寇　芳,康麗君,張莉莉,尹　婧,李文杰,王維浩,2,夏天天,寧冬雪,曹龍奎,2,*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 國家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

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酵母菌與乳酸菌發(fā)酵對小米淀粉粘度的影響

寇芳1,康麗君1,張莉莉1,尹婧1,李文杰1,王維浩1,2,夏天天1,寧冬雪1,曹龍奎1,2,*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院 國家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

自然發(fā)酵受環(huán)境和微生物的影響大,難實(shí)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。故研究自然發(fā)酵優(yōu)勢菌對小米淀粉的影響很有必要。選取內(nèi)蒙古赤峰生產(chǎn)的黃金苗小米為原料,利用自然發(fā)酵純化的酵母菌與乳酸菌為菌種進(jìn)行純種發(fā)酵96 h,并且與自然發(fā)酵后的小米淀粉比較,分析淀粉的粘度、衰減值和回生值的變化。采用0.2 g/100 mL的NaOH溶液提取3 h的方法來提取發(fā)酵后小米中的淀粉,并對其發(fā)酵液中固形物的含量、pH、淀粉的粘度特性、偏光十字進(jìn)行測定。結(jié)果表明,三種發(fā)酵方法所得的發(fā)酵液中總固形物的含量都增加;較自然發(fā)酵相比,發(fā)酵前24 h乳酸菌和酵母菌發(fā)酵液中的pH下降迅速,之后變化緩慢;淀粉粘度特性表明,乳酸菌和酵母菌發(fā)酵終止時(shí),其粘度的起始溫度、衰減值、回生值較自然發(fā)酵相比都下降,峰值粘度較自然發(fā)酵相比都上升,乳酸菌發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵的最終粘度與自然發(fā)酵相比有所增加,偏光十字顯示無論是自然發(fā)酵酵母菌發(fā)酵還是乳酸菌發(fā)酵,發(fā)酵后的淀粉顆粒仍具有偏光十字,說明發(fā)酵未改變淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

小米淀粉,自然發(fā)酵,酵母菌發(fā)酵,乳酸菌發(fā)酵,粘度特性

小米中碳水化合物占小米總重的63%～70%,其中淀粉占56%～61%[1],蛋白質(zhì)含量為9.28%,其蛋白質(zhì)的消化率為83.4%[2]。市場上用發(fā)酵法制得的小米產(chǎn)品不僅可以改善小米制品的成團(tuán)性,還可以改善小米制品的口感和風(fēng)味。此外在發(fā)酵過程中,還會產(chǎn)生許多小分子物質(zhì)如單糖、雙糖、游離脂肪酸、乳酸、醋酸等[3]。因此研究自然發(fā)酵中優(yōu)勢菌對小米淀粉粘度的影響具有非常廣闊的發(fā)展前景。

自然發(fā)酵過程中的微生物主要是為細(xì)菌、酵母菌以及少量霉菌等[4]。通過實(shí)踐發(fā)現(xiàn),自然發(fā)酵過程中微生物的菌群變化,主要以乳酸菌和酵母菌居多,而霉菌主要在發(fā)酵液表面,且數(shù)量相對酵母菌和乳酸菌少。并且乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中一直占有絕對優(yōu)勢,是自然發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌種。利用自然發(fā)酵過程中篩選并鑒定出的乳酸菌和酵母菌為菌種將小米發(fā)酵96 h,通過對比自然發(fā)酵與乳酸菌和酵母菌的發(fā)酵過程中小米淀粉的粘度特性,來探討自然發(fā)酵過程中兩種菌的發(fā)酵機(jī)理。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

小米黃金苗小米(內(nèi)蒙古赤峰小米);氫氧化鈉天津市大茂化學(xué)試劑廠;鹽酸廣州萬從化工有限公司;其它試劑皆為國產(chǎn)分析純。

AR2140型分析天平瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;S220型pH計(jì)瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL16B型臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠制造;DGG-9053A型恒溫箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;MJ-10A型磨粉機(jī)上海市浦恒信息科技有限公司;RVA4500型快速黏度分析儀瑞典波通儀器公司;RVA專用攪拌槳瑞典波通儀器公司;RVA專用鋁盒瑞典波通儀器公司;NP-80系列透反射偏光顯微鏡寧波永新光學(xué)股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)酵小米樣品制備

1.2.1.1菌種制備小米與水的比例為1∶1.2(g/mL)加入蒸餾水,30 ℃下自然發(fā)酵96 h后,從發(fā)酵液中篩選出優(yōu)勢微生物菌群,通過分離純化和生理生化鑒定其為乳酸菌和酵母菌,并將優(yōu)勢菌擴(kuò)大培養(yǎng)。具體方法為:乳酸菌純化并鑒定后,接種至MRS液體培養(yǎng)基在37 ℃下增殖培養(yǎng)24～48 h,直到乳酸菌菌懸液濃度達(dá)到5×108cfu/mL。酵母菌純化鑒定后,接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基上28 ℃下增殖培養(yǎng)24～48 h,直到酵母菌菌懸液濃度達(dá)到5×108cfu/mL。

1.2.1.2發(fā)酵小米乳酸菌和酵母菌發(fā)酵:每種發(fā)酵分別取4份小米,每份150 g,用滅菌蒸餾水清洗三遍后置于500 mL燒杯中,加入無菌蒸餾水(小米與無菌水的比例為1∶1.2 g/mL)。吸取擴(kuò)大培養(yǎng)后的微生物菌懸液(乳酸菌,酵母菌)5 mL接種到小米中,用保鮮膜密封,分別在最適溫度(乳酸菌37 ℃,酵母菌28 ℃)下培養(yǎng)96 h進(jìn)行發(fā)酵。

自然發(fā)酵:取小米150 g,按小米與水的比例為1∶1.2(g/mL)加入蒸餾水,30 ℃下自然發(fā)酵96 h。

1.2.1.3發(fā)酵小米淀粉的制備將發(fā)酵完并且過篩后的小米用0.2 g/100 mL的NaOH溶液,料液比1∶3(g/mL),提取3 h,3000 r/min的離心機(jī)離心10 min,棄去上清液,剝刮除去沉淀區(qū)中上層黃褐色的物質(zhì),水洗,連續(xù)離心,剝刮,水洗,直至淀粉漿呈白色。用1 mol/L HCl調(diào)漿至pH7.0中性,離心,30 ℃干燥,過80目篩,即得淀粉成品。

1.2.2發(fā)酵過程中固形物含量的測定每隔24 h分別從上述發(fā)酵方式中取出一份發(fā)酵樣品,用移液管分別吸取10 mL的發(fā)酵液于恒重的坩堝中,105 ℃烘至恒重。

固形物的含量(g/mL)=(m2-m1)/10

式中,m1為坩堝的質(zhì)量,m2為加入發(fā)酵液后烘至恒重的坩堝質(zhì)量。

1.2.3發(fā)酵過程中pH的測定每隔24 h用pH計(jì)分別測量每個(gè)樣品發(fā)酵液的pH。

1.2.4粘度特性的測定利用快速粘度分析儀(RVA)測試小米淀粉糊粘度。稱取樣品3.500 g(干基)于樣品盒中,加水25 mL,35 ℃保溫3 min,以6 ℃/min的速率加熱到95 ℃,保溫5 min,以6 ℃/min的速率降溫到50 ℃。用儀器配套的軟件分析得到曲線。

1.2.5淀粉偏光十字的測定配成1%的淀粉懸液,混勻使淀粉顆粒充分分散,滴1滴于潔凈的載玻片上,置于偏光顯微鏡的載物臺上觀察不同發(fā)酵處理的小米淀粉,并拍攝其照片。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用excel軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵過程中固形物的測定

小米在發(fā)酵的過程中,因?yàn)榻菀约拔⑸锞寒a(chǎn)酸產(chǎn)酶的緣故,使得小米中的物質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的延長而溶出,固形物含量的變化反映了小米中物質(zhì)的溶出情況,不同發(fā)酵處理過程中的固形物含量的變化如圖1所示。

圖1　總固形物含量的變化 Fig.1　The variation in content of total solids

根據(jù)圖1可知,不同處理小米發(fā)酵液中總固形物含量都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加,但酵母菌發(fā)酵液固形物的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈先快速增加后緩慢增加的趨勢。而乳酸菌發(fā)酵和自然發(fā)酵的總固形物含量在逐步增加。說明發(fā)酵可使小米中部分物質(zhì)分解或溶出,使發(fā)酵液中總固形物含量增加。發(fā)酵液中總固形物含量的增加一方面由于發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)生的酸和酶作用于小米的無定形區(qū),使小米中一些大分子及不溶性的物質(zhì)被分解成小分子物質(zhì),被微生物利用或溶解在發(fā)酵液中;另一方面是由于小米在發(fā)酵的過程中一直浸泡在發(fā)酵液中,使得小米中可溶性的蛋白、脂類及其他成分溶解到發(fā)酵液中。所以無論哪種發(fā)酵方式,其發(fā)酵液中的總固形物的含量都會有所增加。

表1　不同發(fā)酵RVA譜特征值

注:Z代表自然發(fā)酵,R代表乳酸菌發(fā)酵,J代表酵母菌發(fā)酵，圖中標(biāo)有不同字母的回生值表示該發(fā)酵類型隨發(fā)酵時(shí)間的延長其回生值差異顯著(p<0.05)。

2.2發(fā)酵過程中pH的測定

不同微生物菌群在發(fā)酵過程中,發(fā)酵液pH的變化情況如圖2所示。

圖2　發(fā)酵過程中pH的測定Fig.2　The determination of pH in the fermentation process

由圖2可知,對于自然發(fā)酵來說,其發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)酸的能力相對較弱。在發(fā)酵的前48 h,發(fā)酵液的pH下降到4.5以下,之后的發(fā)酵過程中pH下降的速度非常緩慢。與自然發(fā)酵相比,乳酸菌在發(fā)酵的前24 h,發(fā)酵液中的pH急劇下降,其pH可達(dá)到4.0以下,而發(fā)酵24 h以后,其pH的下降的趨勢趨于平緩。說明在發(fā)酵的前24 h,乳酸菌迅速增長,代謝活動旺盛,并大量產(chǎn)酸,使得發(fā)酵液產(chǎn)生比較柔和的酸味,有效的抑制了雜菌的生長。而酵母菌在發(fā)酵的前24 h,其發(fā)酵液的pH迅速下降至4.5左右,并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,其pH在逐漸降低。但與乳酸菌相比,其pH下降的趨勢要小于乳酸菌。同乳酸菌發(fā)酵相比,酵母菌發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生柔和的酒香。

2.3粘度特性的測定

對比自然發(fā)酵,酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵不同發(fā)酵時(shí)間對小米淀粉粘度特性的影響如表1所示。

用excel軟件對三種不同發(fā)酵方式所得小米淀粉的回生值進(jìn)行相關(guān)性分析,可得到回歸方程如下:

y=5.6042x+1888(R2=0.99886)

式(1)

y=-149.8x+2279(R2=0.9955)

式(2)

式(1)代表自然發(fā)酵小米粉其回生值隨發(fā)酵時(shí)間變化的回歸方程,由式(1)可以看出發(fā)酵時(shí)間對自然發(fā)酵回生值的影響呈正相關(guān);式(2)代表乳酸菌發(fā)酵隨發(fā)酵時(shí)間的變化其回生值的回歸方程,由式(2)可以看出發(fā)酵時(shí)間對乳酸菌發(fā)酵回生值的影響呈負(fù)相關(guān)。

表2　不同發(fā)酵第4d的粘度特性

圖3　粘度特性的測定Fig.3　The determination of viscosity characteristics注：1.乳酸菌發(fā)酵,2.酵母菌發(fā)酵,3.自然發(fā)酵。

表1可以看出,發(fā)酵時(shí)間對自然發(fā)酵,乳酸菌發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵小米淀粉的糊化溫度的影響較小,其變異系數(shù)分別為0.01%和0.01%,0.01%。自然發(fā)酵淀粉的糊化溫度在發(fā)酵前48 h先下降后上升,而酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵在發(fā)酵的第72 h糊化溫度下降,之后上升。但無論是乳酸菌發(fā)酵還是酵母菌發(fā)酵,在發(fā)酵終止時(shí)其糊化溫度都比自然發(fā)酵時(shí)的糊化溫度要低。其原因可以解釋為發(fā)酵使部分蛋白質(zhì)分解或溶出[5],消除了一些蛋白對淀粉糊化的阻礙作用,因而淀粉顆粒在糊化時(shí)更容易吸水膨脹,促進(jìn)了淀粉的糊化使糊化溫度降低[6];自然發(fā)酵的峰值粘度隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸降低,而酵母菌和乳酸菌在發(fā)酵的前72 h其峰值粘度逐漸下降,之后呈上升趨勢。但無論是乳酸菌發(fā)酵還是酵母菌發(fā)酵,其發(fā)酵前72 h峰值粘度都比自然發(fā)酵要低。其峰值黏度的減小可能是因?yàn)榈矸蹮o定形區(qū)支鏈淀粉的斷鏈與脫支所引起的。峰值黏度的降低是由于發(fā)酵后淀粉在熱水中的可溶性更大或發(fā)酵過程中產(chǎn)生更短鏈淀粉所引起的;從表1可以看出發(fā)酵時(shí)間對乳酸菌發(fā)酵淀粉的衰減值影響相對較大,而對酵母菌發(fā)酵的影響相對較小。自然發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵前72 h的衰減值都呈下降趨勢,而乳酸菌發(fā)酵則一直呈下降的趨勢,并且在發(fā)酵的過程中酵母菌和乳酸菌發(fā)酵的衰減值都比自然發(fā)酵過程中的衰減值小;發(fā)酵時(shí)間對自然發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵回生值的影響差異顯著,對酵母菌發(fā)酵的回生值影響相對于二者較小,但三種發(fā)酵方式的變異系數(shù)較小。自然發(fā)酵的回生值逐漸增大,酵母菌的回生值在發(fā)酵的前72 h先減小之后增大,而乳酸菌的回生值則一直減小。發(fā)酵所產(chǎn)的酸和酶作用于淀粉顆粒的無定形區(qū),使支鏈淀粉長鏈斷鏈,從而降低了單個(gè)支鏈淀粉分子的分支化程度,降低了淀粉再結(jié)晶的程度,延緩支鏈淀粉老化傾向。

結(jié)合圖3和表2可以看出,乳酸菌發(fā)酵,酵母菌發(fā)酵第96 h(發(fā)酵終止)RVA的變化同自然發(fā)酵相比有很大差別,分別體現(xiàn)在:淀粉糊化的起始溫度較自然發(fā)酵相比分別下降0.9 ℃和2.85 ℃;峰值粘度較自然發(fā)酵相比分別上升185 cP和103 cP。其原因是由于乳酸菌和酵母菌發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)明顯減少,使淀粉顆粒在糊化的過程中更易吸水膨脹至更大的體積,故峰值黏度增加。Lim 等研究表明,大米粉中蛋白含量的減少可引起大米粉峰值黏度增加[7]。此外,發(fā)酵后大米粉中脂肪含量降低,也可以使峰值黏度增加[8];最終粘度是冷湖在低剪切作用下穩(wěn)定性的評估。較自然發(fā)酵相比乳酸菌發(fā)酵和酵母菌發(fā)酵的最終粘度變大;衰減值較自然發(fā)酵都呈下降的狀態(tài),R4下降978 cP,J4下降400 cP。由于支鏈淀粉的長鏈部分與淀粉糊化的衰減值呈負(fù)相關(guān),而短鏈部分與淀粉糊化的衰減值呈正相關(guān)[9],長鏈可以提供更強(qiáng)的相互交聯(lián)作用來維持膨脹淀粉顆粒的剛性,在加熱攪拌過程中,不易破裂。乳酸菌和酵母菌發(fā)酵后支鏈淀粉鏈長變化可能是淀粉衰減值降低的重要原因[10]。衰減值的降低,說明發(fā)酵后的小米淀粉在加熱過程中維持顆粒結(jié)構(gòu)完整性的能力增強(qiáng);回生值反映了糊化后淀粉的穩(wěn)定性和老化趨勢,RVA 是在十幾分鐘內(nèi)完成的,故應(yīng)屬于測定淀粉的短期老化特性。乳酸菌和酵母菌發(fā)酵的回生值與自然發(fā)酵的相比,回生值均有降低,分別下降743 cP和471 cP。這說明乳酸菌和酵母菌發(fā)酵改變了小米淀粉的化學(xué)成分而影響其回生特性,使淀粉的短期老化能力都有所下降。

2.4偏光十字

淀粉顆粒內(nèi)部存在結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無定形結(jié)構(gòu),而淀粉分子結(jié)晶區(qū)具有高度有序的排列,而在非結(jié)晶區(qū)淀粉分子呈無序的排列,正是這兩種不同的結(jié)構(gòu)在密度和折射率上存在差別,使得淀粉顆粒產(chǎn)生各向異性的現(xiàn)象,當(dāng)偏振光通過淀粉顆粒時(shí)就會產(chǎn)生偏光十字[11]。在偏光顯微鏡下觀察淀粉顆粒呈現(xiàn)黑色的十字,將顆粒分成四個(gè)白色的區(qū)域,稱為偏光十字或馬耳他十字[12]。

淀粉顆粒通過改性后,其內(nèi)部的分子鏈有序排列的結(jié)晶結(jié)構(gòu)就會遭到破壞,偏光十字就會發(fā)生改變或消失,所以淀粉顆粒內(nèi)部偏光十字的變化在一定程度上可以反映出淀粉顆粒結(jié)晶結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。不同發(fā)酵時(shí)間小米淀粉的偏光十字如圖4所示。

圖4　小米淀粉偏光十字Fig.4　The polarization cross of millet starch注：a：自然發(fā)酵,b：酵母菌發(fā)酵,c：乳酸菌發(fā)酵。

如圖所示三種不同發(fā)酵方式所制得的淀粉都有明顯的偏光十字,說明乳酸菌發(fā)酵,酵母菌發(fā)酵同自然發(fā)酵相比,都未使淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)發(fā)生改變。發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸和酶可能主要作用于淀粉的無定形區(qū),而結(jié)晶區(qū)幾乎保持不變。

3　結(jié)論

自然發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌種酵母菌與乳酸菌在發(fā)酵時(shí)起非常重要的作用。主要體現(xiàn)在四個(gè)方面:自然發(fā)酵,酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵液中總固形物的含量都增加,但酵母菌發(fā)酵和乳酸菌發(fā)酵液中的總固形物含量要高于自然發(fā)酵過程中的發(fā)酵液的總固形物含量。較自然發(fā)酵相比,乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵的前24 h發(fā)酵液中的pH下降迅速,24 h以后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵終止時(shí)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵小米淀粉的糊化起始溫度、回生值、衰減值較自然發(fā)酵下降,峰值粘度、最終粘度上升?；厣档慕档陀欣诟纳菩∶桩a(chǎn)品的回生特性,耐于儲存。偏光十字表明了無論是哪種發(fā)酵方式,發(fā)酵后的淀粉顆粒仍具有偏光十字。說明三種發(fā)酵方式未使淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)改變。

由于本文研究主要以乳酸菌群,酵母菌群為主要研究對象,通過對比分析自然發(fā)酵來確定其發(fā)酵機(jī)理,所以對于乳酸菌和酵母菌群中哪種菌對發(fā)酵

起主要作用還不是很清楚,所以接下來的工作就是通過確定自然富集的乳酸菌和酵母菌群中何種菌對發(fā)酵起實(shí)質(zhì)性的作用進(jìn)行探討和研究。

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Effect on yeast and lactic acid bacteria fermentation of millet starch viscosity

KOU Fang1,KANG Li-jun1,ZHANG Li-li1,YIN Jing1,LI Wen-jie1,WANG Wei-hao1,XIA Tian-tian1,NING Dong-xue1,CAO Long-kui1,2,*

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.Heilongjiang Farm Produce Processing Development Center,Daqing 163319,China)

Natural fermentation was affected heavily by environment and microbes,it was difficult to achieve the mass production of the fermentation products . Therefore, studying natural fermentation of advantage bacterium to the effect on millet starch was necessary. Selected millet production from Inner Mongolia chifeng Huang Jinmiao as raw material,species by natural fermentation and purification of yeast and lactic acid bacteria were used for pure breed fermentation for 96 h,and compared with natural fermentation of millet starch,the changes of starch viscosity,attenuation and retrogradation value were analyzed. Using 0.2 g/100 mL NaOH solution to extract the methods of extracting 3 h after fermentation of millet starch, and the solids content in the fermented liquid,pH,the starch viscosity property,polarization cross were determined. The results showed that all of the total solids content by three methods of fermentation in the fermented liquid were increased,compared to natural fermentation, the fermentation of lactic acid bacteria and yeast fermentation liquor of pH were declined rapidly before 24 h,then changed slowly. Starch viscosity properties showed that lactic acid bacteria and yeast fermentation termination,the attenuation of the starting temperature,viscosity value,the setback were decreased compared to natural fermentation,the peak viscosity rose more than natural fermentation. Compared with natural fermentation,the final viscosity lactic acid bacteria and yeast fermentation were increased. polarization cross showed both natural fermentation of yeast fermentation and lactic acid bacteria fermentation,starch particles after the fermentation still had the polarization cross,the fermentation did not change the crystalline structure of starch.

Millet starch;natural fermentation;yeast fermentation;fermentation of lactic acid bacteria;viscosity property

2015-12-08

寇芳(1993-)，女，碩士研究生，研究方向:雜糧發(fā)酵，E-mail:18249556388@163.com。

曹龍奎(1965-)，男，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：caolongkui2013@163.com。

雜糧專用粉制備及方便面技術(shù)集成應(yīng)用與示范；國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2013GA670001)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.003