林勤，徐文雅，董斌，陳艷芬，趙越（廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006）

響應面法優(yōu)化類球紅細菌中輔酶Q10超聲提取工藝

林勤，徐文雅，董斌，陳艷芬，趙越
（廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006）

目的優(yōu)選類球紅細菌中輔酶Q10的最佳超聲提取工藝。方法采用HPLC法測定輔酶Q10質量濃度，以菌體中輔酶Q10的質量濃度作為響應值，在單因素試驗基礎上，選擇超聲波輸出功率、超聲波每次提取時間和超聲波每次輻射時間這3個因素進行響應面試驗設計。結果類球紅細菌中輔酶Q10的最佳超聲提取工藝條件為:超聲波輸出功率為250 W，超聲波每次提取時間為10 min，超聲波每次輻射時間為8 s。在該條件下，輔酶Q10質量濃度的預測值為11.535 1 μg/mL，實測平均值為11.451 8 μg/mL。結論本文所得工藝方法切實可行，為類球紅細菌發(fā)酵生產輔酶Q10的進一步研究提供參考。

類球紅細菌；輔酶Q10；提取工藝；響應面法

輔酶Q10廣泛存在于自然界，是細胞呼吸鏈上的一種遞氫體［1］。輔酶 Q10具有長的異戊二烯側鏈，易溶于正己烷、三氯甲烷、苯、四氯化碳，溶于丙酮、石油醚及乙醚，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇，在光照下易分解呈微紅色，對溫度和濕度較穩(wěn)定［2］。輔酶Q10具有治療充血性心力衰竭［3］、降壓［4］、抗腫瘤、保護心血管等功效，還作為抗氧化劑用于化妝品中以延緩皮膚衰老［5-7］。

目前，輔酶Q10的提取制備普遍采用醇堿皂化法和有機溶劑萃取法［8］，但這些傳統(tǒng)提取方法對于輔酶Q10的損失較大。輔酶Q10在生物體內通過醌環(huán)亞層電子的范德華力相連［9］，超聲波破碎法提取類球紅細菌菌體的輔酶Q10，是利用聲波高加速度、加速介質質點運動和空化效應，可提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率，促進目的產物進入溶劑。

本文參考李德和等［10］采用HPLC法測定類球紅細菌中輔酶Q10質量濃度的方法，以丙酮作為提取溶劑，超聲破碎輔助提取輔酶Q10，并進一步采用Box-Behnken響應面試驗設計方法［11-13］優(yōu)化超聲提取工藝。在優(yōu)化過程中，以輔酶Q10質量濃度為指標響應值，選取超聲波輸出功率、超聲波每次提取時間和超聲波每次輻射時間這3個影響因素用于考察輔酶Q10的最佳提取工藝，克服了正交試驗只能對孤立點進行分析而不能給出直觀圖形的缺點，為類球紅細菌發(fā)酵生產輔酶Q10提供參考［14］。

1　儀器與材料

BP-211D 211D電子天平（德國Sartorius公司）；AY-120電子天平（日本Shimadzu公司）；3-30KS離心機（德國Sigma公司）；SCIENTZ-II D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝超聲儀器有限公司）；RV10 basic旋轉蒸發(fā)儀（德國IKAIKA公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；DLSO-5/20低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長城科工貿有限公司）；UV-2450紫外-可見分光度計（日本島津公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；DIKMA platisil ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（天津迪馬公司）；MJ-78A高壓滅菌鍋（美國Stik公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；RXZ人工氣候箱（寧波江南儀器廠）。

類球紅細菌（編號:1.2174，中國科學院微生物研究所）；輔酶Q10對照品（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，瑞典Oceanpak公司）；水為屈臣氏蒸餾水；酵母膏為國產生物純；其余試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1HPLC法測定類球紅細菌中輔酶 Q10質量濃度［10］

2.1.1色譜條件 色譜柱:DIKMA Platisil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相:甲醇-無水乙醇（體積比20∶80），檢測波長:275 nm，柱溫:35℃，進樣體積:10 μL，流速:1 mL/min。

2.1.2標準曲線的繪制 精密稱取輔酶Q10對照品1.6 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻得到32.0 μg/mL的對照品溶液。精密吸取0.5、1、3、5、7、10 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻分別得到1.6、3.2、9.6、16、22.4、32.0 μg/mL的對照品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣10 μL，以峰面積（A）對質量濃度（ρ）作線性回歸，得回歸方程A=4 240.3ρ+172 01，R2=0.999 7（n=6），表明輔酶Q10質量濃度在1.6～32.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.3供試品溶液的制備

2.1.3.1 菌種的擴大培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方:無水乙酸鈉3.0 g，（NH4）2SO41.0 g，酵母膏2.0 g，CaCl20.05 g，MgSO40.2 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.7 g，微量元素液4 mL，維生素液1 mL，純化水1 000 mL。類球紅細菌培養(yǎng)液的配制:配制1 000 mL培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，接入對數(shù)期菌種，于實驗室人工氣候箱中培養(yǎng)6 d，即得。

2.1.3.2 類球紅細菌中輔酶Q10的提取［10］取類球紅細菌培養(yǎng)液50 mL，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，獲得的菌體用生理鹽水洗滌2次，以此獲得濕菌體，然后加入丙酮10 mL充分混勻，避光超聲破碎輔助提取10 min，3 000 r/min離心收集上清液，殘渣重復2次，合并3次上清液于旋轉蒸發(fā)儀蒸干，加無水乙醇定容至10 mL。

2.1.4專屬性考察［15］選用“2.1.2”項下質量濃度為16 μg/mL的輔酶Q10對照品溶液及“2.1.3.2”項下供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，進樣10 μL進行分析。結果，輔酶Q10與相鄰峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按輔酶Q10計不小于5 000。色譜圖見圖1。

圖1　輔酶Q10對照品（A）和樣品（B）的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC Chromatograms of CoQ10control（A）and samples（B）

2.1.5 方法學考察 取“2.1.3.2”項下供試品溶液10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得輔酶Q10的峰面積RSD為1.13%，表明儀器精密度良好。然后，再分別于2、4、6、8、12、24 h進樣，在相同條件下測得輔酶Q10峰面積RSD為0.95%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。取同一批類球紅細菌輔酶Q10提取液，在“2.1.1”項色譜條件下測定，測得平均質量濃度為3.466 μg/mL，RSD為0.62%。加樣回收率試驗測得輔酶Q10平均回收率為99.18%，RSD為3.41%，表明方法準確可靠。

2.2響應面法試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取超聲波輸出功率、每次提取時間和每次輻射時間為考察因素，以輔酶Q10質量濃度為響應值（Y），采用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設計原理設計3因素3水平的響應面試驗，共有17個試驗，其中12個為析因試驗，另外5個為中心試驗，用于估算誤差，見表1～表2。

表1　響應面法試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface

2.3建立模型及顯著性檢驗

采用Design-Expert 8.0.6響應面軟件，對表2中17個輔酶Q10質量濃度的數(shù)據(jù)進行線性回歸擬合，得到二次多項回歸方程Y=-11.968 41+2.675 94X1+ 0.021 312 X2+0.623 89X3-0.003 127 5X1X2-0.091 146X1X3+0.006 7487 5X2X3-0.059 218X1

2-0.000 022 885X22-0.072 053，然后進行方差分析，結果見表3。可見，模型達到了極顯著水平（P＜0.001），即各因素與響應值之間的關系非常顯著，失擬項也顯著（P＜0.05）；相關系數(shù)R2=0.961 4，校正相關系數(shù)R2Adj=0.911 7，說明數(shù)據(jù)具有一定可靠性；信噪比16.780＞4，可知回歸方程的擬合度和可信度均較高。綜上所述，該回歸方程能很好地對響應值進行預測。

表2　響應面試驗設計方案及結果Table 2 　Design scheme and results of response surface experiment

表3　模型方差分析Table 3 ANOVA of model

2.4響應曲面的分析

采用Design-EXpert 8.0.6響應面軟件，分析超聲波每次提取時間、超聲波輸出功率和超聲波每次輻射時間之間的交互作用對輔酶Q10質量濃度的影響，分別得到相互因素的二次多項回歸方程:當去掉回歸系數(shù)X3時，Y=-11.425 76+2.169 52X1+0.064 231X2-0.003 127 5X1X2-0.060-0.000 028 952；當去掉回歸系數(shù) X1時，Y=+ 10.689 82-0.011 730X2-0.385 71X3+0.006 748 75X2X3-0.000 034 105-0.079 066；當去掉回歸系數(shù)X2時，Y=-8.720 88+2.058 47X1+1.982 67X3-0.091 146X1X3-0.059-0.072 806。根據(jù)以上方程繪制響應曲面圖見圖2?？梢姡陨?種因素對輔酶Q10質量濃度的影響次序為超聲波輸出功率（X2）＞超聲波每次提取時間（X1）＞超聲波每次輻射時間（X3），這與表3的方差分析結果相符。

圖2　各因素交互作用的響應曲面圖Figure 2 Response surface analysis of the interaction of each factor

2.5輔酶Q10最佳提取工藝

利用Design-expert 8.0.6模擬得出的類球紅細菌中輔酶Q10最優(yōu)提取工藝為超聲波輸出功率250 W、超聲波每次提取時間9.84 min和超聲波每次輻射時間 8 s。所得輔酶 Q10質量濃度的預測值為11.535 1 μg/mL。為了驗證響應面法結果的可靠性，從實際生產出發(fā)，設定超聲波輸出功率250 W、超聲波每次提取時間10 min和超聲波每次輻射時間8 s，在此條件下進行3次平行驗證試驗，得到的輔酶Q10質量濃度實際平均值為11.451 8 μg/mL，RSD為0.896%。實際值與預測值相比誤差僅為0.724 8%，相差較小，說明模型是可行的，響應面法優(yōu)化得到的輔酶Q10提取工藝具有實際生產價值。

3　討論

本試驗前期選取了超聲波輸出功率（100、150、200、250、300 W）、超聲波每次提取時間（6、9、12、15、18 min）和超聲波每次輻射時間（2、4、6、8、9.9 s）這3個因素進行單因素試驗。單因素試驗結果顯示，各因素的最佳范圍為:超聲波輸出功率150～250 W，超聲波每次提取時間9～15 min，超聲波每次輻射時間4～8 s。使用響應曲面法建立數(shù)學模型，利用模型的響應曲面圖得到優(yōu)化的工藝條件為:超聲波輸出功率250 W、超聲波每次提取時間9.84 min和超聲波每次輻射時間8 s，在此條件下，輔酶Q10質量濃度的理論值為11.535 1 μg/mL，均高于工藝優(yōu)化前（8.712 60 μg/mL）及文獻［10］報道的5.914 μg/mL。

響應面試驗結果顯示，超聲波輸出功率與超聲波每次提取時間顯著影響輔酶Q10的提取率，經二次多項回歸模型，得到了最佳提取工藝，且實測值與預測值吻合，說明了Box-Benhnken的中心組合試驗設計具有良好的可行性，并且響應面法能較好地對類球紅細菌中輔酶Q10的超聲提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，也為利用類球紅細菌生物轉化斑蝥獲得抗氧化效果更顯著的保健品研究奠定了基礎。

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（責任編輯：陳翔）

Optimization of extraction conditions for coenzyme Q10from Rhodobacter sphaeroides by surface response methodology

LIN Qin，XU Wenya，DONG Bin，CHEN Yanfen，ZHAO Yue
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the extraction conditions of coenzyme Q10from Rhodobacter sphaeroides by surface response methodology.Methods The concentration of coenzyme Q10was set as response value，based on single factor experiments，and the response surface methodology was used to study the effects of ultrasonic power，ultrasonic extraction time at a time and ultrasonic radiation time at a time on the extraction rate of coenzyme Q10.The content of coenzyme Q10was determined by HPLC.Results The optimal extraction conditions were as follows:ultrasonic power 250 W，ultrasonic extraction time at a time 10 min and ultrasonic radiation time at a time 8 s，under these conditions，the prediction value of coenzyme Q10was 11.535 1 μg/mL and the measured value was 11.451 8 μg/mL.Conclusion The experimental process is feasible，which can provide technical reference for the further research of coenzyme Q10in Rhodobacter sphaeroides.

Rhodobacter sphaeroides；coenzyme Q10；extraction；surface response methodology

R284.3

A

1006-8783（2016）04-0420-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041903

2016-04-19

國家自然科學基金項目（81374072）

林勤（1991—），女，2014級碩士研究生，Email:731987501@qq.com；通信作者:趙越（1955—），女，教授，從事中藥新劑型與新技術、中藥物質基礎和質量標準研究，Email:zybmbylk688@163.com。

網絡出版時間:2016-07-011 15:02 網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1502.008.html