楊海明，李秀敏，孫宏冉，陳志強(qiáng)

(內(nèi)蒙古華天制藥有限公司，內(nèi)蒙古赤峰 024070)

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山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備與質(zhì)量控制方法

楊海明，李秀敏，孫宏冉，陳志強(qiáng)*

(內(nèi)蒙古華天制藥有限公司，內(nèi)蒙古赤峰 024070)

[目的]制定山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備工藝并建立其質(zhì)量控制方法。[方法]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備工藝；采用紫外分光光度法、TCL、微生物法建立山苦荬提取物的質(zhì)量控制指標(biāo)。[結(jié)果]制備工藝為原料藥材的處方量用20倍量水連續(xù)提取3次，100 ℃，每次1 h，減壓濃縮溫度與干燥溫度均為65 ℃；山苦荬提取物在30～70 μg/mL的濃度與吸光度線性良好，回收率為98.4%，RSD為0.64%。標(biāo)準(zhǔn)提取物溶液在198與294 nm紫外波長(zhǎng)最大吸光度比值為4.1，干燥失重為0.4%，灰分為0.8%，酸堿度為5.2，細(xì)菌菌落總數(shù)為12 個(gè)/g，霉菌總數(shù)無，大腸桿菌無，沙門氏菌無。[結(jié)論]優(yōu)選溶劑水及相應(yīng)的溫度提取和控制是山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物制備的安全有效方法。建立的檢測(cè)項(xiàng)可以用于山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的指標(biāo)控制。

山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物；制備工藝；質(zhì)量控制方法

山苦荬[Ixerischinensis(Thunb.)Nakai]為菊科苦荬菜屬植物，盛產(chǎn)于我國(guó)東北、華北等地，具清熱解毒、排毒、涼血、止痛之功效，用于治療腸黃、痢疾、肺出血、腹痛、瘡疔腫痛[1]。山苦荬的化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要含有倍半萜內(nèi)酯、黃酮、三萜、木脂素等各類型化合物[2]。近年來，張垠[3]從乙醚中分離出4種化合物，從乙酸乙酯中分離出3種化合物且是首次從該植物中得到。獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中只是采用薄層色譜進(jìn)行山苦荬的定性鑒定，無含量測(cè)定方法，部分文獻(xiàn)研究了山苦荬的藥用成分及藥用價(jià)值[4-5]。藥材來源相對(duì)復(fù)雜，質(zhì)量不穩(wěn)定，為保證中成藥生產(chǎn)原料用藥的質(zhì)量均一性，迫切需要可以體現(xiàn)原藥材特定中醫(yī)功效、具有相對(duì)明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及嚴(yán)格質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提取物作為中間體，替代原生藥使用[6]，使其提取物可能成為未來代替抗生素類[7]藥物。該研究以山苦荬素為控制指標(biāo)，首次采用紫外分光光度法波峰相加法、波峰相比法測(cè)定了山苦荬提取物的含量和鑒別等方法，制定了山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備工藝與質(zhì)量控制指標(biāo)。

1　材料與方法

1.1儀器UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；PHS-3Cph計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；HH-6數(shù)字恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；DH4000型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)；BT25S電子分析天平(sartorius)；ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)測(cè)量分析儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)。

1.2試材 山苦荬(內(nèi)蒙古恒光大現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司)；山苦荬對(duì)照藥材(中國(guó)獸藥監(jiān)察所)；山苦荬菜素對(duì)照品(中國(guó)生物制品檢定研究院)。95%乙醇、三氯化鋁、五氧化二磷、氯化鈉、蛋白胨，均是分析純，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；大腸埃希菌[CVCC1570]、金黃色葡萄球菌[CVCC1882]、枯草芽孢桿菌[CVCC717]、白色念珠菌[CMCC98001]、黑曲霉[CMCC98003]，來源于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.3方法

1.3.1制備工藝。稱取凈制干燥山苦荬中藥材1 000 g，加一定倍量純化水一定溫度下進(jìn)行煎煮，煎煮3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至浸膏，減壓干燥至恒重。根據(jù)山苦荬提取物的干膏得率為試驗(yàn)指標(biāo)，選取加水倍數(shù)(A)、提取溫度(B)、減壓濃縮溫度(C)、減壓干燥溫度(D)為4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，按照L9(34)正交表(表1)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，考察各因素對(duì)干膏得率的影響，選出山苦荬最優(yōu)制備工藝。

1.3.2溶液制備。

1.3.2.1對(duì)照品溶液。分別精密稱取芹菜素、山苦荬菜素對(duì)照品，加水配制成含有50 μg/mL的溶液作為對(duì)照品溶液。

1.3.2.2供試品溶液。精密稱取山苦荬提取物，加水制成含有100 μg/mL的溶液作為供試品儲(chǔ)備液。

1.3.3方法學(xué)考察。

1.3.3.1穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密量取供試品儲(chǔ)備液制成含有50 μg/mL的溶液，分別于0、2、4、6、8 h在198和294 nm處測(cè)定吸光度。

表1　正交試驗(yàn)因素水平

1.3.3.2精密度試驗(yàn)。精密量取供試品儲(chǔ)備液制成含有50 μg/mL的溶液，連續(xù)6次在198和294 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3.3重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取供試品制成含有50 μg/mL的溶液，在198和294 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3.4線性試驗(yàn)。精密稱取山苦荬素對(duì)照品制成分別含有30、40、50、60、70 μg/mL的溶液，在198和294 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3.5回收率。按測(cè)定濃度的80%、100%、120%的份量，各精密稱取山苦荬素對(duì)照品平行3份，分別加入按處方比例混合均勻的空白輔料，分別加水制成濃度分別為40、50、60 μg/mL的供試品溶液，搖勻，過濾，作為供試品溶液；另取山苦荬素對(duì)照品適量，加水超聲溶解并稀釋制成含0.50 μg/mL的溶液作為對(duì)照品溶液，在198和294 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.4質(zhì)量控制。

1.3.4.1紫外分光光度法鑒別。取山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物、山苦荬對(duì)照品加水稀釋成含山苦荬素50 μg/mL的溶液，按照紫外-可見分光光度法(中國(guó)獸藥典2010版)在190～450 nm 范圍內(nèi)測(cè)定。

1.3.4.2TLC鑒別。取山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物0.4 g，加乙醇10 mL，加熱回流10 min，濾過。取濾液1滴，點(diǎn)于聚乙烯胺薄膜上，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置紫外光燈(254 nm)下觀察。

1.3.5質(zhì)量控制指標(biāo)測(cè)定。

1.3.5.1干燥失重。取本品適量，以五氧化二磷為干燥劑在65 ℃減壓干燥至恒重，減失的重量不得大于5.0%[8]。

1.3.5.2灰分。按照中國(guó)獸藥典2010版灰分測(cè)定法[8]測(cè)定總灰分，其量不得超過2.0%。

1.3.5.3酸堿度。取本品加水配成0.05 g/mL的溶液，按照中國(guó)藥典2010版一部pH測(cè)定法[8]測(cè)定，應(yīng)為4.5～7.5。

1.3.5.4微生物檢查。細(xì)菌總數(shù)按照中國(guó)獸藥典2010版微生物檢查法[8]測(cè)定，細(xì)菌菌落總數(shù)不得過1 000 個(gè)/g，霉菌總數(shù)不得過100 個(gè)/g；大腸桿菌應(yīng)無；沙門氏菌應(yīng)無。

2　結(jié)果與分析

2.1山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備工藝由表2可知，各因素對(duì)山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物干膏得率的影響從大到小依次為B、A、D、C，即提取溫度影響最大，其次是加水倍數(shù)、減壓干燥溫度、減壓濃縮溫度；最佳工藝條件為A3B3C3D3。通過方差分析得出，提取溫度和加水量有顯著的差異，而加濃縮溫度和干燥溫度無顯著的差異。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2方法學(xué)考察

2.2.1穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.3.3.1”操作，計(jì)算得出RSD為0.33%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2精密度試驗(yàn)。按照“1.3.3.2”操作，計(jì)算得出RSD為0.02%，表明供試品進(jìn)樣精密度良好。

2.2.3重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.3.3.3”操作，計(jì)算得出RSD為0.38%，表明重復(fù)性好。

2.2.4線性試驗(yàn)。按照“1.3.3.4”操作，計(jì)算得出山苦荬提取物濃度在30～70 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性良好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 7(圖1)。

圖1　山苦荬提取物溶液線性關(guān)系Fig.1　The linear relationship of I.denticulata extracts solution

2.2.5回收率。由表3可見，平均回收率為98.4%，RSD=0.64%，表明試驗(yàn)結(jié)果良好。通過該方法測(cè)定山苦荬提取物中山苦荬素的含量為35.6%。

2.3質(zhì)量鑒別

2.3.1紫外-可見分光光度法鑒別。由圖2可見，供試品與對(duì)照品在198與290 nm的吸光度比值約為4.1。由于對(duì)照品和對(duì)照藥材均能夠在198與290 nm處產(chǎn)生吸收，可以作為含量測(cè)定的方法。

表3　山苦荬提取物回收率試驗(yàn)結(jié)果

注：1為山苦荬素A；2為山苦荬素B。Note：1.I.denticulata A；2.I.denticulata B.圖2　山苦荬對(duì)照品溶液紫外波長(zhǎng)鑒別Fig.2　Ultraviolet wavelength identification of I.denticulata control solution

2.3.2TLC鑒別。通過薄層色譜鑒別(圖3)，山苦荬提取物斑點(diǎn)與對(duì)照藥材斑點(diǎn)均顯黃綠色熒光。

2.4質(zhì)量控制指標(biāo)經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，干燥失重為0.4%，灰分為0.8%，酸堿度為5.2；細(xì)菌菌落總數(shù)為12 個(gè)/g，霉菌總數(shù)為0，無大腸桿菌和沙門氏菌。

3　小結(jié)

該研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備工藝，采用紫外分光光度法、TCL、微生物法建立山苦荬提取物的質(zhì)量控制指標(biāo)。結(jié)果表明，制備工藝為原料藥材的處方量用20倍量水連續(xù)提取3次，100 ℃，每次1 h，減壓濃縮溫度與干燥溫度均為65 ℃；山苦荬提取物濃度在30～70 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性良好，回收率為98.4%，RSD為0.64%。標(biāo)準(zhǔn)提取物溶液在198與294 nm紫外波長(zhǎng)最大吸光度比值為4.1，干燥失重為0.4%，灰分為0.8%，酸堿度為5.2，細(xì)菌菌落總數(shù)為12 個(gè)/g，霉菌總數(shù)無，大腸桿菌無，沙門氏菌無。由此可見，優(yōu)選溶劑水及相應(yīng)的溫度提取和控制是山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物制備的安全有效方法。建立的檢測(cè)項(xiàng)可以用于山苦荬標(biāo)準(zhǔn)提取物的指標(biāo)控制。

注：左邊為對(duì)照藥材斑點(diǎn)；中間為山苦荬提取物斑點(diǎn)；右邊為空白溶劑斑點(diǎn)。Note：On the left is the spot of the control medicine；in the middle is the spot of I.denticulata extracts；on the right is the spot of blank solvent.圖3　TLC鑒別圖譜Fig.3　TLC identification map

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：第1冊(cè)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2013：221.

[2] 封錫志.抱莖苦荬菜的化學(xué)成分和生物活性的研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2001.

[3] 張垠.藏藥山苦荬化學(xué)成分的研究[D].成都：西南交通大學(xué)，2011.

[4] 王曉飛，王曉靜.中華苦荬菜研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2006(4)：238-239.

[5] 毛小濤，李紅，楊偉光，等.苦荬菜研究進(jìn)展[J].青海草業(yè)，2011(4)：50-53.

[6] 張紅梅，王長(zhǎng)虹，王崢濤.黃連標(biāo)準(zhǔn)提取物的制備與質(zhì)量控制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011(8)：56-59.

[7] 李明月，楊葛巍，劉靜，等.大眾對(duì)養(yǎng)殖業(yè)以中藥代替抗生素認(rèn)識(shí)度的調(diào)查分析[J].科教文匯，2016(2)：186-188.

[8] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典：2010年版一部[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

Preparation and Quality Control of Standard Extracts fromIxerisdenticulata

YANG Hai-ming, LI Xiu-min, SUN Hong-ran, CHEN Zhi-qiang*

(Inner Mongolia Huatian Pharmaceutical Co. Ltd., Chifeng, Inner Mongolia 024070)

[Objective] The aim was to develop standard extractive preparation technology ofIxerisdenticulataand establish its quality control method. [Method] The preparation technology ofI.denticulatastandard extractive was established by orthogonal experiment; quality control index ofI.denticulataextractive was established by ultraviolet spectrophotometric method, TCL, microbial method. [Result] The preparation technology was using 20 times water of raw material medicine to extract 3 times under 100 ℃, 1 hour each time, the reduced pressure concentration and drying temperature is 65 ℃; 30-70 μg/mLI.denticulataextractive had good linearity with absorbance, recovery rate was 98.4%,RSD0.64%. The maximum absorbance ratio of standard extract solution at 198 and 294 nm UV wavelength was 4.1, dry weight loss was 0.4%, ash content was 0.8%, pH value was 5.2, the total number of bacterial colonies was 12 ind/g, mould, Escherichia coli and Salmonella were not got involved. [Conclusion] The optimal solvent water and corresponding temperature are key points of safe and effective method forI.denticulatastandard extractive. The established test items can be used to control the index ofI.denticulatastandard extractive.

Standard extractive ofIxerisdenticulata; Preparation technique; Quality control method

楊海明(1988- )，男，內(nèi)蒙古赤峰人，助理工程師，從事中獸藥研發(fā)工作。*通訊作者，工程師，從事新藥研發(fā)工作。

2016-06-22

S 567

A

0517-6611(2016)21-104-03