陳艷琳，王穎芳（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

白花蛇舌草總RNA提取方法比較與優(yōu)化

陳艷琳，王穎芳
（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的探索白花蛇舌草總RNA最佳提取方法。方法以廣東產(chǎn)白花蛇舌草為材料，選用Trizol法、多糖多酚總RNA提取試劑盒（RNA prep Pure Plant Kit）、植物總RNA提取試劑盒、改良CTAB法、RNAiso Plus法提取蛇舌草根和葉總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及Aligent 2100檢測(cè)，比較5種提取方法所得總RNA的完整性、純度及產(chǎn)率。結(jié)果RNA prep Pure Plant Kit及植物總RNA提取試劑盒均能提取到總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S條帶清晰，前者亮度高于后者。RNA prep Pure Plant Kit中D（γ）260 nm/D（γ）280 nm和D（γ）260 nm/D（γ）230 nm值均在2.0左右，葉片組織RNA質(zhì)量濃度為390.35 mg/L，經(jīng)Aligent 2100檢測(cè)，28S條帶亮度是18S的2倍。改良CTAB法所得RNA 28S和18S條帶穩(wěn)定清晰，但受基因組污染嚴(yán)重。RNAiso Plus和Trizol法無(wú)法完成蛇舌草總RNA的提取。結(jié)論 不同植物、不同品種或同一植物不同部位皆存在屬性差異，要根據(jù)植物特性選擇合適的RNA提取方法。RNA prep Pure Plant Kit提取蛇舌草根、葉片RNA效果較優(yōu)，可滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

白花蛇舌草；總RNA；提取方法

白花蛇舌草最早載于《廣西中藥志》，來(lái)源于茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.，以干燥全草入藥［1］，別名蛇舌草、蛇刺草、羊須草等。本品性寒，味苦、甘，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛之功效，臨床應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理研究揭示白花蛇舌草具有抗菌消炎、抗腫瘤作用［2-3］。2015年版《中國(guó)藥典》只收載了白花蛇舌草的復(fù)方制劑，其原料藥材未收載在內(nèi)［4］，《廣西中藥志》等地方藥材標(biāo)準(zhǔn)僅簡(jiǎn)要介紹白花蛇舌草的理化鑒別及藥理作用。

隨著植物靶mRNA表達(dá)調(diào)控、small RNA差異表達(dá)及miRNAs等研究的進(jìn)展，對(duì)白花蛇舌草抗感染、抗腫瘤的研究已從傳統(tǒng)的藥用活性成分［5］、藥理機(jī)制等層面，向微觀調(diào)控表達(dá)方面轉(zhuǎn)化。制備質(zhì)量高、完整性佳的RNA是進(jìn)行RT-PCR、small RNA測(cè)序、靶基因預(yù)測(cè)等分子生物學(xué)研究的首要條件。蛇舌草富含多糖［6］及次生代謝產(chǎn)物，RNA的分離純化易受干擾，從而影響RNA提取的質(zhì)量和產(chǎn)量。本研究以蛇舌草根、葉片為材料，分別選用Trizol法、多糖多酚總RNA提取試劑盒（RNA prep Pure Plant Kit）、植物總 RNA提取試劑盒、改良 CTAB法、RNAiso Plus法提取蛇舌草根和葉組織RNA，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、Aligent 2100及TGem微量分光光度計(jì)檢測(cè)，以選擇適合白花蛇舌草組織總RNA的提取方法。

1　材料與儀器

1.1藥材

樣品于2015年9月采集于廣東藥科大學(xué)藥用植物園，由中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的全草。

將整株白花蛇舌草用純化水洗凈，置70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇中消毒1 min，滅菌水沖洗干凈，消毒紗布擦干水分，用刀將根部切成小段，放入凍存管經(jīng)液氮速凍，于-80℃保存。葉片進(jìn)行同樣的處理并保存。每次選取所需部位約100 mg備用。

1.2試劑

RNAiso Plus試劑（TaKaRa生物公司）；RNA prep Pure Plant Kit（北京天根生物公司）；植物總RNA提取試劑盒（北京天根生物公司）；CTAB（深圳基迪奧生物公司）；β-巰基乙醇（廣州鼎國(guó)生物公司）；酚仿試劑（廣州鼎國(guó)生物公司）；三氯甲烷、異戊醇等生化試劑及瓊脂糖凝膠電泳試劑均購(gòu)自上海生工生物公司。

1.3儀器

3-30K型號(hào)超低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma）；Gene Genius型全自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國(guó)Syngene公司）；BG-SUBMIDI型電泳槽（百晶儀器廠）；Aligent 2100（美國(guó)安捷倫公司）；TGem微量分光光度計(jì)（北京天根生物公司）。

2　方法

2.1總RNA提取

2.1.1改良 CTAB法［7］研缽用液氮預(yù)冷，從-80℃冰箱取蛇舌草根、葉各約100 mg，加液氮迅速研磨成粉。將粉末轉(zhuǎn)移至1.5 mL RNase free離心管中，加入CTAB 600 μL（臨用時(shí)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% β-巰基乙醇12 μL），混勻，65℃水浴20 min（期間振搖幾次）。加入等體積三氯甲烷-異戊醇（體積比24 ∶1），混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，加等體積的酚仿試劑（苯酚-三氯甲烷，體積比25 ∶24）混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上層水相，加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（體積比24∶1）混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液，加入等體積異丙醇，于-20℃沉淀1 h，4℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加75%乙醇（DEPC水配制）1 mL，洗滌沉淀，重復(fù)1次，4℃、12 000 r/min離心5 min。棄上清，4℃、8 500 r/min離心15 s，盡可能吸干乙醇，真空干燥2～4 min。加入DEPC水20～50 μL，室溫溶解，-80℃保存。

2.1.2Trizol法［8］研缽用液氮預(yù)冷，從-80℃冰箱取蛇舌草的根、葉各約100 mg，加液氮迅速研磨成粉，將粉末轉(zhuǎn)移至裝有1 mL Trizol Reagent的RNase free離心管中，混勻，冰上靜置5 min。加200 μL三氯甲烷（Trizol試劑的1/5），劇烈振蕩至溶液呈乳白色，冰上放置3 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清液，加入等體積異丙醇，混勻，冰上放置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入75%乙醇（DEPC水配制）1 mL，洗滌RNA，4℃、12 000 r/min離心10 min。吸盡乙醇，倒置EP管，干燥RNA，加入DEPC水20～40 μL使溶解，-80℃保存。

2.1.3RNAiso Plus法［9］研缽用液氮預(yù)冷，從-80℃冰箱取蛇舌草的根、葉各約100 mg，加液氮迅速研磨成粉，加適量的RNAiso Plus后勻漿，轉(zhuǎn)移至1 mL RNase free離心管中，混勻，室溫放置5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL RNase free離心管，加1/5 RNAiso Plus的三氯甲烷，劇烈振蕩至溶液呈現(xiàn)乳白色，室溫靜置3 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清液，加等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清。用等量的75%乙醇（DEPC水配制）洗滌RNA，4℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清。倒置EP管，干燥RNA，加入DEPC水20～40 μL使溶解，-80℃保存。

2.1.4RNA prep Pure Plant Kit試劑盒 RNA prep Pure Plant Kit試劑盒參照具體的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.1.5植物總RNA提取試劑盒法 植物總RNA提取試劑盒參照相應(yīng)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.2不同提取方法總RNA質(zhì)量檢測(cè)

2.2.1總RNA完整性檢測(cè) 取總RNA樣品3 μL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，150 V恒壓15 min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA條帶，并拍照記錄。

2.2.2總RNA純度檢測(cè) 取總RNA樣品8 μL，進(jìn)行TGem微量分光光度檢測(cè)，每次上樣1.5 μL，平行測(cè)5次，記錄總 RNA濃度、D（γ）260 nm/D（γ）280 nm、D（γ）260 nm/D（γ）230 nm，求平均值，并計(jì)算RSD值。

2.2.3Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè) 將RNA prep Pure Plant Kit試劑盒、CTAB法提取所得總RNA樣品分離純化后，Agilent 2100 Bioanalyzer上樣檢測(cè)總RNA質(zhì)量完整性，并構(gòu)建總RNA表達(dá)譜。

3　結(jié)果與分析

3.1瓊脂糖凝膠電泳總RNA完整性檢測(cè)

將不同提取方法所得RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，RNA prep Pure Plant Kit提取總RNA 的28S、18S條帶清晰穩(wěn)定，此方法幾乎消除了DNA、蛋白質(zhì)的污染，說(shuō)明此種方法所得蛇舌草根、葉片總RNA的質(zhì)量、完整性較佳。植物總RNA提取試劑盒提取得到的RNA條帶雖然穩(wěn)定，但2條主條帶亮度幾乎相等，說(shuō)明RNA存在部分降解，且產(chǎn)率低于RNA prep Pure Plant Kit。改良CTAB法提取蛇舌草根、葉片總RNA的28S、18S條帶雖完整，可見(jiàn)葉片組織RNA 28S條帶亮度約18S的2倍；但點(diǎn)樣孔與28S之間出現(xiàn)明亮條帶，說(shuō)明RNA受雜質(zhì)污染；且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明 RNA存在降解。RNAiso Plus法及Trizol試劑提取RNA結(jié)果不理想。

圖1　5種方法提取的蛇舌草根和葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 The results of five total RNA extraction methods by agarose gel electrophoresis（AGE）

3.2總RNA純度檢測(cè)

據(jù)文獻(xiàn)［10］報(bào)道，當(dāng)D（γ）260 nm/D（γ）280 nm比值在1.8～2.1，說(shuō)明提取的RNA不受蛋白質(zhì)或多糖雜質(zhì)污染，純度高、質(zhì)量佳；當(dāng)D（γ）260 nm/D（γ）230 nm比值低于或高于2.0～2.3，說(shuō)明RNA可能受降解、蛋白質(zhì)的干擾。

將上述不同方法提取到的蛇舌草根和葉總RNA在TGem微量分光光度計(jì)上檢測(cè)，RNA純度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取的根、葉片總 RNA的 D（γ）260 nm/D（γ）280 nm值分別為1.928、2.019，處于1.8～2.1范圍內(nèi)，說(shuō)明無(wú)蛋白質(zhì)或多糖污染，D（γ）260 nm/D（γ）230 nm值分別為1.94、1.937，接近2.0，說(shuō)明提取的RNA純度較高、無(wú)降解。雖然改良CTAB法提取的根、葉片總RNA的濃度和RNA prep Pure Plant Kit試劑盒相差無(wú)幾，但前者的 D（γ）260 nm/D（γ）280 nm比值明顯＜1.8，說(shuō)明所得RNA中存在蛋白質(zhì)或有機(jī)溶劑的污染。在葉片 RNA 中 D（γ）260 nm/D（γ）230 nm比值＞2.3，則RNA降解，這與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果相符。

表1　5種方法提取的蛇舌草根、葉片總RNA檢測(cè)結(jié)果Table 1 The production rate and quality of five total RNA extraction methods

為進(jìn)一步比較分析RNA prep Pure Plant Kit試劑盒和改良CTAB法提取RNA的質(zhì)量，篩選更適合蛇舌草總RNA提取的方法，將RNA prep Pure Plant Kit試劑盒和改良CTAB法提取得到的蛇舌草根、葉總RNA混合純化，進(jìn)行Agilent 2100質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)檢表達(dá)譜見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒表達(dá)譜顯示2條清晰完整的主峰，分別為28S和18S；改良CTAB提取RNA的表達(dá)譜可見(jiàn)多條不規(guī)則峰帶，無(wú)特征性的主峰。其余檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒所得RNA符合建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，而改良CTAB法所得RNA降解、含有雜質(zhì)較多，不符合建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。

3.3Agilent 2100質(zhì)檢

Agilent 2100生物分析儀可以微小樣品消耗量進(jìn)行檢測(cè)，最大限度地減少有害物質(zhì)的接觸，降低RNA酶污染。其采用的RIN值能夠直觀地反映總RNA降解程度，即使是微量的降解也很容易被檢測(cè)出來(lái)，使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，是目前最好的RNA質(zhì)量分析方法。

圖2　RNA prep Pure Plant Kit試劑盒（A）和改良CTAB法（B）提取蛇舌草總RNA Agligent 2100檢測(cè)結(jié)果Figure 2 The results of RNA prep Pure Plant Kit（A）and Improved CTAB method（B）　to the extraction of Hedyotis diffusa Willd total RNA by Aligent 2000

表2　RNA prep Pure Plant Kit試劑盒和改良CTAB法提取蛇舌草總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of RNA prep Pure Plant Kit and improved CTAB method to the extraction of Hedyotis diffusa Willd RNA

4　討論

Trizol法、CTAB法及改良的CTAB法、酚-SDS法、試劑盒法等都是最常見(jiàn)的RNA提取方法。陳美霞等［11］通過(guò)多種植物RNA提取方法的對(duì)比與優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)用熱硼酸法能高效快速的提取到紅麻福紅992葉片總RNA。因?yàn)椴煌参锘蛘咄恢参锊煌课患安煌贩N往往存在屬性差異，材料內(nèi)組分含量及質(zhì)量也有差異，在研究中無(wú)法用固定的方法來(lái)提取不同植物、不同組織的RNA，需結(jié)合材料特性，不斷探索與優(yōu)化，找到合適的提取方法。

蛇舌草成熟期很短，植物纖維、多糖等含量較高，生長(zhǎng)過(guò)程中次生產(chǎn)物大量積累［5］。多糖的結(jié)構(gòu)與RNA相似度高，對(duì)RNA的分離純化有很大影響，在RNA沉淀過(guò)程中，多糖雜質(zhì)易形成凝膠狀沉淀，在DEPC溶解后這部分沉淀易形成多糖絮狀物，可造成RNA產(chǎn)率降低，因此，能否將這些雜質(zhì)去除是提取高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵［12］。蛋白質(zhì)污染也是影響RNA質(zhì)量的主要因素之一［13］，試驗(yàn)中在蛋白質(zhì)沉淀環(huán)節(jié)上清液能夠少吸盡量不要多吸。

RNase是另一個(gè)影響RNA質(zhì)量的主要物質(zhì)，本身性質(zhì)非常穩(wěn)定，分布廣泛，對(duì)RNA有水解作用，但對(duì)DNA不起作用，這給試驗(yàn)增添了難度［14］。在研磨破碎成粉的過(guò)程中，除內(nèi)源RNase會(huì)造成RNA的降解外［15］，操作者汗液及唾液、空氣灰塵、各種試驗(yàn)器皿中均可能存在RNA酶。為減少RNase酶污染，首先，試驗(yàn)所用離心管須無(wú)菌無(wú)酶，所用耗材、試劑等做滅RNase處理，即DEPC水浸泡過(guò)夜或高壓滅菌等；其次，RNA提取最好在無(wú)菌超凈臺(tái)進(jìn)行，且操作者須全程戴口罩、勤換手套。

本文結(jié)果顯示，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒對(duì)白花蛇舌草的植物細(xì)胞壁具有較強(qiáng)的裂解能力，試劑盒中DNAse I干粉可有效地消除基因組污染，穩(wěn)定性好，無(wú)異丙醇及乙醇洗滌過(guò)程，RNA可以直接從離心柱上洗脫，避免了其他方法干燥不易溶解的問(wèn)題，因此RNA產(chǎn)率相對(duì)較高。本方法可基本上排除多糖、蛋白質(zhì)及DNA的干擾，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及Aligent 2100生物分析儀檢測(cè)分析，提取的總RNA質(zhì)量和純度均可滿足后續(xù)small RNA測(cè)序、靶mRNA預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

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（責(zé)任編輯：陳翔）

本刊將更名為《廣東藥科大學(xué)學(xué)報(bào)》

廣東藥學(xué)院已更名為廣東藥科大學(xué)，本刊也將隨之更名。但期刊更名需上報(bào)國(guó)家新聞出版廣電總局審批，批準(zhǔn)后才能啟用新刊名?，F(xiàn)更名事項(xiàng)正在申辦中，因此，目前本刊仍用《廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)》刊名出版，但本校論文的作者單位改為“廣東藥科大學(xué)”。

（本刊編輯部）

Comparison and optimization of the total RNA extraction method from Hedyotis diffusa Willd

CHEN Yanlin，WANG Yingfang
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the best extraction method of total RNA in Hedyotis diffusa Willd.Methods Taking roots and leaves of Guangdong-grown Hedyotis diffusa Willd.as materials，Trizol method，RNA prep Pure Plant Kit，Plant Total RNA extraction kit，Improved CTAB method and RNAiso Plus Reagent method were used to extract total RNA，and the integrity，purity and yield of five total RNA extraction methods were compared by agarose gel electrophoresis（AGE）and Aligent 2100.Results RNA prep Pure Plant Kit and Plant Total RNA extraction kit could extract the integral and high-quality total RNA.According the 1.5% agarose gel electrophoresis（AGE）experiment，both the 28S and 18S bands were clear，and the former was brighter than the latter.D（γ）260 nm/D（γ）280 nmand D（γ）260 nm/D（γ）230 nmwere all in 2.0 above，and the leaves production rate was the highest and up to 390.35 g/L.The result of Aligent 2100 showed that the 28S band was twice the brightness as the 18S.Although the improved CTAB method could effectively suppress the influence of polysaccharides and polyphenols，the genome were polluted seriously.Both RNAiso Plus reagent method and Trizol were useless for the extraction of total RNA.Conclusion The difference lies in different species of plants or different varieties of one species，and it even occurs indifferent parts of the same plant，so the RNA extraction method must be selected appropriately according to the characteristics of plants.RNA prep Pure Plant Kit has been proved to be able to extract good-quality RNA from the roots and leaves of Hedyotis diffusa Willd.tissue，which can meet the requirements of subsequent experiment.

Hedyotis diffusa Willd；Total RNA；extraction

R282.2

A

1006-8783（2016）04-0410-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032402

2016-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81403195）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2013010015418）

陳艷琳（1991—），女，2014級(jí)碩士研究生，Email:944589543@qq.com；通信作者:王穎芳（1975—），女，副教授，從事中藥方劑學(xué)研究，Email:150306757@qq.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-08 17:09 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160708.1709.005.html