賈　嬌,　蘇前富,　孟玲敏,　張　偉,　李　紅,　劉婉麗,　晉齊鳴

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 公主嶺　136100)

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抗咯菌腈禾谷鐮刀菌的紫外誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性

賈嬌,蘇前富,孟玲敏,張偉,李紅,劉婉麗,晉齊鳴*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 公主嶺136100)

為評(píng)估玉米莖腐病病原菌禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)對(duì)咯菌腈的室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn),本研究通過室內(nèi)紫外照射獲得抗咯菌腈突變體,分析抗性突變體對(duì)咯菌腈的抗藥性、遺傳穩(wěn)定性和生物學(xué)特性,及其對(duì)咯菌腈、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯的交互抗性。結(jié)果表明,經(jīng)紫外照射5 min,獲得17株抗咯菌腈突變體,其對(duì)咯菌腈的EC50為72.78～290.09 μg/mL,是親本菌株的4 000～17 000倍;抗性突變頻率為1.7×10-6,可穩(wěn)定遺傳;最適生長(zhǎng)溫度均為25℃,最適pH均為8,與親本菌株相同;菌落生長(zhǎng)速度低于親本菌株;在含有0.9 mmol/L NaCl的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌落形態(tài)與不含NaCl的PDA培養(yǎng)基中的相比,親本菌株和4號(hào)抗性菌株色素沉積減少,而1號(hào)和16號(hào)抗性菌株色素沉積增加。推測(cè)禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈存在中等或高等的室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。室內(nèi)抗藥性測(cè)定表明抗性突變體對(duì)咯菌腈和苯醚甲環(huán)唑均產(chǎn)生了抗性。

咯菌腈;禾谷鐮刀菌;交互抗性

玉米莖腐病(corn stalk rot)是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種土傳病害,一般年份發(fā)病率為10%～30%,嚴(yán)重年份發(fā)病率達(dá)到80%。它不僅造成玉米早衰、莖稈倒伏,而且其病原菌產(chǎn)生的真菌毒素危害人畜健康,是玉米生產(chǎn)上亟待研究解決的重要問題[1-2]。該病害病原較為復(fù)雜,主要由鐮刀菌(Fusariumspp.)、腐霉(Pythiumspp.)和赤霉(Gibberellaspp.)等多種病菌單一或復(fù)合侵染發(fā)生[3]。晉齊鳴、白金凱等的研究結(jié)果認(rèn)為禾谷鐮刀菌是我國(guó)東北春玉米區(qū)造成該病害發(fā)生的主要致病菌[4-5]。有研究報(bào)道苯基吡咯類殺菌劑咯菌腈(fludioxonil)對(duì)禾谷鐮刀菌具有較好的抑制作用[6]。袁虹霞等[7]的研究表明,咯菌腈對(duì)花生莖腐病病原具有很高的殺菌活性;郭寧等[8]研究發(fā)現(xiàn)用咯菌腈做種衣劑防治玉米莖腐病也具有一定的作用;郝俊杰等[9]報(bào)道咯菌腈處理玉米種子可較好地抑制禾谷鐮刀菌的侵染。咯菌腈是先正達(dá)公司開發(fā)的一種非內(nèi)吸性殺菌劑,對(duì)子囊菌、半知菌和擔(dān)子菌具有很好的防效[10],已作為農(nóng)作物的拌種劑廣泛使用。已有研究報(bào)道禾谷鐮刀菌對(duì)戊唑醇、多菌靈和氰烯菌酯等化學(xué)藥劑的抗藥性具有中或高等風(fēng)險(xiǎn)[11-13],但有關(guān)禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)目前未見報(bào)道。因此,本研究通過室內(nèi)紫外誘導(dǎo)獲得禾谷鐮刀菌抗咯菌腈的突變菌株,研究抗性突變菌株的生物學(xué)特性及其對(duì)其他化學(xué)藥劑的抗性,為明確禾谷鐮刀菌對(duì)該藥劑產(chǎn)生的潛在抗藥性風(fēng)險(xiǎn)及應(yīng)用該藥劑防治玉米莖腐病提供參考。

1　材料和方法

1.1材料

供試菌株:禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)菌株來自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病蟲害綜合防治研究室。

供試藥劑:95%咯菌腈原藥,杭州宇龍化工有限公司;甲醇,北京化工廠;10%苯醚甲環(huán)唑水分散顆粒劑,先正達(dá)中國(guó)投資有限公司;60 g/L戊唑醇種子處理懸浮劑,拜爾作物科學(xué)有限公司;250 g/L嘧菌酯懸浮劑,河北威遠(yuǎn)生物化工股份有限公司。上述化學(xué)殺菌劑中制劑用滅菌蒸餾水、原藥用甲醇分別溶解配制。

儀器:恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;8 W紫外燈。

培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g,加蒸餾水至1 000 mL;CMC培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉15 g、硝酸銨 1 g、磷酸二氫鉀 1 g、七水硫酸鎂 0.5 g、酵母提取物 1 g、瓊脂粉 15 g,加蒸餾水至1 000 mL;SNA培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀 1 g、硝酸鉀1 g、七水硫酸鎂 0.5 g、氯化鉀 0.5 g、葡萄糖 0.2 g、蔗糖 0.2 g,加蒸餾水至1 000 mL;水瓊脂培養(yǎng)基為2%的瓊脂培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均經(jīng)121℃ 高壓滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1咯菌腈對(duì)禾谷鐮刀菌的毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定咯菌腈對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用,咯菌腈的濃度設(shè)置為:0、3、1、0.5、0.125和0.062 5 μg/mL。在禾谷鐮刀菌菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌盤,接種在含有咯菌腈的PDA培養(yǎng)基中央,以添加相應(yīng)量甲醇為對(duì)照,25℃黑暗培養(yǎng)5 d,十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每個(gè)處理重復(fù)3皿,試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.2禾谷鐮刀菌抗咯菌腈突變體的紫外誘導(dǎo)

將禾谷鐮刀菌接種在CMC培養(yǎng)基上,培養(yǎng)7 d,待其大量產(chǎn)生分生孢子,將培養(yǎng)皿蓋打開,放置在距離8W紫外燈20 cm處照射5 min,經(jīng)雙層紗布過濾制備成1×107個(gè)/ mL的分生孢子懸浮液,取200 μL均勻涂布于含有0.3 μg/mL 咯菌腈的培養(yǎng)基上,25℃黑暗培養(yǎng)2 d,將萌發(fā)的抗性菌株在不含咯菌腈的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代,并測(cè)定含有0.3 μg/mL 咯菌腈的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快的突變體(同1.2.1方法)對(duì)咯菌腈的敏感性,計(jì)算抗性突變頻率和抗性倍數(shù)。

抗性突變頻率=抗性突變菌株數(shù)/涂板的分生孢子總數(shù)量;

抗性倍數(shù)=抗性突變體的EC50值/親本菌株的EC50值。

1.2.3抗性遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

隨機(jī)選取5株紫外誘變獲得的抗性突變體進(jìn)行測(cè)定。將5株抗性突變體在PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)9代,25℃黑暗培養(yǎng)5 d,通過測(cè)量菌落直徑法測(cè)定咯菌腈對(duì)抗性菌株后代的EC50,計(jì)算其抗性倍數(shù),并根據(jù)抗性菌株的生長(zhǎng)速度確定其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4抗性突變菌株的生物學(xué)特性研究

1.2.4.1溫度對(duì)抗性突變菌株的影響

選取5株能穩(wěn)定遺傳的抗性突變菌株及其親本菌株,于25℃培養(yǎng)3 d,自菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅,接種在不含咯菌腈的PDA培養(yǎng)基上,分別于5、15、20、25和32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次,試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.4.2pH對(duì)抗性突變菌株的影響

用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)不含咯菌腈的PDA培養(yǎng)基的pH分別為4、6、7、8和10,分別接種直徑5 mm的預(yù)培養(yǎng)菌落邊緣菌餅,于25℃培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,每個(gè)處理重復(fù)3次,試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.4.3NaCl對(duì)抗性突變菌株的影響

將直徑5 mm的咯菌腈抗藥突變體和親本菌株的菌碟接種在含0、0.1、0.3、0.7和0.9 mmol/L NaCl的PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)5 d,測(cè)量菌落直徑,觀察菌落形態(tài)。

1.2.5抗性突變體對(duì)其他藥劑的敏感性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法,分別測(cè)定出發(fā)菌株和7株抗咯菌腈的突變菌株對(duì)戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯的敏感性,并利用DPS軟件計(jì)算親本菌株及抗性菌株對(duì)其他藥劑的EC50。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)算藥劑的毒力回歸方程及EC50。

2　結(jié)果與分析

2.1紫外誘導(dǎo)抗藥性

研究發(fā)現(xiàn)咯菌腈對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用回歸方程為y=0.946+1.087x,EC50為0.016 μg/mL,EC95為0.529 μg/mL。通過紫外線誘導(dǎo)獲得17株抗性菌株,抗藥性分析發(fā)現(xiàn)抗性菌株對(duì)咯菌腈的抗性倍數(shù)為4 000～17 000倍(表1),當(dāng)咯菌腈的濃度為500 μg/mL時(shí),對(duì)抗性突變菌株的抑制率為52.2%～83.1%,表明野生型菌株經(jīng)紫外線誘導(dǎo)可產(chǎn)生對(duì)咯菌腈高抗突變菌株,抗性突變頻率為1.7×10-6。

表1　紫外誘變禾谷鐮刀菌獲得的抗咯菌腈突變體

2.2抗性菌株的遺傳穩(wěn)定性

由表2可知,經(jīng)紫外誘導(dǎo)的5株抗性突變體在無藥的PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)9代后, 第1代和第9代的菌落生長(zhǎng)速度無明顯差異,對(duì)咯菌腈的EC50也無明顯變化,表明室內(nèi)紫外誘導(dǎo)獲得的抗咯菌腈突變體可穩(wěn)定遺傳。

表2　抗咯菌腈突變體的抗性遺傳穩(wěn)定性

2.3抗性突變菌株的生物學(xué)特性

2.3.1溫度對(duì)抗性突變菌株的影響

由圖1可見,親本菌株和抗性突變菌株在不同溫度條件下培養(yǎng)3 d菌絲生長(zhǎng)速率變化趨勢(shì)一致;最適溫度均為25℃;在4℃和32℃條件下,親本菌株和抗性突變菌株幾乎不能生長(zhǎng);在相同溫度下,抗性突變菌株菌絲生長(zhǎng)速率均慢于親本菌株。表明抗性突變菌株對(duì)溫度的敏感性與親本菌株相同。

2.3.2pH對(duì)抗性突變菌株的影響

分析不同pH的PDA培養(yǎng)基對(duì)親本菌株和抗性突變菌株菌絲生長(zhǎng)速率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),親本菌株和抗性突變菌株在不同pH的PDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率變化趨勢(shì)是一致的;最適pH均為8;在相同pH的條件下,抗性突變菌株菌絲生長(zhǎng)速率均小于親本菌株;4號(hào)突變菌株的菌絲生長(zhǎng)速率在pH 4和6時(shí),明顯慢于親本菌株,pH為7和8時(shí)與親本菌株相近(圖2)。表明抗性突變菌株對(duì)pH的適應(yīng)性與親本菌株相似,4號(hào)突變菌株對(duì)pH的適應(yīng)性略有增強(qiáng)。

圖1　溫度對(duì)親本菌株和抗性菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.1　Effects of temperature on colony area of parental isolates and resistant mutants

2.3.3滲透壓對(duì)抗性突變體的影響

試驗(yàn)表明,親本菌株和抗性突變體在含有高濃度NaCl的PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)沒有受到抑制。在0.9 mmol/L 的NaCl滲透壓條件下,親本菌株和4號(hào)抗性突變體的菌落形態(tài)無明顯變化,但1號(hào)和16號(hào)抗性突變體培養(yǎng)基中紅色素的沉積明顯增加。說明親本菌株和對(duì)咯菌腈抗性較低的突變體在增加滲透脅迫條件下生長(zhǎng)受到抑制,而抗性較強(qiáng)的突變菌株對(duì)滲透脅迫不敏感。

圖2　pH對(duì)親本菌株和抗性突變菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2　Effects of pH value on colony diameter of parental isolates and resistant mutants

圖3　0.9 mmol/L的NaCl對(duì)親本菌株和抗性突變菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.3　Effects of 0.9 mmol/L NaCl on colony diameter of parental isolates and resistant mutants

2.4禾谷鐮刀菌對(duì)其他藥劑的抗藥性

紫外誘變獲得的7株抗咯菌腈突變菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的抗性明顯低于親本菌株,對(duì)戊唑醇和嘧菌酯的抗性高于親本菌株,表明紫外誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌突變不僅對(duì)咯菌腈抗性增強(qiáng),對(duì)嘧菌酯的抗性也增強(qiáng),紫外誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌突變可導(dǎo)致多重抗藥性發(fā)生(表3)。

3　討論

咯菌腈是一種通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/組氨酸激酶磷酸化導(dǎo)致病菌死亡的殺菌劑,已廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的真菌病害[14-15]。有關(guān)該藥劑的抗藥性問題也有大量報(bào)道,如核盤菌抗性菌株對(duì)咯菌腈的抗藥性達(dá)到敏感菌株的2 000倍以上,具有較高的抗性風(fēng)險(xiǎn)[16];番茄灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗藥性是親本菌株的310倍以上,抗性風(fēng)險(xiǎn)較低[17];馬鈴薯早疫病菌對(duì)咯菌腈高度敏感,但不同地區(qū)的馬鈴薯早疫病菌對(duì)咯菌腈的EC50相差34.87倍[18],以上研究結(jié)果表明,不同病原菌對(duì)咯菌腈的敏感性不同,且抗性風(fēng)險(xiǎn)也不相同。本研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈具有高度的敏感性,EC50僅為0.016 μg/mL,通過紫外誘導(dǎo)獲得17株突變體對(duì)咯菌腈表現(xiàn)了較強(qiáng)的抗藥性,表明紫外照射可誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)生對(duì)咯菌腈抗藥性增強(qiáng)的突變體。李恒奎等[13]研究發(fā)現(xiàn)紫外誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)生抗氰烯菌酯的突變體,繼代培養(yǎng)8代后其抗藥性可穩(wěn)定遺傳;周明國(guó)等[19]研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌對(duì)多菌靈的抗性可穩(wěn)定遺傳。本研究發(fā)現(xiàn)抗性突變體繼代培養(yǎng)9代對(duì)咯菌腈的抗性水平未發(fā)生明顯變化,可穩(wěn)定遺傳,推測(cè)禾谷鐮刀菌若突變?yōu)榭剐跃陮?duì)多種化學(xué)藥劑的抗性均可穩(wěn)定遺傳。

表3　禾谷鐮刀菌抗咯菌腈突變體及其親本菌株對(duì)4種藥劑的敏感性1)

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)Duncan’s差異顯著性測(cè)定,同列中不同字母表示抗性菌株與其親本菌株之間差異顯著(P<0.05)。

Data in the table are mean±SD. Values within a column followed by different letters indicate significant variation between strains according to Duncan’s test (P<0.05).

然而美國(guó)分離的112株禾谷鐮刀菌中對(duì)咯菌腈的敏感性差異非常大,100 μg/mL的咯菌腈對(duì)抗性菌株的抑制率小于20%,且抗性菌株的致病力沒有減弱,表明在美國(guó)田地中已經(jīng)存在抗咯菌腈菌株[20]。本研究經(jīng)室內(nèi)誘變獲得了高抗咯菌腈的突變菌株,表明禾谷鐮刀菌經(jīng)紫外照射后會(huì)產(chǎn)生對(duì)咯菌腈抗性增強(qiáng)的突變菌株。然而在我國(guó)的田地中高抗咯菌腈的禾谷鐮刀菌是否已經(jīng)出現(xiàn)尚需要采集我國(guó)不同地區(qū)的禾谷鐮刀菌進(jìn)行藥劑敏感性測(cè)定。

殺菌劑的大量、連續(xù)、廣泛使用不僅會(huì)造成田間植物病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性[21],還會(huì)導(dǎo)致突變菌株對(duì)其他藥劑的抗性增強(qiáng),研究報(bào)道戊唑醇與百菌清復(fù)配可增加對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制效果;戊唑醇與多菌靈復(fù)配可破壞禾谷鐮刀菌抗性菌株細(xì)胞的滲透性[22-23]。然而關(guān)于禾谷鐮刀菌對(duì)多菌靈、戊唑醇和氰烯菌酯的抗性報(bào)道較多[11,13,19],對(duì)兩種或多種藥劑的抗性未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)紫外誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌突變不僅對(duì)咯菌腈抗性增強(qiáng),對(duì)嘧菌酯的抗性也增強(qiáng),表明紫外誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌突變可導(dǎo)致多重抗藥性發(fā)生。潘以樓等研究發(fā)現(xiàn)草莓灰霉病菌對(duì)多菌靈、腐霉利和乙霉威等藥劑產(chǎn)生多重抗藥性[24],然而紫外照射導(dǎo)致禾谷鐮刀菌多重抗藥性出現(xiàn)的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Ultraviolet induction and characteristics of Fusariumgraminearumresistant to fludioxonil

Jia Jiao,Su Qianfu,Meng Lingmin,Zhang Wei,Li Hong,Liu Wanli,Jin Qiming

(Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling136100, China)

To assess the resistance risk ofFusariumgraminearumto fludioxonil in the laboratory, 17 UV-induced mutants resistant to fludioxonil were obtained. The resistance, stability and biological characteristics of the mutants were studied. Cross-resistance of the mutants to fludioxonil, tebuconazole, difenoconazole and azoxystrobin was tested. The results showed that EC50values of the mutants to fludioxonil ranged from 72.78 μg/mL to 290.09 μg/mL and the ratio of EC50values of mutants resistant to fludioxonil, compared with that of its parental strains, was 4 000-17 000 times. The frequency of resistance mutation was 1.7×10-6and the resistance obtained was stable. The optimum temperature for the colony growth was 25℃, and the optimum pH value was 8 for both resistant isolates and their parental strains. The growth rates of resistant mutants were lower than those of their parental strains. The pigment of parental strains and resistant isolate 4 in PDA containing 0.9 mmol/L NaCl was lower than that in PDA without NaCl, but the pigment of resistant isolates 1 and 16 was higher. Fludioxonil-resistant isolates ofF.graminearumshowed moderate or high risk and have developed resistance to azoxystrobin.

fludioxonil;Fusariumgraminearum;cross-resistance

2015-08-11

2015-10-23

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(玉米)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-02); 吉林省科技廳青年科技基金(20140520158JH)

E-mail: qiming1956@163.com

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.006