0.022 1±0.000 3　0.019 1±0.000 3 8　0.006 9±0.000 3 0.005 7±0.000 2　0.007 6±0.000 1 9　0.006 5±0.000 3 0.005 6±0.000 1　0.007 3±0.000 2 10　0.007 3±0.000 2 0.006 2±0.000 2　0.007 7±0.000 1

3　討論

6批西藏林芝地區(qū)野生瓦布貝母中貝母辛、西貝母堿和貝母素乙的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于川貝母對(duì)照藥材，分別是其1.79～2.70倍、2.13～3.64倍和1.88～2.37倍，其中采自巴宜區(qū)的6號(hào)樣品中3種生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最高。

在對(duì)林芝地區(qū)野生瓦布貝母進(jìn)行質(zhì)量考察的同時(shí)，筆者隨機(jī)選擇了廣東3家藥材生產(chǎn)加工企業(yè)的川貝母藥材進(jìn)行對(duì)比研究，其貝母辛、西貝母堿和貝母素乙質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于川貝母對(duì)照藥材，并遠(yuǎn)低于林芝地區(qū)產(chǎn)瓦布貝母，均在其相應(yīng)值的50%以下。

瓦布貝母與川貝母的優(yōu)質(zhì)來源品種暗紫貝母親緣關(guān)系很近［9］，且植株更高大，有利于其主要活性物質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物生物堿類成分的積累。西藏林芝地區(qū)野生瓦布貝母中3種生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果與對(duì)照藥材、3家企業(yè)產(chǎn)品相應(yīng)值相比較的結(jié)果表明前者品質(zhì)較好，提示可從中篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的瓦布貝母品種，作為開展人工種植育種的種質(zhì)來源。

［1］向麗，韓建萍，陳士林.人工栽培川貝母種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2011，4（2）:91-94.

［2］鄧小紅，侯盛昌.川貝母栽培技術(shù)初步研究［J］.四川林業(yè)科技，2014，35（3）:54-58.

［3］張培培，周勤梅，秦波，等.川貝母栽培品瓦布貝母與松貝母的總生物堿對(duì)比研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（1）:70-72.

［4］顏曉燕，彭成.川貝母藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2011，22（31）:2963-2965.

［5］CHAN Shunwan.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)測(cè)定川貝母中主要鎮(zhèn)咳生物活性成分西貝母堿及其在鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.國(guó)外分析儀器，2001（4）:47-48.

［6］黃林芳，陳士林，劉輝，等.HPLC-ELSD測(cè)定不同加工方法川貝母中3種生物堿［J］.中成藥，2009，31（10）: 1560-1564.

［7］劉晶，王曙，辛貴忠，等.HPLC-ELSD測(cè)定太白貝母和瓦布貝母中貝母辛的含量［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45 （13）:1032-1034.

［8］劉薇，張文娟，穆顯隆，等.中藥川貝母質(zhì)量控制方法研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（2）:41-46.

［9］毛艷蘋，趙高瓊，蘇玉萍，等.川產(chǎn)貝母新資源瓦布貝母研究進(jìn)展［J］.中藥與臨床，2014，5（3）:53-55.

（責(zé)任編輯：劉曉涵）

Determination on three alkaloids of wild Bulbus Fritillariae wabuensis in Nyingchi Prefecture of Tibet by HPLC-ELSD

LIN Lijun1，ZHONG Yanzhu2，LEI Xu2，OU Bingxiong2，LIN Hua2
（1.Shenzhen Luohu District Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518001，China；2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China）

Objective To investigate the general quality of wild Bulbus Fritillariae wabuensis from different places of origin in Nyingchi Prefecture，Tibet Autonomous Region，with three alkaloids′contents as the indicator，in order to lay the experimental basis for germplasm selection and breeding of future artificial cultivation of F.wabuensis in Nyingchi Prefecture.Methods A high performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detector was employed upon an Welch Ultimate AQ-C18column （4.6 mm×250 mm，5 μm），with acetonitrile-water containing 0.1%diethylamine（70∶30）as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min.Results The contents of peimisine，sipeimine，peiminine in wild Bulbus F.wabuensis from Nyingchi Prefecture were 1.79 to 2.70 times，2.13 to 3.64 times，1.88 to 2.37 times more than those in the reference of Bulbus Fritillariae Cirrhosae.Conclusion Wild Bulbus F. wabuensis from Nyingchi Prefecture of Tibet could be used as a source of germplasm for breeding in artificial cultivation.

Nyingchi Prefecture；F.wabuensis；alkaloids

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0458-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016053102

2016-05-31

廣東省科技基礎(chǔ)條件建設(shè)項(xiàng)目（2013B060400021）

林麗君（1981—），女，學(xué)士，主管中藥師，主要從事中藥鑒別研究，電話:0755-82311633，Email:11512900@qq.com；通信作者:鐘燕珠（1976—），女，碩士，主任中藥師，主要從事中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣品質(zhì)評(píng)價(jià)研究，電話:020-81887233-36702，Email:duduzyz@sohu.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-011 15:00 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1500.007.html