陳　頌，王　靜，侯　鵬，劉　磊，王　鑫

（齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江　齊齊哈爾 161006）

用于檢測生物硫醇的新型萘酰亞胺熒光探針的合成與應用

陳頌，王靜，侯鵬，劉磊，王鑫

（齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

該文利用硫醇誘導的2，4-二硝基苯磺酰基基團的斷裂反應生成具有供-吸電能力的熒光團，成功設計合成一種基于萘酰亞胺識別硫醇的熒光探針。相對于其他氨基酸，該探針在生理pH（7.40）值下，對于含硫醇的氨基酸具有高度的選擇性和靈敏度。探針對硫醇具有顯著的熒光增強響應，其熒光強度可以恢復197倍。此外，細胞內(nèi)硫醇的熒光成像實驗，證明該熒光探針具有潛在檢測細胞內(nèi)生物硫醇的能力。

生物硫醇；合成；萘酰亞胺；氨基酸；斷裂反應；熒光探針

0　引言

生物體內(nèi)的硫醇化合物如半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）在生理系統(tǒng)中具有重要的作用［1-2］，其體內(nèi)含量異常與多種疾病（如阿爾茲海默病、帕金森綜合癥、各種心血管疾病、肝損傷、癌癥以及艾滋病毒的感染等）有著密切的關系［3-5］。因此，對這些硫醇化合物的高選擇性和高靈敏度的檢測引起了研究者廣泛的興趣。自19世紀80年代Tsien課題組報道了首例熒光探針檢測Ca2+，之后熒光探針被認為是對生物小分子的成像和檢測十分有效的工具［6］。盡管已有文獻報道了一些檢測生物硫醇化合物的熒光探針［7-10］；但是，開發(fā)一種高選擇性、高靈敏度同時能夠應用于生物成像的熒光探針，仍是廣大科研工作者關注的熱點。1，8-萘酰亞胺及其衍生物是典型的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）熒光團，具有良好的光學性質(zhì)，如較好的光穩(wěn)定性、較高的熒光量子產(chǎn)率、Stokes位移較大、吸收和發(fā)射光譜在可見光譜范圍內(nèi)；此外，其光物理性質(zhì)比較容易通過結(jié)構(gòu)的改造來修飾［11-14］。因此，萘酰亞胺衍生物在熒光成像和檢測離子方面扮演了重要的角色。本文以4-羥基萘酰亞胺為熒光團，2，4-二硝基苯磺酰酯為硫醇的識別基團，合成了新型的熒光探針1。探針1在沒有生物硫醇存在時，由于2，4-二硝基苯磺酰基基團上的氮原子外層存在孤對電子，在光誘導下，容易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移作用（PET），使探針1的熒光淬滅（見圖1）。然而，當與生物硫醇作用后，由于硫醇可以使2，4-二硝基苯磺酰基脫保護，光無法誘導電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，導致PET作用受到抑制，使探針1的熒光得以恢復。以此，構(gòu)建一種檢測生物硫醇的分析方法。

圖1　探針1的合成及硫醇可能的識別機理

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

BRUKER AV400光譜儀（400 MHz，美國Bruker）；Bruker ultraflex II基質(zhì)輔助時間飛行質(zhì)譜（美國Bruker）；F4600-熒光分光光度計（日本日立）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon Eclipse TE300）。

2，4-二硝基苯磺酰氯（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；三乙胺（國藥集團化學試劑有限公司）；二氯甲烷（天津市凱通化學試劑有限公司）；測試所用氨基酸（Gly，Asp，Met，Lys，Tyr，Trp，Arg，His，Asn，Glu，GSH，Hcy，Cys）均購置于上海國藥試劑有限公司。

1.2探針的合成與表征

氬氣保護下，50 mL圓底單頸燒瓶中，加入化合物2：4-羥基萘酰亞胺［15］（135mg，0.5mmol）和三乙胺（61 mg，0.6 mmol）于20 mL干燥的二氯甲烷溶液中，室溫攪拌15min后，向上述溶液中加入2，4-二硝基苯磺酰氯（160mg，0.6mmol），反應液室溫攪拌過夜，用30mL水淬滅反應，將溶液用20mL二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，除去溶劑后柱層析純化（二氯甲烷），得到產(chǎn)物：探針1（110 mg，44%）。1H NMR （400 MHz，CDCl3）：δ ppm=8.75（d，J=2.0 Hz，1H），8.66（dd，J=0.8 Hz，7.2 Hz，1H），8.60～8.55（m，2H），8.45（dd，J=1.2 Hz，8.4 Hz，1H），8.32（d，J=8.4 Hz，1H），7.84～7.82（m，1H），7.66（d，J=8.0 Hz，1H），4.17（t，J= 7.6 Hz，2H），1.71（s，2H），1.44（d，J=7.6 Hz，2H），0.98（t，J=7.6 Hz，3H）m/z（HRMS）M-1：calculated，498.07；found，497.94。

2　結(jié)果與分析

2.1熒光光譜研究

探針1的光學信號行為如圖2所示，在含有50%乙腈的4-羥乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES）（pH 7.4）緩沖溶液中，由于探針1分子結(jié)構(gòu)內(nèi)存在光誘導電子轉(zhuǎn)移機制（PET），導致單獨的探針1（10μmol/L）在溶液中表現(xiàn)出很弱的熒光。

圖2　探針1加入不同濃度Cys熒光光譜的變化情況（λex=444nm）

然而，當加入Cys（1～100 μmol/L）后，探針溶液在555nm處出現(xiàn)了一個明顯的熒光發(fā)射峰，并且隨著Cys摩爾濃度的增加，這個發(fā)射峰強度逐漸增大，在Cys達到100μmol/L時，555 nm處的熒光強度相對于探針1自身背景的熒光強度增強了197倍。同時，在紫外燈照射下，可以觀測到隨著Cys的加入，探針1溶液的熒光由無色變?yōu)辄S色。在相同的測試條件下，將探針1（10 μmol/L）分別與Hcy和GSH作用均可觀察到相似的實驗結(jié)果。以上研究結(jié)果表明，探針1對生物硫醇表現(xiàn)出高度靈敏的識別能力。

圖3　探針1隨Cys濃度增加的熒光強度的變化情況 （λex=444nm）

分析探針1（10μmol/L）與不同摩爾濃度Cys的熒光發(fā)射光譜的數(shù)據(jù)，如圖3所示，以熒光強度為縱坐標，以Cys濃度（1～8 μmol/L）為橫坐標作圖，得到一條Plot曲線，擬合后得到的方程為y=7.796 6x-0.5744，相關系數(shù)r=0.9991。根據(jù)文獻［16］報道的方法，計算熒光探針摩爾濃度為10μmol/L時，Cys，Hcy，GSH的檢測限分別為0.22，0.35，0.11μmol/L。以上結(jié)果表明，在生理條件下探針1可以有效地對生物硫醇進行定量檢測。

2.2選擇性和干擾實驗

評價硫醇識別探針，其對專一硫醇良好的選擇性是一個十分重要的參數(shù)。本實驗選擇了一些典型的氨基酸（Gly，Asp，Met，Lys，Tyr，Trp，Arg，His，Asn，Glu，GSH，Hcy，Cys）作為分析物，對探針1的識別能力進行研究。如圖4所示，探針1對生物硫醇表現(xiàn)出顯著的熒光增強。然而，當加入其他測試物時，探針1的熒光行為幾乎沒有變化。為了進一步驗證探針1的實際應用能力，本文探討了多種氨基酸對探針1與Cys反應之間的干擾情況。如圖5所示，在其他干擾物質(zhì)存在時，探針1對Cys的檢測幾乎沒有受到影響。以上研究結(jié)果表明，探針1對生物硫醇具有極高的專一性。

圖4　Cys及其他氨基酸（100μmol/L）的加入對探針1 （10μmol/L）熒光光譜（λex=444nm）的影響

圖5　探針1與各種氨基酸反應后熒光（λex=444nm）強度變化

圖6　探針1加入不同濃度Cys后，在555nm熒光強度隨時間變化情況

2.3反應時間

為了確定探針1與Cys的反應速率，本文進行了時間熒光動力學研究。如圖6所示，向探針1（10μmol/L）溶液中分別加入不同濃度（0，25，50，100 μmol/L）的Cys后，反應體系的熒光強度均與反應時間成正比關系；其中，在100μmol/L加入后，反應速率明顯加快，大約10min便可以達到平衡。然而，在相同的條件下，單獨探針1溶液的熒光強度隨時間幾乎沒有什么變化，可以穩(wěn)定存在。以上結(jié)果表明，該探針分子具有良好的穩(wěn)定性，可以在水溶液中實現(xiàn)對Cys的快速檢測。

2.4熒光成像

為了實現(xiàn)細胞內(nèi)生物硫醇的檢測，這里選用了人肝癌細胞（HepG2）來探討探針1對生物硫醇的熒光成像實驗。如圖7所示，將HepG2細胞在含有探針1（10 μmol/L）的溶液中孵化，通過熒光顯微鏡可以觀察到顯著的黃色熒光。在相同條件下，將HepG2細胞預先用巰基阻斷劑N-乙基馬來酰亞胺（NEM）（1mmol/L）處理后，確保細胞中不存在游離的巰基物質(zhì)，再加入含有探針分子1（10μmol/L）的溶液進行孵化，此時熒光顯微鏡下只能看到微弱的熒光出現(xiàn)在細胞內(nèi)。細胞實驗表明，利用反應前后鮮明的熒光差異，探針分子1可以適用于在活體細胞內(nèi)對生物硫醇的檢測。

圖7　 細胞成像

3　結(jié)束語

本文以4-羥基萘酰亞胺為母體，通過引入2，4-二硝基苯磺酰氯作為識別基團，合成了新型的生物硫醇熒光探針。該法基于硫醇引發(fā)2，4-二硝基苯磺?；摫Ｗo，電子轉(zhuǎn)移作用受到抑制，從而使反應體系的熒光信號顯著升高。相對于其他分析物，該探針在生理pH范圍內(nèi)對含硫醇的氨基酸具有較高的專一性和靈敏度；同時，探針對于含硫醇的氨基酸顯示出在黃色光譜區(qū)域顯著的熒光增強（197倍），可以檢測相對較低濃度的生物硫醇；此外，該探針可成功應用于HepG2細胞內(nèi)硫醇的熒光成像實驗。

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（編輯：莫婕）

The synthesis and application of a new type of naphthalimide fluorescent probe for biothiols determination

CHEN Song，WANG Jing，HOU Peng，LIU Lei，WANG Xin
（College of Pharmacy，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China）

The research used，2，4-dinitrobenzenesulfonyl group cleavage reaction induced by thiols to generate fluorophore with power supply-sucking ability，and proposed and synthesized a kind of fluorescence probe that can identify biothiols via naphthalimides.Relative to other amino acids，the probe is under physiological pH value（7.40），which has high sensitivity and selectivity on amino acids containing biothiols.The probe has a striking fluorescence enhancement effect on biothiols，which can recover fluorescence intensity to 197 times.Besides，fluorescence imaging test of biothiols in cells shows that the fluorescence probe has a potential ability of detecting biothiols in cells.

biothiols；synthesis；naphthalimide；amino acids；cleavage reaction；fluorescence probe

A

1674-5124（2016）08-0064-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2016.08.013

2016-01-13；

2016-03-18

齊齊哈爾市科學技術計劃項目（SFGG-201416）

陳頌（1983-），男，江蘇連云港市人，講師，博士，研究方向為熒光探針的合成與應用。