吳　敏,　韓盛楠,2,　陳　陽(yáng),　王康旭,　韓召軍*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 南京　210095; 2. 皇崗出入境檢驗(yàn)檢疫局, 深圳　518000)

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基于COⅠ基因序列的11種蛀莖害蟲的分子鑒定

吳敏1,韓盛楠1,2,陳陽(yáng)1,王康旭1,韓召軍1*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 南京210095; 2. 皇崗出入境檢驗(yàn)檢疫局, 深圳518000)

本研究克隆了二化螟(Chilosuppressalis)、臺(tái)灣稻螟(C.auricilius)、蘆苞螟(C.luteellus)、甘蔗條螟(C.sacchariphagus)、三化螟(Tryporyzaincertulas)、亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、甘蔗紅尾白螟(Scirpophagaexcerptalis)、黃紋髓草螟(Calamotrophapaludella)、桃蛀螟(Conogethespunctiferalis)、棘禾草螟(Chilohyrax)和稻蛀莖夜蛾(Sesamiainferens) 11種常見蛀莖害蟲102個(gè)個(gè)體的線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因片段。序列分析顯示:該COⅠ基因片段長(zhǎng)為709 bp,序列都未發(fā)生缺失或插入現(xiàn)象,堿基顛換率(55.42%)高于轉(zhuǎn)換率(44.58%);種間遺傳距離平均值為0.140(0.088～0.179),種內(nèi)遺傳距離平均值為0.004(0～0.015), 兩者之間沒有重疊區(qū)域;聚類分析表明,不同種蛀莖害蟲分別形成獨(dú)立的進(jìn)化分支,分支自展值均為100%。研究結(jié)果表明該COⅠ基因序列具有適宜的變異信息,種內(nèi)相對(duì)保守,種間變異顯著,適用于蛀莖害蟲的物種識(shí)別,并為開發(fā)蛀莖害蟲DNA條形碼技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

蛀莖害蟲;線粒體COⅠ基因;分子鑒定

蛀莖害蟲是以蛀莖稈方式為害禾本科植物的鱗翅目害蟲,除了稻田中常見的二化螟[Chilosuppressalis(Walker)]、三化螟[Tryporyzaincertulas(Walker)]、稻蛀莖夜蛾(舊稱大螟)[Sesamiainferens(Walker)]和臺(tái)灣稻螟[Chiloauricilius(Dudgeon)]外,還有其他禾本科植物蛀莖害蟲。它們的棲境、形態(tài)和為害方式類似。生產(chǎn)上通過田間調(diào)查監(jiān)測(cè)幼蟲、蛹、卵以及成蟲來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)害蟲的發(fā)生期、發(fā)生量,并選擇適當(dāng)防治措施進(jìn)行及時(shí)防控。因此,準(zhǔn)確鑒定蛀莖害蟲的種類是防治的關(guān)鍵。

目前蛀莖害蟲的鑒定主要依據(jù)形態(tài)特征,包括體型、體色、翅面斑紋、翅脈、生殖器形狀等;幼蟲則主要依據(jù)腹足、背線、體色、毛片等;卵的特征主要是形狀、產(chǎn)卵方式和位置、卵塊的性質(zhì)和卵的排列方式等;蛹的鑒定特征較少。此外,水稻重要螟蟲與近似種的差異通常很細(xì)微,例如, 稻田常見的臺(tái)灣稻螟幼蟲與二化螟的幼蟲極為相似,僅有前胸背板顏色略有差異,鑒別主要依靠前胸氣門附近的毛片相對(duì)于氣門上線的位置;而蘆禾草螟的成蟲在體型、形態(tài)上與二化螟也非常相似,僅體色略有差異,詳細(xì)區(qū)分需要檢查翅脈和生殖器。

由于昆蟲的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類鑒定專業(yè)性強(qiáng),對(duì)材料要求較高。此外,大多數(shù)昆蟲在不同的發(fā)育階段形態(tài)結(jié)構(gòu)變化很大,同種昆蟲也會(huì)因?yàn)榈乩矸植疾煌a(chǎn)生形態(tài)差異,因此根據(jù)形態(tài)學(xué)直接進(jìn)行昆蟲鑒定有時(shí)會(huì)比較困難,尤其是近緣種的幼體(卵、幼蟲、蛹),形態(tài)非常相似,很難對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。更重要的是,許多分類記錄種和次要害蟲,僅有成蟲形態(tài)描述,難以對(duì)不同蟲態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。因此,生產(chǎn)上迫切需要簡(jiǎn)便的蛀莖害蟲鑒定技術(shù)。

2002年Tautz等基于分子生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展, 提出DNA分類的概念[1],即以DNA序列為主體構(gòu)建DNA分類系統(tǒng)平臺(tái),對(duì)生物進(jìn)行鑒定分類。隨后Hebert等對(duì)不同類群動(dòng)物的線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)進(jìn)行了堿基序列和氨基酸序列分析,認(rèn)為線粒體COⅠ序列可以作為動(dòng)物物種鑒定的核心序列,并構(gòu)建了COⅠ動(dòng)物物種鑒定系統(tǒng)[2]。目前已有報(bào)道表明,利用線粒體COⅠ基因序列對(duì)不同類群昆蟲的種,甚至種下類群均可以進(jìn)行有效的鑒定[3-10]。因此,本研究通過探討基于線粒體COⅠ基因序列的DNA分子鑒定方法用于蛀莖害蟲分類的可行性,確定適宜的DNA片段,建立蛀莖害蟲的快速識(shí)別的技術(shù),對(duì)蛀莖害蟲的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和及時(shí)防治具有重要意義。

1　材料與方法

1.111種蛀莖害蟲的采集和鑒定

采用受害植株剝查法采集幼蟲,運(yùn)用形態(tài)學(xué)知識(shí)通過鏡檢幼蟲和飼養(yǎng)羽化的成蟲進(jìn)行鑒定。在水稻、蘆葦、甘蔗和玉米等多種禾本科寄主植物上采集二化螟(浙江溫嶺)、臺(tái)灣稻螟(廣東廣州)、蘆苞螟[Chiloluteellus(Motschulsky)](江蘇南京)、甘蔗條螟(ChilosacchariphagusBojer)(廣東廣州)、稻蛀莖夜蛾(江蘇南京)、三化螟(廣東廣州)、亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)](湖北襄陽(yáng))、甘蔗紅尾白螟(ScirpophagaexcerptalisWalker)(廣東廣州)、黃紋髓草螟(CalamotrophapaludellaHübner)(湖北大冶)、桃蛀螟[Conogethespunctiferalis(Guenée)](江蘇南京)和棘禾草螟(ChilohyraxBleszynski)(湖北石首)等11種蛀莖害蟲,共102頭。其中, 稻蛀莖夜蛾屬于夜蛾科(Noctuidae), 其余昆蟲都是草螟科(Crambidae)害蟲。

1.2基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒分別提取102頭昆蟲的基因組DNA。利用上游引物L(fēng)CO-1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′) 和下游引物HCO-2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)[11]對(duì)102個(gè)基因組DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 使用rTaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng):94℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min,退火1 min,72℃延伸1 min。循環(huán)39次;最后72℃延伸10 min,12℃保持。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的條帶,進(jìn)一步連接轉(zhuǎn)化,經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后,取適量送至上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3COⅠ基因序列分析

用Gene-Explorer 對(duì)所測(cè)得的基因序列進(jìn)行手工校正,校正后用NCBI 中的BLAST 軟件進(jìn)行相似性檢索,驗(yàn)證所測(cè)序列是線粒體COⅠ基因片段。將確認(rèn)后的序列載入ClustalX2 軟件[12]進(jìn)行序列比對(duì),輸出格式為FASTA。將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA 5.0 軟件中[13],計(jì)算序列的保守位點(diǎn)(conserved sites,C)、變異位點(diǎn)(variable sites,V)及簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsim-informative sites,Pi)數(shù)和單突變位點(diǎn)數(shù),并分析其堿基組成及轉(zhuǎn)換顛換率,計(jì)算各物種間和種內(nèi)的遺傳距離;同時(shí)構(gòu)建基于遺傳距離模型Kimura 2-parameter 的鄰接法(neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1COⅠ基因序列分析

以102個(gè)昆蟲基因組DNA為模板,分別進(jìn)行COⅠ基因片段擴(kuò)增,克隆獲得了102條709 bp的目的片段,經(jīng)BLAST比對(duì),證實(shí)這些片段均為線粒體COⅠ基因序列。102條COⅠ基因序列中未發(fā)生缺失或插入現(xiàn)象,保守位點(diǎn)有465個(gè),變異位點(diǎn)有244個(gè),簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)221個(gè),單突變位點(diǎn)23個(gè)。所有位點(diǎn)中各堿基平均含量分別為:T(30%)、C(15.3%)、A(38.6%)、G(16.1%),其中A+T的含量(68.6%)明顯高于G+C的含量(31.4%),符合昆蟲線粒體堿基組成的基本特征[14]。

11種蛀莖害蟲COⅠ基因序列的堿基顛換率(transversion,Tv/Tv+Ts)為55.42%, 明顯高于轉(zhuǎn)換率(transition,Ts/Tv+Ts) 44.58%,轉(zhuǎn)換/顛換偏倚率R值(Ts/Tv)為0.8。堿基的轉(zhuǎn)換以AG為主(75.68%),少數(shù)為TC間的轉(zhuǎn)換(24.32%);顛換主要發(fā)生在TA間(78.26%),其他TG、CA和CG分別占顛換總數(shù)的13.04%、6.52%和2.17%(見表1)。由于物種間的親緣關(guān)系越近堿基轉(zhuǎn)換率越高,親緣關(guān)系越遠(yuǎn)則物種間堿基替換率越高[15-16],因此,該COⅠ基因片段能夠真實(shí)體現(xiàn)不同蛀莖害蟲間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

表1　11種蛀莖害蟲COⅠ基因片段堿基替換1)

1) ii:一致序列;Ts:轉(zhuǎn)換數(shù);Tv:顛換數(shù);R:Ts/Tv;TT:一致堿基T;TC:TC間轉(zhuǎn)換;TA:TA間顛換;TG:TG間顛換;CC:一致堿基C;CA:CA間顛換;CG:CG間顛換;AA:一致堿基A;AG:AG間轉(zhuǎn)換;GG:一致堿基G;Avg:平均頻率;1st第1 位點(diǎn);2nd:第2 位點(diǎn);3rd:第3 位點(diǎn)。

ii: Identical pairs;Ts: Transition;Tv: Transversion;R:Ts/Tv; TT: T Identical base T; TC: TC transition; TA: TA transversion; TG: TG transversion; CC: Identical base C; CA: CA transversion; CG: CG transversion; AA: Identical base A; AG: AG transition; GG: Identical base G; Avg: Average frequency; 1st: The first position; 2nd: The second position; 3rd: The third position.

2.2種內(nèi)和種間遺傳距離

基于Kimura 2-parameter 模型分析,計(jì)算不同蛀莖害蟲種內(nèi)及種間的遺傳距離,采用bootstrap(1 000 次)進(jìn)行檢驗(yàn)[17],結(jié)果如表2 所示,11種不同蛀莖害蟲種間遺傳距離介于0.088～0.179之間,平均值為0.140。其中,二化螟和蘆苞螟之間的遺傳距離最小(0.088),其次是蘆苞螟和臺(tái)灣稻螟(0.098);甘蔗紅尾白螟和棘禾草螟之間遺傳距離值最大(0.179)。11種蛀莖害蟲種內(nèi)遺傳距離介于0～0.015 之間,平均值為0.004,符合種內(nèi)遺傳距離的大小。此外,種間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的35倍; 而且種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離沒有重疊區(qū)域,完全符合DNA 條形碼有效性的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[18]。

表2　11種不同蛀莖害蟲的種間和種內(nèi)遺傳距離1)

1) DM: 稻蛀莖夜蛾; JHCM: 棘禾草螟; Y: 亞洲玉米螟; TZM: 桃蛀螟; HWSCM: 黃紋髓草螟; TM: 甘蔗條螟; L: 蘆苞螟; ER: 二化螟; BM: 甘蔗紅尾白螟; TW: 臺(tái)灣稻螟; S: 三化螟。DM:Sesamiainferens; JHCM:Chilohyrax; Y:Ostriniafurnacalis;TZM:Conogethespunctiferalis;HWSCM:Calamotrophapaludella;TM:Chilosacchariphagus;L:C.luteellus;ER:C.suppressalis;BM:Scirpophagaexcerptalis;TW:Chiloauricilius;S:Tryporyzaincertulas.

2.3系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以11種蛀莖害蟲COⅠ基因序列為靶標(biāo),以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。聚類分析結(jié)果表明, 每種蛀莖害蟲分別形成獨(dú)立的進(jìn)化分支,而且最初分支自展值均為100% (見圖1)。聚類結(jié)果也反映了物種間的親緣關(guān)系,例如,二化螟與蘆苞螟是近緣種,兩個(gè)物種的進(jìn)化分支聚集在一起。 由此可見,蛀莖害蟲COⅠ基因序列具有足夠的遺傳變異性和分化度,既可以區(qū)分不同的蛀莖害蟲,同時(shí)種內(nèi)相對(duì)保守。

圖1　鄰接法構(gòu)建的11種蛀莖害蟲基于COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Neighbor-joining tree of the 11 borer species based on the COⅠgene sequences

3　討論

目前生產(chǎn)上蛀莖害蟲的鑒定主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué),形態(tài)分類是建立在形態(tài)特征的分析與比較上的方法。然而,由于外部形態(tài)特征都是昆蟲體內(nèi)遺傳物質(zhì)被表達(dá)后的結(jié)果,往往會(huì)受到周圍環(huán)境和發(fā)育時(shí)期的影響。因此,建立一種基于體內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子鑒定新技術(shù)可以彌補(bǔ)當(dāng)前蛀莖害蟲形態(tài)學(xué)分類的不足。

Hebert等對(duì)動(dòng)物界,包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物共11門13 320個(gè)物種的COⅠ基因序列的比較分析得出:除刺胞動(dòng)物外,其余98%的物種遺傳距離的差異在種內(nèi)為0～0.002,種間平均遺傳距離可達(dá)到0.113[2]。由于該序列能夠很好地區(qū)分不同的物種,確定了其在動(dòng)物鑒定中的作用。因此,本文探討了利用COⅠ基因序列進(jìn)行蛀莖害蟲分子鑒定的可行性。

針對(duì)本研究涉及的常見蛀莖害蟲亞洲玉米螟、桃蛀螟和三化螟,已有文獻(xiàn)報(bào)道了不同的地理種群的同種個(gè)體內(nèi)基因交流頻繁,沒有顯著的遺傳分化[19-21];我們已有的研究結(jié)果也表明,不同地理種群的55頭二化螟和180頭稻蛀莖夜蛾的種內(nèi)遺傳分化距離分別為0.009和0.029,該距離遠(yuǎn)沒有達(dá)到種間0.113的標(biāo)準(zhǔn),因此仍然屬于同一個(gè)種,只是在某些地區(qū)間出現(xiàn)了很微弱的遺傳變異[22-23]。通過進(jìn)一步擴(kuò)大本研究中其他6種試蟲棘禾草螟、臺(tái)灣稻螟、蘆苞螟、甘蔗條螟、甘蔗紅尾白螟和黃紋髓草螟的采集地點(diǎn)和取樣量,是建立和完善DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行害蟲分子鑒定所必需的。

此外,通過搜索已發(fā)表文獻(xiàn)和NCBI上已登錄的其他蛀莖害蟲基因發(fā)現(xiàn),褐邊螟(CatagelaadjurellaWalker)、稻雪禾螟[Niphadosesgilviberbis(Zeller)]、軸禾草螟[Chilopolychrysus(Meyrick)] 和地中海玉米蛀莖夜蛾[Sesamianonagrioides(Lefebvre)]的COⅠ序列已經(jīng)被克隆并登錄至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)[24-25]。因此,如果研究者繼續(xù)收集尚未研究過的田間蛀莖害蟲,例如燈草雪禾螟(Niphadosesdengcaolites)、茭白禾草螟(Chilozizaniae)、二點(diǎn)螟 (Chiloinfuscatellus)、稷螟(Chilopanici)、列星大螟(Sesamiavuteria)和列點(diǎn)大螟(Sesamiauniformis)等昆蟲,繼續(xù)探討在上述昆蟲中COⅠ基因序列作為DNA分子鑒定的可行性,最終將建立起所有蛀莖害蟲的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列庫(kù),建立蛀莖害蟲DNA條形碼技術(shù),為我國(guó)的害蟲測(cè)報(bào)提供可靠的蛀莖害蟲鑒定方法。該方法的建立能夠解決目前生產(chǎn)上常見蛀莖害蟲近似種難以通過形態(tài)進(jìn)行鑒定的問題;解決蛀莖害蟲因不同地理分布和不同發(fā)育階段產(chǎn)生不同形態(tài)而難以鑒定的問題;解決蛀莖害蟲幼蟲、卵和蛹以及不完整標(biāo)本進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的問題;解決缺乏特定的昆蟲分類專家進(jìn)行鑒定蛀莖害蟲的問題,對(duì)保護(hù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全具有重要意義。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Molecular identification of 11 stem borer species based on the mitochondrialCOⅠ gene

Wu Min1,Han Shengnan1,2,Chen Yang1,Wang Kangxu1,Han Zhaojun1

(1. College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing210095, China;2. Huanggang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen518000, China)

Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COⅠ) gene sequences of 102 larvae from 11 different borer species (Chilosuppressalis,C.auricilius,C.luteellus,C.sacchariphagus,Sesamiainferens,Tryporyzaincertulas,Ostriniafurnacalis,Scirpophagaexcerptalis,Calamotrophapaludella,ConogethespunctiferalisandChilohyrax) were cloned, respectively. Sequence analysis revealed that theseCOⅠgene fragments were 709 bp in length, and no insertion and deletion occurred in each fragments. The rate of base transversion was higher than that of base transition. The average inter-species genetic distance was 0.140 (0.088-0.179), and the average intra-species genetic distance was 0.004 (0-0.015). There was no overlap between the two items of data. The cluster analysis showed that different borer species formed independent evolutionary branch, and the branch bootstrap values were 100%. These results proved that the clonedCOⅠ gene contains suitable information of genetic variation. It conserves within species, and varies well between species. Thus, it should be a suitable barcoding DNA fragment for identification of the borer species in fields.

stem borer;mitochondrialCOⅠgene;molecular identification

2015-08-26

2015-09-21

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303017)

E-mail: zjhan@njau.edu.cn

S 435.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.014

致謝：感謝廣東省農(nóng)科院張揚(yáng)研究員、廣州甘蔗糖業(yè)研究所龔恒亮研究員、廣西壯族自治區(qū)農(nóng)科院植保所龍麗萍所長(zhǎng)、湖北省農(nóng)科院呂亮副研究員、湖南省農(nóng)科院植保所彭兆普研究員、貴州大學(xué)楊洪副教授、四川省農(nóng)科院李曉研究員、安徽省農(nóng)科院胡本進(jìn)老師、江西省農(nóng)科院黃水金研究員、江蘇吳江市植保站朱福官站長(zhǎng)等對(duì)本研究提供的熱情幫助與支持。