王姣姣 吳 潤 李嘉敏 黃 帥 周先禮西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610031

假耬斗菜中化學(xué)成分的研究

王姣姣 吳 潤 李嘉敏 黃 帥 周先禮
西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610031

目的 研究假耬斗菜中的化學(xué)成分。 方法 運(yùn)用多種方法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行純化和鑒定，并運(yùn)用3-（4，5-二甲基吡啶-2）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2-氫-四唑鹽（MTS）比色法考察了化合物Ⅰ和Ⅱ的對(duì)肺癌細(xì)胞H460、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人肝癌細(xì)胞Hep G2的體外抗腫瘤活性。 結(jié)果 共分離得到7個(gè)化合物，分別為：Paraquinin A（Ⅰ）、Praquinin B（Ⅱ）、小檗堿（Ⅲ）、Menisdaurin（Ⅳ）、3，4-二甲基苯甲酸（Ⅴ）、對(duì)羥基苯甲酸（Ⅵ）、己內(nèi)酰胺（Ⅶ），抗腫瘤活性結(jié)果顯示化合物Ⅰ和Ⅱ均無細(xì)胞毒活性。 結(jié)論 化合物Ⅲ～Ⅶ為首次從該植物中分離得到，并首次測(cè)試了化合物Ⅰ和Ⅱ的抗腫瘤活性。

假耬斗菜；化學(xué)成分；碳苷；氰苷

假耬斗菜Paraquilegia microphylla（Royle）Drunmm.Et Hutch.為毛茛科的假耬斗菜屬植物，主要分布于西藏、四川、甘肅、云南、青海等地。假耬斗菜為西藏常用中草藥，具有鎮(zhèn)痛、催產(chǎn)的功效［1］。假耬斗菜屬植物中含有皂苷類、酚酸類、黃酮類化合物及生物堿類化合物［2-13］。前人從中分離得到3個(gè)黃酮碳苷［9］和2個(gè)三萜皂苷［10］。本研究進(jìn)一步對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，得到7個(gè)化合物。見如圖1。分別為Paraquinin A（Ⅰ）、Praquinin B （Ⅱ）、小檗堿 （Ⅲ）、Menisdaurin（Ⅳ）、3，4-二甲基苯甲酸 （Ⅴ）、對(duì)羥基苯甲酸（Ⅵ）和己內(nèi)酰胺（Ⅶ）。化合物Ⅲ～Ⅶ為首次從該植物中分離得到。采用MTS比色法測(cè)試了化合物Ⅰ和Ⅱ?qū)460、MCF-7和Hep G2的體外抗腫瘤活性。

圖1 假耬斗菜中分離得到的化合物

1 儀器與材料

核磁共振儀Varian NMR system 600，Waters 600

半制備型高效液相色譜儀，質(zhì)譜儀Q-TOF micro mass spectrometer（Waters）型。色譜用硅膠G和H（青島海洋化工廠產(chǎn)品），反相硅膠RP-18（Merck公司）。

藥材于2012年4月由西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所提供，由西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所格桑索朗副主任藥師鑒定為假耬斗菜。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

假耬斗菜地上部分5.5 kg，用95%乙醇冷浸提取3次，每次7 d，減壓濃縮得到浸膏330 g。取300 g浸膏懸浮于50℃的熱水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓濃縮得到石油醚浸膏A（100 g）、乙酸乙酯浸膏B（30 g）和剩余水部分C。

C部分經(jīng)D-101大孔樹脂柱色譜，分別用水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫得C1～C3；C1經(jīng)硅膠柱色譜，乙酸乙酯∶甲醇（25∶1～0∶1）梯度洗脫分為C1-1～C1-5五部分，C1-1經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析得到化合物Ⅰ （158 mg），C1-2經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析得到化合物Ⅱ（221 mg）；C1-4經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析（乙酸乙酯∶甲醇15∶1）得到化合物Ⅲ（10 mg）；

B部分經(jīng)硅膠柱層析 （石油醚∶乙酸乙酯=1∶0～0∶1）得到B1、B2、B3三部分；B2部分再經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析（石油醚∶丙酮=8∶2），結(jié)合制備高效液相色譜，得化合物Ⅴ（25 mg）和Ⅵ（51 mg）。B2部分再經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析（石油醚∶丙酮7∶3）得化合物Ⅶ（10 mg）。B3部分再經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析（氯仿∶甲醇=9∶1），得化合物Ⅳ（23 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：黃色粉末，HR-ESI-MS確定其分子式C28H32O15（m/z：609.1816［M+H］+，calcd.for C28H33O15，609.1819）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）：δ 6.98，6.98 （s，H-3），6.95，6.90（s，H-8），8.05（d，J=8.8，H-2'，H-6'），7.10（d，J=8.8，H-3'，H-5'），3.87（s，H-4'），13.49 （s，5-OH），13.50（s，5-OH），4.69（d，J=8.8，H-1''），4.84（d，J=8.8，H-1'''）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：163.8，163.6（C-2），103.9，103.8（C-3），182.5，182.2 （C-4），160.4，159.4（C-5），111.0，110.9（C-6），162.6，161.6（C-7），93.9，93.5（C-8），156.6，156.3（C-9），105.5，105.0（C-10），122.6（C-1'），128.5（C-2'，C-6'），114.7 （C-3'，C-5'），162.6（C-4'），55.7（4'-OCH3），71.0，70.9 （Glc-1''），79.0，78.9（Glc-2''），77.3，77.2（Glc-3''），70.2，69.6（Glc-4''），81.6，81.0 （Glc-5''），60.7，61.9 （Glc-6''），101.2，100.9（Glc-1'''），73.9，73.9（Glc-2'''），76.0，75.8（Glc-3'''），69.5，69.4（Glc-4'''），（Glc-5'''），60.4，60.6（Glc-6'''）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］一致，故鑒定化合物Ⅰ為Acacetin-6-C-β-D-glucopyranosyl-（1→2）-β-D-glucopyranoside，俗名為Paraquinin A。

化合物Ⅱ：黃色粉末，HR-ESI-MS確定其分子式C34H42O19（m/z 755.2397［M+H］+，calcd.for C34H43O19，755.2399）。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）：δ 6.99，6.96，（s，H-3），6.95，6.91（s，H-8），8.06（d，J=8.8，H-2'，H-6'），7.13（d，J=8.8，H-3'，H-5'），3.87（s，H-4'），13.49，13.50 （s，5-OH），4.75（d，J=8.8，H-1''），4.73（d，J=8.8，H-1''），4.72（d，J=8.8，H-1'''），4.71（d，J=8.8，H-1'''），4.96（s，H-1''''），4.97（s，H-1''''）。13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）：163.6，163.5（C-2），103.9，103.6（C-3），182.6，182.1（C-4），160.7，159.3（C-5），111.4，110.7（C-6），162.5，161.4（C-7），94.5，94.3（C-8），156.7，156.3（C-9），105.7，105.1（C-10），122.6（C-1'），128.5（C-2'，C-6'），114.7（C-3'，C-5'），162.8（C-4'），55.7（4'-OCH3），71.0，70.9（Glc-1''），71.0，70.6（Glc-2''），77.3，77.2（Glc-3''），70.1，69.7（Glc-4''），81.1，81.0（Glc-5''），60.9，61.8 （Glc-6''），102.0，101.1（Glc-1'''），76.8，74.9（Glc-2'''），73.8，73.3（Glc-3'''），69.8，69.5（Glc-4'''），76.4，75.9（Glc-5'''），60.3，60.5（Glc-6'''），100.6，100.5（Rha-1''''），71.2，71.1（Rha-2''''），70.5，70.3（Rha-3''''），72.1，71.6（Rha-4''''），68.4，68.1（Rha-5''''），17.7，17.6（Rha-6''''）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］對(duì)照一致，故鑒定化合物Ⅱ?yàn)锳cacetin-6-C-α-L-rhamnopyranosyl-（1→ 2）-β-D-glucopyranosyl-（1→2）-β-D-glucopyranoside，俗名為Paraquinin B。

化合物Ⅲ：黃色粉末，HR-ESI-MS確定其分子式C20H18NO4（m/z：336.1234［M+H］+，calcd.for C34H43O19，336.1236）［14］。與小檗堿對(duì)照品共薄層Rf值相同，故鑒定化合物Ⅲ為小檗堿。

化合物Ⅵ：無色固體。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：5.50（1H，s，α-H），6.29（1H，d，J=9.6 Hz，H-2），6.21（1H，dd，J=3.6，9.6 Hz，H-3），4.36（1H，m，H-4），2.25（1H，m，H-5α），2.02（1H，m，H-5β），4.93（1H，dd，J=16，8.4，H-6），4.55（1H，d，J=7.8，H-1'）。13C NMR （125 MHz，CD3OD）δ：96.8（C-α），157.1（C-1），127.7 （C-2），140.6（C-3），65.4（C-4），36.1（C-5），72.5（C-6），118.0（CN），101.5（C-1'），74.5（C-2'），78.0（C-3'），71.7（C-4'），78.1（C-5'），63.1（C-6'）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］一致，故鑒定化合物Ⅵ為（4S，6R）-（Z）-6-（β-D-glucopyranosyloxy）-4-hydroxy-2-cyclohexene-1，α-acetonitrile，俗名為Menisdaurin。

化合物V：無色固體，HR-ESI-MS確定其分子式為 C7H6O4（m/z 139.0395［M+H］+，calcd.for C7H7O4，139.0395）。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.45（1H，br.s，H-1），6.79（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），7.43（1H，d，J= 8.4 Hz，H-6）。13C NMR（125 MHz，CD3OD）δ：169.8

（COOH），122.4（C-1），116.3（C-2），144.6（C-3），149.8 （C-4），114.2（C-5），122.4（C-6）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］一致，故鑒定化合物Ⅴ為3，4-二羥基苯甲酸。

化合物Ⅵ：無色固體，HR-ESI-MS確定其分子式為 C7H6O3（m/z：153.0121［M-H］-，calcd.for C7H5O3153.0188）［17］。與對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品共薄層Rf值相同，故鑒定化合物Ⅵ為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物Ⅶ：無色固體，分子式C6H11NO。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：2.19（2H，m，H-2），1.63（2H，m，H-3），1.35（2H，m，H-4），1.51（2H，m，H-5），3.16（2H，m，H-6）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：175.9（C-1），36.9（C-2），26.7（C-3），27.5（C-4），30.0（C-5），40.1 （C-6）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［18］一致，故鑒定化合物Ⅶ為己內(nèi)酰胺。

2.3 細(xì)胞毒活性測(cè)試

H460、MCF-7和Hep G2細(xì)胞用洛斯維（RPMI）培養(yǎng)基加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素（×100）。化合物Ⅰ和Ⅱ均用二甲亞砜（DMSO）溶解稀釋，DMSO的最終濃度不超過0.1%。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞H460、MCF-7和 Hep G2用胰酶消化后計(jì)數(shù)，按1× 104個(gè)/孔種96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁后棄去培養(yǎng)基，用1×PBS洗1遍，加入配好的藥物，設(shè)不加藥空白及DMSO對(duì)照，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，至5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃內(nèi)孵育24 h后終止培養(yǎng)，加入MTS/電子偶聯(lián)劑（PMS）混合液40 μL/孔，再于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1～4 h后，用全波長酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測(cè)OD值［19-21］。

本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果表明，化合物Ⅰ和Ⅱ均無體外細(xì)胞毒活性（IC50＞50 μmol/L，n=3）。

3 討論

假耬斗菜為西藏常用中草藥，藥用歷史悠久，療效確切，值得進(jìn)行深入的研究。本研究從假耬斗菜地上部分的乙醇提取液中分離得到了7個(gè)化合物，其中化合物Ⅲ～Ⅶ為首次從該植物中分離得到，結(jié)構(gòu)類型涉及黃酮碳苷、酰胺、氰苷、酚酸和生物堿類，并首次運(yùn)用MTS比色法測(cè)試了化合物Ⅰ和Ⅱ的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該植物化學(xué)分類學(xué)提供了一定的分類學(xué)證據(jù)，同時(shí)也豐富了對(duì)假耬斗菜的化學(xué)成分的深入認(rèn)識(shí)。

［1］中國科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志·植物藥類［M］.青海人民出版社，1991，323.

［2］孫明曉，趙婷，高昂，等.耬斗菜屬藥學(xué)研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（4）：83-84.

［3］陳四保，高光耀.尖萼耬斗菜的生物堿成分研究［J］.中草藥，1999，30（1）：8-10.

［4］魏孝義，朱明，謝海輝，等.乳突擬耬斗菜生物堿成分的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1995，7（3）：8-11.

［5］陳四保，王立為.尖萼耬斗菜中黃酮類成分的研究［J］.中國中藥雜志，1999，24（3）：158-160.

［6］陳四保，高光耀，王立為，等.無距耬斗菜化學(xué)成分的研究（I）［J］.中國中藥雜志，2001，26（7）：472-474.

［7］陳四保，余世春，王立為，等.無距耬斗菜化學(xué)成分的研究Ⅱ［J］.中國藥學(xué)雜志，2009（z1）：38-40.

［8］朱明，魏孝義，韋壁瑜.乳突擬耬斗菜中的一新二萜成分［J］.華南植物學(xué)報(bào)，1992（1）：80-83.

［9］Xu KJ，Xu XM，Deng WL，et al.Three new flavone C-glycosides from the aerial parts of Paraquilegia microphylla［J］. Journal of Asian natural products research，2011，13（5）：409-416.

［10］Xu K，Zhang P，Liao X，et al.Two new triterpene saponins from the aerial parts of Paraquilegia microphylla［J］.Fitoterapia，2010，81（6）：581-585.

［11］云學(xué)英，高建萍，張玉嬌，等.蒙藥耬斗菜總黃酮提取條件的優(yōu)化及含量測(cè)定［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015（1）：1-5.

［12］云學(xué)英，吳寧遠(yuǎn)，劉曉穎.蒙藥耬斗菜中阿魏酸含量的高效液相色譜法測(cè)定［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26（3）：589-590.

［13］白雪蓮.蒙古族藥食兩用植物耬斗菜多酚類化合物含量的季節(jié)性動(dòng)態(tài)變化研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2015，26（11）：2766-2767.

［14］楊鑫寶，劉揚(yáng)子，楊秀偉，等.磐安延胡索的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2013，44（16）：2200-2207.

［15］Nakanishi T，Nishi M，Somekawa M，et al.Structures of new and known cyanoglucosides from a North American plant，Purshia tridentata DC ［J］.Chemical and pharmaceutical bulletin，1994，42（11）：2251-2255.

［16］肖皖，李寧，熊元君，等.小秋葵化學(xué)成分的分離與鑒定（Ⅱ）［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（11）：893-895.

［17］李艷茸，李春，王智民，等.藏藥甘青烏頭化學(xué)成分研究（Ⅲ）［J］.中國中藥雜志，2014，39（7）：1163-1167.

［18］余輝攀，肖楠，孫明謙，等.小花棘豆化學(xué)成分分離鑒定［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41（6）：11-13.

［19］王洪燕，全康，蔣燕靈，等.木犀草素抗腫瘤細(xì)胞增殖及增敏抗腫瘤藥物作用研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，39（1）：30-36.

［20］Huang S，Zhou XL，Wang CJ，et al.Pyrrolizidine alkaloids from Liparis nervosa with inhibitory activities against LPS-induced NO production in RAW264.7 macrophages［J］. Phytochemistry，2013，93：154-161.

［21］Huang S，Zhong DX，Shan LH，et al.Three new pyrrolizidine alkaloids derivatives from Liparisnervosa［J］.Chinese Chemical Letters，2016.doi：10.1016/j.cclet.2016.01.003.

Study on chemical constituents of Paraquilegia microphylla

WANG Jiaojiao WU Run LI Jiamin HUANG ShuaiZHOU Xianli
School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Sichuan Province，Chengdu 610031，China

Objective To investigate the chemical constituents of Paraquilegia microphylla.Methods The constituents were separated and purified by chromatographic methods，and their structures were elucidated by spectroscopic methods，compounds Ⅰ and Ⅱ were evaluated for their cytotoxicity against human H460 non-small cell lung cancer cells （H460），the breast cancer cell line MCF-7（MCF-7）and human hepatocellular cell line Hep G2（Hep G2）by［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium （MTS）method.Results Seven known compounds were obtained and1identified as Paraquinin A（Ⅰ），Praquinin B（Ⅱ），Berberine（Ⅲ），Menisdaurin（Ⅳ），3，4-dimethyl benzoic acid（Ⅴ），4-hydroxybenzoic acid（Ⅵ）and caprolactam（Ⅶ），the results of the cytotoxicity about compounds Ⅰ and Ⅱ were inactive against several human cancer cells.Conclusion Compounds Ⅲ-Ⅶ are isolated from this plant for the first time，the cytotoxicity of compounds Ⅰ and Ⅱ against several human cancer cells were tested for the first time.

Paraquilegia microphylla；Chemical composition；Flavonoid C-glycoside；Cyanogenic glycoside

R927

A

1673-7210（2016）06（a）-0008-03

2016-02-20本文編輯：趙魯楓）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81402803）；四川省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（15TD0048）。

王姣姣（1989.8-），女，西南交通大學(xué)2013級(jí)藥學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：天然藥物化學(xué)。

周先禮（1969.1-），男，博士，教授，研究方向：藥物化學(xué)。