范　濤， 王　洪， 魏　杰， 周舒雅， 岳秉飛， 李保文

(中國食品藥品檢定研究院，北京　100050)

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不同來源高度免疫缺陷小鼠微衛(wèi)星DNA遺傳檢測的分析

范濤， 王洪， 魏杰， 周舒雅， 岳秉飛， 李保文

(中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

目的對不同來源的高度免疫缺陷小鼠進(jìn)行遺傳背景的檢測分析，旨在發(fā)現(xiàn)經(jīng)遺傳修飾的小鼠遺傳背景是否符合近交系遺傳特征。方法對收集到的4種不同來源以NOD為背景的高度免疫缺陷小鼠，選取30個微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測，通過凝膠電泳結(jié)果和STR掃描確定基因型，進(jìn)行遺傳分析。結(jié)果4組20個樣本中共有17個位點(diǎn)呈現(xiàn)多態(tài)性，A、B兩組小鼠30個微衛(wèi)星位點(diǎn)表現(xiàn)為純和，其他兩組小鼠中不同位點(diǎn)均出現(xiàn)雜合個體；A、B兩組遺傳距離最小，保持著較高的遺傳相似度。結(jié)論研究表明，不同來源高度免疫缺陷小鼠遺傳背景有差異。

免疫缺陷小鼠；微衛(wèi)星；遺傳質(zhì)量

高度免疫缺陷小鼠“NSG”是在NOD(non-obese diabetic)小鼠的背景下，發(fā)生重癥聯(lián)合免疫缺陷Prkdcscid(protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide，Prkdc；severe combined immune deficiency，SCID)和白細(xì)胞介素2受體γ鏈(interleukin 2 receptor gamma chain，Il2rg)缺失突變產(chǎn)生的。該小鼠模型表現(xiàn)為成熟T、B淋巴細(xì)胞、功能性NK細(xì)胞缺失，細(xì)胞因子信號缺少。由于其免疫缺陷程度相對于其他品系更高，能更好地適用于人類造血干細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞和腫瘤的異種移植，而成為一種理想的人源化免疫缺陷小鼠模型。不同來源的高度免疫缺陷小鼠有不同的建立方法：一種方法是同源導(dǎo)入，通過回交獲得以受體小鼠品系為背景的雙基因突變型小鼠；另一種是利用基因編輯技術(shù)直接在背景品系小鼠上進(jìn)行改造，更快、更直接地獲得目標(biāo)動物。微衛(wèi)星又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandom repeat, STR)，作為分子標(biāo)記在實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量檢測中具有良好的適用性，被廣泛應(yīng)用[1-4]。具有高度多態(tài)性的簡單重復(fù)序列可以用于區(qū)分不同近交系小鼠，而在同品系內(nèi)不同個體間，微衛(wèi)星DNA則呈單態(tài)性[5,6]，可以用于近交系遺傳質(zhì)量評價。本實(shí)驗(yàn)通過選擇30個微衛(wèi)星位點(diǎn)對收集到的4種不同來源，不同制作方法的“NSG”小鼠進(jìn)行遺傳檢測，旨在發(fā)現(xiàn)這些遺傳工程小鼠從制作之初背景品系的選取，到后期建系保種的過程，在遺傳質(zhì)量方面是否符合近交系特點(diǎn)。

1　材料和方法

1.1材料

圖1　4組小鼠在D5Mit48位點(diǎn)PCR凝膠電泳結(jié)果Fig.1　PCR gel electrophoresis at loci D5Mit48 of mice in the four groups

4種不同來源的“NSG”小鼠由本單位收集保存并提供，生產(chǎn)許可證號【SCXK(京)2014-0013】。4種小鼠中有兩種是在背景品系上做的基因敲除，兩種為同源倒入。每品系5只，4～6周齡，雌雄在選擇時不做限制，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，選擇1只B6小鼠作為參照。

1.2方法

1.2.1小鼠DNA提?。簩?種不同來源高度免疫缺陷小鼠順序編為A、B、C、D四個組。剪取小鼠尾尖3～5 mm放入EP管中，加蛋白酶K緩沖液裂解過夜，酚/氯仿法提取DNA，濃度稀釋至50～100 ng/μL，4℃保存。

1.2.2微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)報道[7]，選擇30個多態(tài)性較高的微衛(wèi)星位點(diǎn)，覆蓋小鼠1～20號染色體，引物序列詳見表1，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.3PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系20 μL，其中：10× PCR buffer 2 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 1.2 μL，鎂離子1.5 μL，Taq酶0.2 μL，基因組DNA 1 μL，純水12.1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；退火溫度(54～64℃)30 s；72℃延伸30 s；35個循環(huán)；72℃延伸8 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.2.4電泳：2.5%瓊脂糖凝膠，電泳。溴化乙錠染色，用紫外可見分析儀查看結(jié)果并記錄。

1.2.5STR掃描：將21個樣本擴(kuò)增產(chǎn)物放入STR掃描儀，用GeneMarker V2.2.0讀取各樣本在各位點(diǎn)擴(kuò)增片段的大小。每個位點(diǎn)按照片段大小順序記為a、b、c、d，根據(jù)等位基因分型的不同，各微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型以aa、ab、ac等方式記錄，基因型全部純和，判斷為符合近交系特征；反之出現(xiàn)雜合基因型則不符合近交系遺傳特點(diǎn)。

1.2.6數(shù)據(jù)結(jié)果：用Lynch法計(jì)算組間相似系數(shù)，同時將數(shù)據(jù)放入PopGen1.32進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1PCR檢測分析結(jié)果

30個微衛(wèi)星位點(diǎn)均能擴(kuò)增出條帶。根據(jù)電泳結(jié)果進(jìn)行初步篩查，可觀察到多態(tài)性位點(diǎn)，以D5Mit48位點(diǎn)為例(圖1)，C組1、2、4、5號小鼠在該位點(diǎn)上與其他組別個體間有差別，呈現(xiàn)多態(tài)性。通過與B6 PCR結(jié)果的比較，D7Mit12、D14Mit3、D18Mit19、D19Mit3、D19Mit16位點(diǎn)兩種品系的擴(kuò)增片段長度一致，表現(xiàn)為單態(tài)性。

2.2STR掃描及結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳用肉眼難以觀察區(qū)別小于10 bp的片段，STR掃描可以精確檢測片段的具體長度，區(qū)分相差1 bp的DNA片段。根據(jù)STR掃描結(jié)果，可以更準(zhǔn)確地判斷各位點(diǎn)的多態(tài)性，同時判斷位點(diǎn)為純合還是雜合，判讀方法如圖2所示。C組在D12Mit7位點(diǎn)出現(xiàn)了兩種片段長度，經(jīng)掃描，1、4、5號樣本出現(xiàn)106 bp和122 bp兩個波形，說明該小鼠在這個位點(diǎn)為雜合狀態(tài)，基因型記錄為ab；2號樣本和3號樣本各在122 bp和106 bp出現(xiàn)了一個波形，說明這兩只小鼠在該位點(diǎn)為純和型并表現(xiàn)出多態(tài)性，記錄為bb、aa，以此類推。4組20個實(shí)驗(yàn)樣本判讀結(jié)果(表1)。

圖2　C組樣本在D12Mit7位點(diǎn)的微衛(wèi)星掃描波形Fig.2　The waveforms of loci D12Mit7 in STR scanning of samples of the group C

根據(jù)STR掃描結(jié)果，參照樣本B6所有微衛(wèi)星位點(diǎn)都為純合狀態(tài)；A、B組的10只小鼠30個微衛(wèi)星位點(diǎn)均為純合狀態(tài)； C組的5個樣本中在D2Mit15、D8Mit33、D9Mit21、D9Mit23、D11Mit4、D12Mit7、D17Nds3、D17Mit11、D18Mit9、D19Mit16 等10個位點(diǎn)上，出現(xiàn)多個雜合型個體；D組的樣本僅有一只小鼠在D19Mit6位點(diǎn)上表現(xiàn)為雜合型。4組20個樣本中共有17個位點(diǎn)呈現(xiàn)出多態(tài)性，包括：D1Mit365、D2Mit15、D3Mit29、D5Mit48、D6Mit8、D6Mit102、D8Mit33、D9Mit21、D9Mit23、D11Mit4、D12Mit7、D16Mit9、D17Nds3、D17Mit11、D18Mit9、D19Mit16、DXMit16。

2.34種小鼠相似系數(shù)

按Lynch法計(jì)算相似系數(shù)其結(jié)果(表2)。A組與B組小鼠相似度最高，其次是B組與D組；C、D兩組相似性最低。C組與其他三組都有較低的相似性。

2.44種小鼠遺傳距離比較

通過PopGen1.32軟件分析Nei’(1978)遺傳距離、遺傳相似度指標(biāo)結(jié)果(表3)。通過計(jì)算可以看出A組與B組遺傳距離最小，保持著較高的遺傳相似度。

3　討論

Jackson實(shí)驗(yàn)室發(fā)布的高度免疫缺陷小鼠是通過將NOD.CB17-Prkdcscid/J與B6.129S4-Il2rgtm1Wjl/J兩品系雜交，產(chǎn)生同時具備Prkdcscid和Il2rg基因型的F1代后，與NOD.CB17-Prkdcscid/J回交8代，產(chǎn)生的雜合子相互交配得到Prkdcscid和Il2rg雙純合型(Il2rg是X-link基因，雄性為半合子)的NSG小鼠[8]。國內(nèi)不少實(shí)驗(yàn)室和基因工程公司則使用基因編輯技術(shù)，在NOD或NOD/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid)小鼠上進(jìn)行基因改造而獲得同樣的動物模型。不論哪種方式，最終獲得的目標(biāo)動物都應(yīng)符合近交系特點(diǎn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A、B兩組中所包含的10只小鼠樣本30個位點(diǎn)均處于純和狀態(tài)，符合近交系特點(diǎn)；C組的5只小鼠樣本中，在10個位點(diǎn)上出現(xiàn)多個個體的基因型為雜合，可以判定其不符合近交系遺傳特征。D組有一只小鼠在1個位點(diǎn)上出現(xiàn)雜合基因型，可將其本身及其后代淘汰，不進(jìn)入繁育體系。

根據(jù)報道[9]，不同近交系在D7Mit12、D19Mit3兩個微衛(wèi)星位點(diǎn)呈單態(tài)性，實(shí)驗(yàn)證明NOD小鼠也符合該特點(diǎn)。不同組別的小鼠在同一位點(diǎn)上也具有多態(tài)性。例如A組全部樣本在D1Mit365位點(diǎn)、C組在D6Mit8位點(diǎn)上都出現(xiàn)了與其他三組不一致的DNA片段長度，但都為純合的基因型，這可能是在小鼠模型構(gòu)建之初選擇了不同的亞系而導(dǎo)致的。又如A組在D3Mit29、D17Nds3兩個位點(diǎn)各出現(xiàn)了1只與組內(nèi)其他4只不同的基因型，如果該樣本處在基礎(chǔ)群或核心群中，可以在日后的繁育管理中將其淘汰，避免在該位點(diǎn)出現(xiàn)雜合等位基因。

近交系小鼠的遺傳質(zhì)量直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[10,11]，大多數(shù)基因工程小鼠都是以近交系為背景進(jìn)行基因改造而來。遺傳質(zhì)量的改變可能發(fā)生在建立時選用的小鼠自身發(fā)生遺傳變異，遺傳背景不符合近交系特點(diǎn)；也可能發(fā)生在后續(xù)的建系保種過程中，如回交倒入品系不合格，回交未超過5代(N5)，未嚴(yán)格按照全同胞兄妹繁殖等。

表1　30個微衛(wèi)星座位的引物序列、擴(kuò)增條件及各組基因型結(jié)果

表2　任意兩組間相同等位基因數(shù)量與相似系數(shù)

注：對角線以上部表示兩組間相同位點(diǎn)數(shù)量，對角線以下為兩組間相似系數(shù)。

Note. The number of the same alleles (above the diagonal) and similarity index (below the diagonal)

表3　任意兩組間遺傳相似度和遺傳距離

注：對角線以上部表示兩組間遺傳相似度，對角線以下為兩組間遺傳距離。

Genetic identity (above the diagonal) and genetic distance (below the diagonal)

微衛(wèi)星DNA具有位點(diǎn)充足，遺傳穩(wěn)定，多態(tài)性高，片段短容易擴(kuò)增等優(yōu)勢，非常適合用于近交系的遺傳監(jiān)測。近交系遺傳修飾小鼠在保種、擴(kuò)繁的過程中除目的基因的檢測外，定期對基礎(chǔ)群和核心群的繁殖個體進(jìn)行遺傳背景的篩查很有必要，及時發(fā)現(xiàn)不合格的個體并不作選留，可維護(hù)整個種群的純合性。本文通過微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記對不同來源高度免疫缺陷小鼠的遺傳質(zhì)量進(jìn)行檢測，為近交系小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選提供數(shù)據(jù)支撐，同時，對建立動物模型質(zhì)量評價提供參考。對于今后的保種和繁殖以及使用的意義和社會價值的重要性進(jìn)行闡述。

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Genetic monitoring and analysis of highly immunodeficient mice from different sources by microsatellite DNA markers

FAN Tao, WANG Hong, WEI Jie, ZHOU Shu-ya, YUE Bing-fei, LI Bao-wen.

National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

ObjectiveTo test and analyze the genetic background of highly immunodeficient mice from different sources. Methods Four highly immunodeficient mouse strains from different sources of NOD background were collected. 30 microsatellite DNA sites were detected, and the genotype can be displayed by gel electrophoresis and STR scanning. Results17 microsatellite sites exhibit polymorphism in 20 mice of the four groups. There were 30 homozygous loci in the mice of groups A and B, and heterozygous in the other two groups. The genetic distance is minimum between groups A and B, showing a higher genetic similarity. ConclusionsThe genetic backgrounds are different in highly immunodeficient mice from different sources.

Immunodeficient mice; Microsatellite; Genetic quality; Mice

范濤(1983-)，男，技師，專業(yè)：實(shí)驗(yàn)動物保種。E-mail：crvchinaft@126.com。

李保文(1967-)，男，副主任技師。E-mail：libaowen2003@aliyun.com。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0091-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.015

2016-04-28