熊　斌，　王楊科,　魏　楊

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

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潔廁液對中華蟾蜍蝌蚪急性毒性及生長發(fā)育的影響

熊斌，王楊科,魏楊

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

依據(jù)急性毒理實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，用簡化機(jī)率單位法計(jì)算潔廁液對中華蟾蜍(Bufogargarizans)蝌蚪毒性的半數(shù)致死濃度(LC50)。設(shè)計(jì)亞急性實(shí)驗(yàn)(空白、7、14、28、56 μL/L)，研究低劑量潔廁液對蝌蚪生長發(fā)育的影響。急性毒理實(shí)驗(yàn)得出24、48、72、96 h的潔廁液對蝌蚪LC50為107.71、74.63、73.74、70.99 μL/L。亞急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組隨著潔廁液濃度的上升，蝌蚪生長發(fā)育受到不同程度的抑制。在第10天，7、14 μL/L濃度組和空白對照組中蝌蚪處于27期，28、56 μL/L濃度組中蝌蚪處于26期。第20天，對照組的蝌蚪已進(jìn)入37期，7 μL/L濃度組處于36期，14、28 μL/L濃度組中蝌蚪處于34期，56 μL/L濃度組中蝌蚪處于32期。重復(fù)測量方差分析表明，潔廁液濃度和處理時(shí)間對蝌蚪體重體長有極顯著影響(P<0.01)。因此，潔廁液對中華蟾蜍(Bufogargarizans)蝌蚪具有高毒性，并且抑制其生長發(fā)育。

潔廁液；毒理實(shí)驗(yàn)；半數(shù)致死濃度；生長發(fā)育；兩棲動(dòng)物

隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類生存環(huán)境面臨著嚴(yán)峻的考驗(yàn)，地球水環(huán)境污染是其中之一。目前，世界面臨著水資源短缺、污染嚴(yán)重的兩大挑戰(zhàn)[1-3]。隨著工業(yè)環(huán)保力度加強(qiáng)、城市化普及，生活污水成為水體的主要污染源，大量生活污水未經(jīng)處理直接進(jìn)入水體造成環(huán)境污染。洗滌劑的普遍大量使用[4-6]，導(dǎo)致生活污水的危害性急劇增加，嚴(yán)重污染了自然水體，降低了濕地生物多樣性，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失[7-8]，對人類健康造成威脅[9]。目前，針對生物污水的特征，研究出了快速準(zhǔn)確的化學(xué)分析方法[10]。此類方法能檢測污染物的種類和濃度，但是難以評價(jià)其生態(tài)毒性。因此，迫切需要用水毒理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法來彌補(bǔ)其不足[11]。蝌蚪在水中發(fā)育，對水質(zhì)極其敏感，在大自然中普遍存在，采集養(yǎng)殖管理容易。因此，蝌蚪是評價(jià)水體污染的重要生物[12]。

現(xiàn)今，大部分生活污水來源于廁所的污水，而潔廁液的主要成分是鹽酸、表面活性劑、香精、緩蝕劑和助劑等。潔廁液的大量使用加上其強(qiáng)酸強(qiáng)腐蝕性，能夠改變自然水體的pH和成分[13]，從而造成大量的生物死亡，對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對上述問題，本文研究潔廁液對蝌蚪急性毒性及生長發(fā)育的影響，旨在為潔廁液的使用和新型無污染或低污染洗滌劑研究提出建議，并為相關(guān)環(huán)境評價(jià)提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及材料

潔廁液，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/YQXB78，主要成分：無機(jī)酸、表面活性劑、增稠劑、香精，上海莊臣有限公司。

蝌蚪捕撈于自然水體的池塘，經(jīng)顯微鏡鑒定為中華蟾蜍(Bufogargarizans)，發(fā)育時(shí)期大體為21期[14]。用曝氣的自來水馴養(yǎng)7 d，期間每兩天喂食一次雞蛋黃。挑選大小均勻、發(fā)育時(shí)期相同的蝌蚪作為實(shí)驗(yàn)體。

1.2急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3慢性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1染毒

采用靜水養(yǎng)殖法[15]，設(shè)置一空白組，另外根據(jù)潔廁液對蝌蚪急性毒性實(shí)驗(yàn)4d半數(shù)致死濃度(70.988μL/L)設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和3個(gè)平行組，潔廁液濃度分別為7、14、28、56μL/L和空白對照組。根據(jù)密度對蝌蚪生長發(fā)育的影響[16]，設(shè)定每個(gè)水族箱里喂養(yǎng)60只蝌蚪，室溫(25 ℃)，每組的潔廁液溶液為10L，檢測時(shí)間分別為5、10、15、20、25d。在此期間每天更換相應(yīng)溶液3L，并保持實(shí)驗(yàn)濃度一致。實(shí)驗(yàn)期間每隔兩天喂食雞蛋黃一次，其中穿插喂食磨碎的青菜以補(bǔ)充相應(yīng)的維生素[17]。

1.3.2觀察發(fā)育時(shí)期、量體長與稱量體重

觀察發(fā)育時(shí)期：依據(jù)文獻(xiàn)[14]中實(shí)驗(yàn)方法，將蝌蚪放在培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下觀察蝌蚪的特征，根據(jù)特征進(jìn)行分期并記錄。

測量體長：將鑒定完發(fā)育時(shí)期的蝌蚪放在濾紙上，使用玻璃分針盡量將其身體舒展成一條直線，用透明直尺進(jìn)行測量并記錄。

稱量體重：用玻璃分針撥動(dòng)在濾紙上的蝌蚪，濾干蝌蚪身上的水分，將蝌蚪放在調(diào)節(jié)好的電子天平中，待讀數(shù)穩(wěn)定后進(jìn)行記錄。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)急性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過SPSS19.0軟件運(yùn)用簡化機(jī)率單位法計(jì)算其LC50和95%置信區(qū)間[18]。慢性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用重復(fù)測量方差方法分析處理慢性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，P<0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異界限，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1潔廁液對蝌蚪的急性毒性實(shí)驗(yàn)

急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在處理24h后，潔廁液對蝌蚪的LC50為107.71μL/L；處理48h后，潔廁液對蝌蚪的LC50為74.63μL/L；處理72h后，潔廁液對蝌蚪的LC50為73.74μL/L；處理96h后，潔廁液對蝌蚪的LC50為70.99μL/L。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1，可見，潔廁液對蝌蚪有很高的毒性。

表1　潔廁液對蝌蚪的急性毒性實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2潔廁液對蝌蚪發(fā)育時(shí)期的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行過程中不僅存在蝌蚪體重、體長的變化，還伴隨著蝌蚪發(fā)育時(shí)期的變化。在實(shí)驗(yàn)開始階段蝌蚪的發(fā)育時(shí)期基本處于21期。在實(shí)驗(yàn)過程中由于潔廁液添加量的不同，對蝌蚪的發(fā)育時(shí)態(tài)也造成了一定的影響。在第10天的觀察過程中發(fā)現(xiàn)空白對照組、7、14 μL/L濃度組中蝌蚪處于27期，28、56 μL/L濃度組中蝌蚪處于26期；第20天時(shí)發(fā)現(xiàn)對照組的蝌蚪已進(jìn)入37期，7 μL/L濃度組處于36期，14、28 μL/L濃度組中蝌蚪處于34期，56 μL/L濃度組中蝌蚪處于32期。

2.3潔廁液對蝌蚪體重、體長的影響

圖1統(tǒng)計(jì)了在0、7、14、28、56 μL/L的潔廁液溶液中蝌蚪體重隨時(shí)間變化的柱狀圖。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到，第5天的數(shù)據(jù)顯示空白對照組與4組實(shí)驗(yàn)組相比較體重下降均為顯著(P<0.05)；7 μL/L的實(shí)驗(yàn)組與56 μL/L的實(shí)驗(yàn)組相比較，體重下降顯著(P<0.05)；14 μL/L的實(shí)驗(yàn)組與56 μL/L的實(shí)驗(yàn)組比較，體重下降顯著(P<0.05)。在第10天時(shí)，空白組與實(shí)驗(yàn)組相比較，體重下降顯著(P<0.05)；7 μL/L的實(shí)驗(yàn)組與56 μL/L的實(shí)驗(yàn)組相比較，體重下降顯著(P<0.05)。第15、20、25天的空白組與實(shí)驗(yàn)組比較，體重下降均為顯著；7 μL/L的實(shí)驗(yàn)組與56 μL/L的實(shí)驗(yàn)組相比較，體重下降顯著(P<0.05)?？梢姖崕簩︱蝌降捏w重產(chǎn)生了一定的抑制效應(yīng)。

圖1　潔廁液濃度對蝌蚪體重柱狀圖

蝌蚪體重實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝌蚪體重的增長隨著潔廁液濃度的增加而產(chǎn)生抑制現(xiàn)象，第5、10、15、20、25天時(shí)最高的抑制率分別為55.35%、63.02%、43.95%、45.65%、58.34%。隨著濃度升高和時(shí)間的延續(xù)，潔廁液溶液濃度越高對蝌蚪體重產(chǎn)生的抑制現(xiàn)象越明顯。重復(fù)測量方差分析(表2)表明，潔廁液濃度和處理時(shí)間對蝌蚪體重、體長有極顯著影響(P<0.01)。

表2　潔廁液對蝌蚪體重、體長的重復(fù)測量方差分析結(jié)果

圖2為體長統(tǒng)計(jì)圖，潔廁液對蝌蚪體長的影響與對體重的形象相似，潔廁液的濃度越高對體長的抑制作用越明顯。

圖2　潔廁液對蝌蚪體長影響曲線圖

3　討　論

化學(xué)品對水生生物的毒性信息被作為化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)和篩選優(yōu)先測試污染物的關(guān)鍵指標(biāo)之一。急性毒性實(shí)驗(yàn)是一種評價(jià)受試物毒性的方法，評價(jià)結(jié)果用半數(shù)致死濃度表示。半數(shù)致死濃度，通常用在預(yù)定時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致50%被暴露個(gè)體死亡的濃度(半數(shù)致死濃度，LC50)來表示劑量反應(yīng)關(guān)系。潔廁液對中華蟾蜍(Bufogargarizans)蝌蚪的急性毒理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，潔廁液對蝌蚪24 h的LC50為107.7.6 μL/L，48 h的LC50為74.625 μL/L，72 h的LC50為73.742 μL/L，96 h的LC50為70.99 μL/L?？梢?，潔廁液對中華蟾蜍(Bufogargarizans)蝌蚪屬于高毒性物質(zhì)。

兩棲類動(dòng)物對環(huán)境較敏感，目前關(guān)于環(huán)境污染物對兩棲類生長發(fā)育的研究比較多[19-22]，蝌蚪在生長發(fā)育過程中要經(jīng)歷變態(tài)過程，在此期間蝌蚪對外界條件更為敏感，如水質(zhì)、溫度、密度、光照均對其變態(tài)發(fā)育有較大的影響[23]。在變態(tài)的過程中，性狀的丟失在幾周內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，沒有靜止階段，其過程受甲狀腺素和促乳激素調(diào)節(jié)[24]。研究表明，重金屬離子、洗滌用品[25]、農(nóng)藥對兩棲類幼體蝌蚪的生長發(fā)育有著不同程度的抑制作用，嚴(yán)重的出現(xiàn)畸形甚至死亡[26-28]。潔廁液對蝌蚪的慢性毒理實(shí)驗(yàn)表明，蝌蚪暴露于0、7、14、28、56 μL/L的潔廁液溶液中，隨著蝌蚪生長發(fā)育的進(jìn)行，體重體長均有增加，但隨著潔廁液濃度增加，抑制蝌蚪生長效果愈發(fā)明顯。潔廁液對蝌蚪的發(fā)育時(shí)期有很明顯的抑制效果。此外，水體酸堿度對水生動(dòng)物幼體的影響已有多人進(jìn)行研究[29]，可見酸堿度對蝌蚪的生長發(fā)育有一定的抑制現(xiàn)象，在一定范圍內(nèi)pH值越小抑制現(xiàn)象也就越明顯，在pH值小于4的條件下則可能直接導(dǎo)致動(dòng)物死亡[30]。由此可見，潔廁液對蝌蚪生長發(fā)育的抑制作用還可能與潔廁液中有機(jī)酸改變了水體pH值有關(guān)。

潔廁液溶液對蝌蚪體長的影響隨著濃度的增加而受到抑制，隨著時(shí)間的延長和潔廁液濃度的增加，蝌蚪受到的抑制作用就越明顯，這表明潔廁液在蝌蚪體內(nèi)有一定的積蓄作用。結(jié)合前人的研究及本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[31]，認(rèn)為蝌蚪體重體長抑制及發(fā)育遲緩的原因可能為：一是潔廁液導(dǎo)致體內(nèi)各種系統(tǒng)的損傷，修復(fù)體內(nèi)損傷需要消耗大量的能量，抑制了蝌蚪的生長；二是酸性環(huán)境干擾內(nèi)分泌(例如甲狀腺激素、促乳激素)的活動(dòng)影響蝌蚪的生長發(fā)育，延遲發(fā)育[32]；三是潔廁液中所含有的表面活性劑導(dǎo)致蝌蚪活動(dòng)異常，不能獲取足夠的能量維持蝌蚪的正常生長發(fā)育；四是潔廁液改變了水體pH環(huán)境從而影響了酶活性，導(dǎo)致蝌蚪生長發(fā)育遲緩[33]。

綜上所述，生活污水對兩棲類幼體的影響不僅體現(xiàn)在短期的急性致死方面，低劑量的潔廁液仍會(huì)對其生長發(fā)育造成潛在、隱蔽的影響。本實(shí)驗(yàn)從宏觀指標(biāo)上研究了潔廁液對蝌蚪的影響，未深入探討其影響的作用機(jī)制，也不清楚潔廁液組分中哪些成分是影響生長發(fā)育的主要因素，后續(xù)可在細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步研究相關(guān)問題。

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[責(zé)任編輯：李 莉]

Effects of toilet cleaner on acute toxicologic and growth development in tadpole ofBufogargarizans

XIONG Bin,WANG Yang-ke,WEI Yang

(School of Bioscience and Engineering， Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong 723000, China)

According to the method of acute toxicologic experimentation, tadpoles (Bufogargarizans) were exposed to different concentrations of toilet cleaner, and LC50of toilet cleaner to tadpole(Bufogargarizans) was calculated by simplified probability unit method. And 5 groups for subacute toxicity test (blank control, 7, 14, 28, 56 μL/L) were setted to investigate toilet cleaner impact on growth and development of tadpole (Bufogargarizans).The result of subacute toxicity test were differencet by groups.The times(24, 48, 72, 96 h) of LC50were 107.71, 74.63, 73.74, 70.99 μL/L. The development period of groups(blank control, 7, 14 μL/L) were 27th, and groups(28, 56 μL/L) were 26th at 10th day; blank control were 37th, 7 μL/L were 36th, groups(14, 28 μL/L) were 34th, 56 μL/L were 32th on the 20th day. that 20th day. The concentration of Toilet Cleaner and treat time possessed significant effect on weight and length of body on tadpole by repeated measures data of ANOVA (P<0.01). Obviously, toilet cleaner is of high toxicity and inhibits the growth and development to tadpole(Bufogargarizans).

toilet cleaner;toxicological experiment;LC50;growth development;amphibian

1673-2944(2016)04-0060-05

2015-10-29

2016-04-03

熊斌(1988—)，男，陜西省安康市人，陜西理工大學(xué)碩士研究生，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物生理生態(tài)；[通信作者]王楊科(1961—)，男，陜西省澄城縣人，陜西理工大學(xué)教授，碩士，主要研究方向?yàn)樯韺W(xué)、藥理學(xué)。

X171.5; Q959.5+3

A