李 博，顧 悅，燕彩玲，賈原博，賀銀鳳（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2乳酸菌的篩選及鑒定

李 博，顧 悅，燕彩玲，賈原博，賀銀鳳*
（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

通過(guò)V.harveyi BB170生物學(xué)方法檢測(cè)分離自內(nèi)蒙古錫盟地區(qū)的8株乳酸菌產(chǎn)生群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2的情況，篩選出高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并探究信號(hào)分子AI-2變化規(guī)律。結(jié)果表明：8株乳酸菌均能夠分泌具有活性的信號(hào)分子AI-2，其中，菌株2-1產(chǎn)信號(hào)分子AI-2的能力顯著優(yōu)于其他7株乳酸菌（p＜0.05）；高產(chǎn)AI-2的乳酸菌菌株2-1經(jīng)鑒定為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）；隨著2-1菌體的生長(zhǎng)信號(hào)分子AI-2的濃度也隨之增大，并且信號(hào)分子AI-2濃度在穩(wěn)定期初期達(dá)到最大值。

群體感應(yīng)，乳酸菌，信號(hào)分子AI-2

群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)，指細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中一般可以自發(fā)地釋放一些特定的自誘導(dǎo)信號(hào)分子（AIs），當(dāng)這些信號(hào)分子被自身或環(huán)境中的其他個(gè)體感知到時(shí)，會(huì)通過(guò)改變自身某些基因的表達(dá)而作出反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)特定的生理功能，協(xié)調(diào)群體行為。QS系統(tǒng)由自誘導(dǎo)分子、感應(yīng)蛋白及其下游調(diào)控蛋白組成。根據(jù)細(xì)菌合成感應(yīng)機(jī)制和信號(hào)分子種類(lèi)的不同，QS系統(tǒng)主要分為三類(lèi)：革蘭氏陰性菌（G-）的AHL-LuxI/LuxR系統(tǒng)，由寡肽介導(dǎo)的革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）雙組分感應(yīng)系統(tǒng)，LuxS/AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)［1］。

LuxS/AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)是Bassler等［2］在哈氏弧菌（Vibrio harveyi，V.harveyi）的生物發(fā)光現(xiàn)象中首次發(fā)現(xiàn)的，它可以分泌兩種自體誘導(dǎo)分子AI-1和AI-2，并且均可控制相關(guān)基因的表達(dá)［3］。實(shí)驗(yàn)中用到的指示菌株V.harveyi BB170是標(biāo)準(zhǔn)菌株V.harveyi BB120的定向突變菌株，其信號(hào)分子AI-1的感受器是缺失的，故只能對(duì)信號(hào)分子AI-2發(fā)生反應(yīng)并發(fā)光。V.harveyi BB170產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2的luxS基因是完整的，在菌體密度達(dá)到一定程度時(shí)，可自行產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2。V.harveyi BB170是目前國(guó)際上通用的、便捷高效的檢測(cè)信號(hào)分子AI-2的指示菌株［4］。

目前發(fā)現(xiàn)，LuxS/AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)存在于多種革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌中，不同菌種間其表達(dá)的蛋白質(zhì)同源性也較高，其分泌的信號(hào)分子AI-2的結(jié)構(gòu)也相似，信號(hào)分子AI-2可以引起種間信息的交流［5］，所以LuxS/AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)可能主要用于不同菌種間交流。研究表明，LuxS/AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)對(duì)乳酸菌的酸耐受能力、抑制病原微生物、對(duì)腸表皮細(xì)胞的黏附性、生物膜的形成以及在動(dòng)物消化道中的存活性等具有介導(dǎo)作用［6-11］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8 株實(shí)驗(yàn)菌株 均分離自內(nèi)蒙古錫盟地區(qū)酸馬奶酒中，由內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌與酵母菌互生機(jī)理課題組提供；V.harveyi BB170 購(gòu)自ATCC；MRS液體培養(yǎng)基 按照文獻(xiàn)［12］方法配制；AB培養(yǎng)基 按照文獻(xiàn)［13］方法配制；細(xì)菌基因組提取試劑盒 北京天根公司。

HZQ-C氣浴恒溫振蕩器 精達(dá)公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái) 蘇州智凈公司；高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司；SK-1快速混勻器 武漢格萊莫公司；LG10-24A離心機(jī) 湘潭離心機(jī)有限公司；核酸電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；GelDoc XR+凝膠成像儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；快速梯度PCR儀 美國(guó)ABI公司；Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；VICTOR X3 Multilabel Plate Reader 美國(guó)Perkin Elmer儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海精密儀器有限公司。

1.2 菌種保藏和活化

將8株乳酸菌分別接種于滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃活化培養(yǎng)三代，在第三代生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的發(fā)酵液中加入20%甘油，分別裝入2 mL離心管置于-80℃冰箱進(jìn)行保藏。每次使用按2%的接種量接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中，每代于37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)三代即可用于實(shí)驗(yàn)。

V.harveyi BB170使用AB培養(yǎng)基活化三代，在第三代生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的發(fā)酵液中加入20%甘油，分裝入2 mL離心管置于-80℃冰箱進(jìn)行保藏。每次使用按2%的接種量接種于新鮮AB培養(yǎng)基中，每代于30℃振蕩培養(yǎng)13 h，連續(xù)培養(yǎng)三代即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2乳酸菌的篩選

1.3.1 乳酸菌上清液的制備 將8株乳酸菌按2%接種至滅菌后的液體MRS培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)19 h后，將菌液移入滅菌的10 mL離心管中6000 r/min離心10 min，棄去菌泥，上清液用0.22 μm的滅菌濾菌器過(guò)濾至2 mL離心管中，得到各乳酸菌的無(wú)菌上清液；按相同方法收集30℃振蕩培養(yǎng)13 h的V.harveyi BB170無(wú)菌上清液，作為陽(yáng)性對(duì)照；用0.22 μm滅菌濾菌器分別過(guò)濾滅菌的AB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，作為陰性和介質(zhì)對(duì)照。無(wú)菌上清液分別貯藏于-80℃冰箱。

對(duì)比組患者二尖瓣瓣膜病變檢出率為25%，主動(dòng)脈瓣膜病檢出率為50%，其他病變檢出率為25%，研究組檢出率分別為22.22%、44.44%、33.33%，試驗(yàn)組檢出率分別為20%、80%，具體構(gòu)成情況見(jiàn)表。

1.3.2 上清液中信號(hào)分子AI-2的生物學(xué)檢測(cè) 發(fā)光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［13］。將V.harveyi BB170按 2%接種于滅菌后的AB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速90 r/min，30℃培養(yǎng)12 h左右至培養(yǎng)基混濁（OD600 nm為0.7～1.2），然后用新鮮的AB培養(yǎng)基以1∶5000稀釋V.harveyi BB170培養(yǎng)液，隨后充分振蕩混勻備用。分別將各乳酸菌、V.harveyi BB170、AB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基濾過(guò)的無(wú)菌上清液作為待測(cè)樣品、陽(yáng)性、陰性和介質(zhì)對(duì)照，按體積比1∶100與上述稀釋過(guò)的V.harveyi BB170培養(yǎng)液混合，置于30℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)。在1～6 h內(nèi)，每30 min取200 μL/孔至96孔黑色酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光模式檢測(cè)其熒光強(qiáng)度值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制曲線。樣品與對(duì)照均取復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。在1～6 h內(nèi)，以陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度值降到最小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)為基準(zhǔn)（在3 h左右），信號(hào)分子AI-2的濃度用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示，計(jì)算公式如下［14］。

陽(yáng)性對(duì)照組相對(duì)熒光強(qiáng)度=陽(yáng)性對(duì)照的熒光強(qiáng)度值/陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度值

待測(cè)組相對(duì)熒光強(qiáng)度=待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值/介質(zhì)對(duì)照的熒光強(qiáng)度值

1.4 高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2乳酸菌的分子生物學(xué)鑒別

1.4.1 細(xì)菌總DNA的提取及PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2乳酸菌的基因組進(jìn)行提取，提取方法詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)菌株16S rRNA序列PCR擴(kuò)增引物F：5＇-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′R：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGT TT-3′，參照文獻(xiàn)［15］中所提供的引物。PCR擴(kuò)增片段約為900 bp。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中模板DNA 2 μL、上下游引物各2 μL、DreamTaq Green PCR Master Mix 25 μL、加無(wú)菌水補(bǔ)至50 μL。PCR條件參數(shù)為：預(yù)變性94℃、3 min，變性94℃、30 s，退火57.4℃、30 s，延伸72℃、90 s，35個(gè)循環(huán)，最后末端延伸72℃、5 min。取5 μL實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×Loading Buffer混勻，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，110 V、30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

1.4.2 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 利用BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），將所測(cè)定菌株的16S rDNA序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類(lèi)地位的菌種。然后用DNA star軟件以Mega 5.2.2進(jìn)行校準(zhǔn)排齊，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 信號(hào)分子AI-2與OD595 nm值的關(guān)系

將高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2乳酸菌株2-1按2%接種至滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4、7、10、13、16、19、22、25 h后，分別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)OD595 nm值。不同時(shí)間點(diǎn)上清液的提取和信號(hào)分子AI-2的測(cè)定方法同1.3.1和1.3.2。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件11.0版本，在顯著水平為0.05下進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2乳酸菌的篩選

由圖1可知，介質(zhì)對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的熒光強(qiáng)度在1～2.5 h隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，在2.5 h陽(yáng)性對(duì)照熒光強(qiáng)度降到最低，之后其熒光強(qiáng)度上升。而介質(zhì)對(duì)照和陰性對(duì)照由于信號(hào)分子AI-2的濃度較低，熒光強(qiáng)度一直降到3 h，在3 h降到最低點(diǎn)，隨后介質(zhì)對(duì)照和陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度開(kāi)始呈上升趨勢(shì)，由于陰性對(duì)照只含有由AB培養(yǎng)基稀釋后的指示菌，表明在培養(yǎng)過(guò)程中由指示菌V.harveyi BB170產(chǎn)生的AI-2濃度達(dá)到誘導(dǎo)其發(fā)光的閾值的時(shí)間為3 h，故以3 h作為基準(zhǔn)點(diǎn)來(lái)計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度。

依據(jù)文獻(xiàn)［16-17］和實(shí)驗(yàn)室前期研究，大量乳酸菌產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2的最大值均出現(xiàn)在對(duì)數(shù)期末期或穩(wěn)定期初期，故選擇對(duì)8株乳酸菌培養(yǎng)19 h上清液進(jìn)行熒光檢測(cè)，以孵育3 h的熒光強(qiáng)度作為基準(zhǔn)點(diǎn)，比較其相對(duì)熒光強(qiáng)度，見(jiàn)圖2。由圖2知，八株乳酸菌的相對(duì)熒光強(qiáng)度差異性較大，且均顯著高于陰性對(duì)照（p＜0.05），說(shuō)明8株乳酸菌均可以產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2，并且菌株1-3-2、2-1、5-2-1的相對(duì)熒光強(qiáng)度均顯著高于其他5株菌（p＜0.05），其中菌株1-3-2和5-2-1相對(duì)熒光強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)，2-1相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著高于陽(yáng)性對(duì)照（p＜0.05），達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照的1.5倍，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取菌株2-1。

圖1 不同孵育時(shí)間各樣品的熒光強(qiáng)度值Fig.1 The luminescence of different incubation time of samples

圖2 各乳酸菌培養(yǎng)19 h上清液的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.2 The relative luminescence of lactic acid bacteria in incubation time 19 h

2.2 高產(chǎn)信號(hào)分子AI-2乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定

圖3 16S rDNA基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rDNA gene amplified by PCR

乳酸菌菌株2-1的16S rDNA基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖3，由圖3可見(jiàn)菌株2-1 PCR的16S rDNA產(chǎn)物大約在900 bp的位置。菌株2-1的16S rRNA序列與GenBank中已知菌株的基因序列進(jìn)行同源性比較，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 菌株2-1與其他乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 2-1 to other lactic acid bacteria

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可直觀地看出乳酸菌菌株2-1和已知菌株的親緣關(guān)系，2-1與菌株Lactobacillus fermentum strain CIP 1029和Lactobacillus fermentum strain NBRC 158在同一分支，且同源性最高，都達(dá)到99.8%，由此可判定這菌株2-1為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。

2.3 信號(hào)分子AI-2與發(fā)酵乳桿菌2-1菌體密度之間的關(guān)系

以孵育3 h為基準(zhǔn)點(diǎn)，計(jì)算發(fā)酵乳桿菌2-1不同培養(yǎng)時(shí)間的相對(duì)熒光強(qiáng)度。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同培育時(shí)間菌體的OD595 nm值和相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制曲線，探討菌體密度與信號(hào)分子AI-2的關(guān)系，見(jiàn)圖5。由圖5知，在4～16 h，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵乳桿菌2-1的OD595 nm值逐漸增大，相對(duì)熒光強(qiáng)度也在逐漸上升，并在19 h達(dá)到最大值，且顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度（p＜0.05），這表明信號(hào)分子AI-2與乳酸菌2-1菌體密度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。目前文獻(xiàn)［13］中報(bào)道，當(dāng)菌體密度過(guò)大，會(huì)造成熒光強(qiáng)度的降低。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)19 h后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD595 nm值不再變化，而相對(duì)熒光強(qiáng)度開(kāi)始下降，這可能是由于菌體重新將信號(hào)分子AI-2吸收入菌體內(nèi)，來(lái)調(diào)控某些重要生理功能［18］。

圖5 發(fā)酵乳桿菌2-1上清相對(duì)熒光強(qiáng)度與OD595 nm的關(guān)系Fig.5 The relationship between the relative luminescence and OD595 nmabs

3 結(jié)論

利用V.harveyi BB170檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)8株乳酸菌均可以產(chǎn)生信號(hào)分子AI-2，但是差異性較大，其中菌株2-1、1-3-2、5-2-1產(chǎn)信號(hào)分子AI-2的能力明顯高于其他5株乳酸菌，尤其以菌株2-1最為突出。乳酸菌2-1經(jīng)過(guò)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，確定其為發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。發(fā)酵乳桿菌2-1可以分泌具有活性的信號(hào)分子AI-2，隨著菌體密度的增加，信號(hào)分子AI-2的濃度逐漸增加，并在19 h達(dá)到峰值，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，信號(hào)分子AI-2的濃度下降。

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Screening and identification of AI-2 high-producing lactic acid bacteria

LI Bo，GU Yue，YAN Cai-ling，JIA Yuan-bo，HE Yin-feng*
（College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

The V.harveyi bioassay method was carried out to explore that 8 lactic acid bacteria which isolated from koumiss of Ximeng region in Inner Mongolia produced the quorum-sensing signal autoinducer-2（AI-2）and found the production pattern.AI-2 high-producing strain was screened for molecular biological identification and relationship between AI-2 and bacterial density was further studied.The results showed that all strains could produce AI-2，among of which the ability of AI-2 production of strain 2-1 was superior（p＜0.05）and identified as a Lactobacillus fermentum.The concentration of AI-2 increased with bacterial density and the largest amount of AI-2 was observed in the early stationary phase in the culture of strain 2-1.

quorum sensing；lactic acid bacteria；signal autoinducer AI-2

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0185-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.029

2015－07－02

李博（1991-），男，碩士研究生，研究方向：乳品微生物，E-mail：libo910208@126.com。

*通訊作者：賀銀鳳（1960-），女，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：heyinf6468@yahoo.com.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31360396）。