謝楊春 鄧永誠(chéng) 田 黎

深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 深圳 518118

芹菜素誘導(dǎo)膀胱癌 5637細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

謝楊春 鄧永誠(chéng) 田 黎

深圳市坪山新區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 深圳 518118

目的：研究芹菜素誘導(dǎo)人膀胱癌5637細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法：采用25～100μmol/L芹菜素處理膀胱癌5637細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)分子Bax、Bcl-2和 PARP蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：芹菜素處理使細(xì)胞 Bcl-2蛋白表達(dá)降低且呈濃度依賴性，并使 Bax的表達(dá)增加和導(dǎo)致 PARP蛋白發(fā)生切割且呈濃度依賴性。結(jié)論：芹菜素能夠抑制人膀胱癌5637細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào) Bcl-2并上調(diào)Bax表達(dá)，導(dǎo)致 Bcl-2/Bax比值下降，PARP活化有關(guān)。

芹菜素；膀胱癌；細(xì)胞凋亡；機(jī)制

膀胱癌的全球發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占第9位。而在我國(guó)，膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最高發(fā)的一種惡性腫瘤。臨床上根據(jù)分期可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌［1］。其中非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌占發(fā)病率70%，其主要治療方法為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù) （transurethral resection of bladder tumor，TUR-Bt）加術(shù)后膀胱灌注化療，膀胱灌注化療常用藥物包括表柔比星、絲裂霉素、吡柔比星、阿霉素、羥基喜樹堿等［2］，雖經(jīng)過(guò)嚴(yán)格術(shù)后灌注方案，仍有20%左右的腫瘤患者術(shù)后仍會(huì)復(fù)發(fā)。而肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中有一部分患者的治療主要需采用以順鉑為主的化療方案［3］，順鉑的化療方案療效雖然敏感，但不能持久，患者5年生存率僅為 20%～40%。而且，目前常用的化療藥物存在不同程度的全身或局部毒副反應(yīng)，包括骨髓抑制、過(guò)敏反應(yīng)以及膀胱刺激征等。這些方法雖然在一定程度上取得一定的療效，但是通常給患者帶來(lái)不可逆轉(zhuǎn)的系統(tǒng)毒性以及嚴(yán)重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等［4］。因此，尋求無(wú)毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物十分迫切。

芹菜素 （5，7，4′-三羥基黃酮），是一種廣泛存在于果蔬中的一種黃酮類化合物，具有多種藥理活性［5-6］，其中以抗腫瘤活性研究較多。研究表明芹菜素在體外能夠顯著抑制多種類型的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和誘導(dǎo)其凋亡，包括：人胃癌細(xì)胞［7］、人卵 巢癌［8］、人 結(jié)腸 癌細(xì) 胞［9］、人乳 腺 癌MDA-MB-231細(xì)胞［10］、人肝癌 Hep G2細(xì)胞［11］、HeLa細(xì)胞［12］等，而其對(duì)膀胱癌細(xì)胞的作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察了芹菜素對(duì)人膀胱癌5637細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制以及誘導(dǎo)凋亡作用，探討其促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑 芹菜素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)：22806）購(gòu)自阿拉丁公司；MTT，低熔點(diǎn)瓊脂糖、二甲基亞砜 （DMSO），蛋白酶抑制劑購(gòu)自Sigma；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清 （Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購(gòu)自 GIBCO公司；人抗兔 Bax，Bcl-2，PARP抗體購(gòu)自 Santa Cruz，GAPDH抗體購(gòu)自 Abcam，BCA蛋白定量試劑盒和羊抗兔/鼠二抗購(gòu)自Pierce；PVDF膜 Millipore；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞株5637購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，于 37℃、5%CO2、95%O2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)芹菜素對(duì)膀胱癌細(xì)胞5637增殖的影響 將5637細(xì)胞以3×103/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后每孔分別加入100μL不同濃度的芹菜素 （25、50、75和 100μmol/L），每個(gè)濃度設(shè) 4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組 （加同體積的DMSO），細(xì)胞培養(yǎng)72h后，向每孔加入20μL 5.0 g/L 的MTT后繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄上清，向每孔中加入200μL DMSO溶解結(jié)晶紫，置于搖床振蕩 30min，至藍(lán)紫色顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔吸光度值（A），并計(jì)算細(xì)胞增殖率（%）=（藥物處理孔A值-空白孔A值）/（對(duì)照孔 A值-空白孔 A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將5637細(xì)胞以2×106/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的芹菜素 （50、75、100μmol/L），處理24h后收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1×106/mL，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清液。加入100μL染料結(jié)合緩沖液重懸后，加入 10μL AnnexinVFITC染色，混勻后室溫避光靜置15min，然后加入200μL的染料結(jié)合緩沖液和5μL PI染液 （50mg/ L），靜置5min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

2.3 Western blotting檢測(cè) Bax、Bcl-2和 PARP蛋白表達(dá) 將 5637細(xì)胞以2×105/孔接種于 6孔板中，以 75、100μmol/L芹 菜 素作用 細(xì) 胞24h后，收集細(xì)胞，在每管細(xì)胞中加入 100μL的蛋白裂解液后，BCA法進(jìn)行總蛋白定量，每泳道上 樣 量 為40μg總蛋 白，經(jīng) 10% SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。一抗稀釋濃度分別為：Bax（1∶3000）、Bcl-2（1∶2000）、PARP（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）。羊抗兔/鼠二抗為 1∶5000稀釋。ECL化學(xué)發(fā)光液，X光片暗室曝光、顯影及定影。采用 WO-9413B型凝膠成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著性比較采用 t檢驗(yàn)，以 P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 芹菜素對(duì)5637細(xì)胞增殖的抑制作用 為了研究芹菜素對(duì)膀胱癌細(xì)胞增值的作用，采用不同濃度芹菜素 （25、50、75和 100μmol/L）處理膀胱癌5637細(xì)胞48 h后，采用MTT法檢測(cè)各個(gè)組細(xì)胞增值效率，研究結(jié)果顯示，不同濃度芹菜素處理的細(xì)胞的增殖均受到不同程度的抑制，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異 （P＜0.05，圖 1）。芹菜素對(duì) 5637細(xì)胞增殖的抑制作用呈一定的濃度依賴性，采用不同濃度 （25、50、75和100μmol/L）芹菜素處理后，隨著處理濃度的增加，其抑制效果更明顯。芹菜素對(duì) 5637細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)濃度依賴的特征。

圖1 不同濃度的芹菜素對(duì)5637細(xì)胞增值的抑制效率

3.2 Annexin V/PI 雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)芹菜素誘導(dǎo) 5637細(xì)胞的凋亡率為了研究芹菜素對(duì)膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡的作用，根據(jù) MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用不同濃度芹菜素 （50、75和 100μmol/L）處理膀胱癌5637細(xì)胞24 h后，采用 Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)各個(gè)組細(xì)胞的凋亡效率，研究結(jié)果顯示 （圖 2和圖 3），0、50、75和 100 μmol/L芹菜素處理組細(xì)胞凋亡率分別為 （2.3± 0.8）%、 （14.3±2.9）%、 （20.0±5.9）%和（63.8±6.2）%，與對(duì)照組相比差異顯著 （P＜0.05）。隨著芹菜素處理濃度的增加，其誘導(dǎo)膀胱癌5637細(xì)胞凋亡效率效果更明顯，提示芹菜素對(duì)5637細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)具有劑量依賴性。

圖2 Annexin-v與PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)芹菜素對(duì)5637細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)

圖3 Annexin-V與PI雙標(biāo)記不同濃度的芹菜素 對(duì)5637細(xì)胞凋亡有道檢測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.3 芹菜素對(duì)Bax、Bcl-2和 PARP蛋白表達(dá)的影響 為了探討芹菜素對(duì)膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制，采用不同濃度芹菜素 （75和 100 μmol/L）處理膀胱癌5637細(xì)胞24h后，采用Western-blotting檢測(cè)各個(gè)組細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，研究結(jié)果顯示，75和 100μmol/L芹菜素芹菜素處理5637細(xì)胞 24h后，進(jìn)行蛋白檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，隨著濃度增加，Bax蛋白表達(dá)逐漸增加，PARP蛋白的切割水解亦逐漸增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低，因此 Bcl-2/Bax比值逐漸下降（圖4）。隨著芹菜素處理濃度的增加，膀胱癌5637細(xì)胞中，Bcl-2與剪切的 PARP蛋白表達(dá)量逐漸降低，Bax蛋白表達(dá)量逐漸增高，結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示芹菜素對(duì) 5637細(xì)胞的凋亡可能是通過(guò)上調(diào)Bax和下調(diào) Bcl-2蛋白表達(dá)，激活 PARP的活性，從而誘導(dǎo) 5637細(xì)胞的凋亡，并且這種誘導(dǎo)效應(yīng)具有劑量依賴性。

圖4 不同濃度的芹菜素作用5637細(xì)胞后，Bax、 Bc1-2和PARP蛋白表達(dá)

4 討論

芹菜素是具有多種生物活性的黃酮類化合物，多項(xiàng)研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，芹菜素對(duì)體內(nèi)、外多種癌細(xì)胞具有殺傷作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，主要通過(guò)如 Rb、p53及周期蛋白依賴性激酶抑制因子如p15、p16、p21等［13］?？拱┗钚允乔鄄怂氐闹饕钚灾唬?xì)胞凋亡是基因調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，凋亡異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。細(xì)胞凋亡敏感性主要取決于于多種凋亡相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的水平及相互作用，存在著多種控制細(xì)胞凋亡的復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)。

體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)主要是由于對(duì)機(jī)體正常調(diào)控機(jī)制的逃逸來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞正常的凋亡調(diào)控機(jī)制受到嚴(yán)格的控制。對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株，芹菜素以濃度及時(shí)間依賴性的方式誘導(dǎo)出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、染色體凝集及DNA碎裂等特征性凋亡檢測(cè)標(biāo)志。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡最早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，這一變化早于細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃縮、DNA片斷化和細(xì)胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此 AnnexinV被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。本研究采用Annexin-V熒光與PI雙染色技術(shù)在 5637細(xì)胞中也獲得同樣結(jié)論。芹菜素能抑制人膀胱癌 5637細(xì)胞生長(zhǎng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

Bcl-2和 Bax基因家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［14］，Bcl-2和Bax蛋白之間的比例影響著細(xì)胞對(duì)各種凋亡誘導(dǎo)分子的敏感性，直接決定下游Caspases活化與否，從而決定凋亡是否發(fā)生。PARP正是 Caspase的切割底物，切割過(guò)的PARP不能正常發(fā)揮功能，引起 DNA的斷裂［15］。PARP切割降解是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志之一。通過(guò)Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)75、100μmol/L芹菜素處理后，PARP的切割增加，并且這種增加是濃度依賴性的。Bcl-2表達(dá)量多，細(xì)胞易于存活，而當(dāng)Bax表達(dá)量過(guò)多時(shí)，容易形成 Bax同源二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞容易發(fā)生凋亡。通過(guò)Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)75、100μmol/L芹菜素可降低 Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)增加 Bax的表達(dá)，且隨著濃度的增加增加/抑制的效果更加明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芹菜素誘導(dǎo)膀胱癌 5637細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與上調(diào) Bax和下調(diào) Bcl-2的表達(dá)，導(dǎo)致 Bcl-2/Bax比值下降，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Mechanism of apigenin on apoptosis of human bladder cancer 5637 cells

XIE Yangchun DENG Yongcheng TIAN Li Guangdong Provincial Shenzhen City Pingshan District Pepole′s Hospital，Shenzhen，518118，China

Objective To study the mechanism of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637.Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin，and MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates.The expressions of apoptosis-related proteins Bax，Bcl-2 and PARP were analyzed by Western blotting.Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells.Western blotting demonstrated that apigenin increased the protein levels of Bax and PARP cleavage and reduced the protein expression of Bcl-2.Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells possibly by up-regulating the Bax expression，enhancing PARP cleavage，downregulating the Bcl-2 expression and resulting in the Bcl-2/Bax ratio decreased.

Apigenin；Bladder cancer；Apoptosis；Mechanism

R285.5

A

1007-8517（2016）14-0025-04

2016.05.03）

廣東省深圳市龍崗區(qū)科技計(jì)劃醫(yī)療衛(wèi)生 （扶持類）基金 （編號(hào)：201406113001012）

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謝楊春（1979-），男，碩士，主治醫(yī)生，從事中醫(yī)藥治療泌尿科疾病相關(guān)研究工作。E-mail：xieyc123@163.com