王　君，邱　彬，劉　明，王　超，雍偉東，謝忠穩(wěn)

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學，茶與食品科技學院, 茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽，合肥　230036;2. 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所, 基因與發(fā)育室，北京　100021 )

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蛋白磷酸酶5(PP5)對小鼠脂肪代謝的影響

王君1，邱彬2，劉明2，王超2，雍偉東2，謝忠穩(wěn)1

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學，茶與食品科技學院, 茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽，合肥230036;2. 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所, 基因與發(fā)育室，北京100021 )

目的利用蛋白磷酸酶5(PP5)基因敲除小鼠，探究PP5在小鼠脂肪代謝中的作用。方法隨機選取6周齡雄性PP5基因敲除(PP5 KO)和野生型(WT)小鼠，高脂飼養(yǎng)6周后，應(yīng)用HE染色和油紅O染色技術(shù)對小鼠肝臟結(jié)構(gòu)和脂滴積累進行檢測，應(yīng)用Western blotting和real-time PCR技術(shù)檢測肝臟組織中脂代謝相關(guān)基因的表達情況。同時應(yīng)用PP5 KO和WT小鼠成纖維細胞，在體外觀察PP5對脂肪分化的影響。結(jié)果與WT小鼠相比，高脂飼養(yǎng)后PP5 KO小鼠體重與WT小鼠相比顯著減輕，肝臟中脂滴數(shù)量顯著較少且脂滴較小。體外實驗發(fā)現(xiàn)與WT小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)相比PP5 KO MEF細胞脂肪分化顯著較弱，脂滴較小。此外，在PP5 KO肝臟組織中脂肪分化標記基因CD36、AP2、PPARγ2和Glut4的相對表達量顯著降低，而能量代謝相關(guān)蛋白糖皮質(zhì)激素受體(GR)的磷酸化水平顯著增加，解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)表達量也顯著升高。結(jié)論 PP5通過調(diào)節(jié)GR的去磷酸化影響機體脂肪分化和能量代謝調(diào)控小鼠脂肪代謝。

蛋白磷酸酶5；糖皮質(zhì)激素受體；解偶聯(lián)蛋白1；脂肪分化；能量代謝

甾體激素受體是一類參與細胞調(diào)控的核受體超家族，對生物體具有極其重要的作用，主要包括糖皮質(zhì)激素受體(GR)、雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)、孕激素受體(PR)以及鹽皮質(zhì)激素受體(MR)。其中糖皮質(zhì)激素受體在個體中具有廣泛表達，介導糖皮質(zhì)激素(GCs)對機體糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝等功能的調(diào)節(jié)作用。由于糖皮質(zhì)激素(GCs)是全身能量平衡的重要調(diào)節(jié)因子[1]，因而GR的活性變化將嚴重影響機體的物質(zhì)能量代謝功能。蛋白磷酸酶5(PP5)，是一種在機體內(nèi)廣泛表達的共伴侶蛋白，具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性，在細胞生長、增殖、分化、遷移以及脅迫條件下的細胞生存等方面都發(fā)揮重要作用[2, 3]。研究表明PP5能夠直接與HSP90/GR復合體結(jié)合，通過催化GR的去磷酸化過程[4]，調(diào)節(jié)GR活性。另有研究利用體外小鼠成纖維細胞脂肪誘導分化模型發(fā)現(xiàn)，敲除PP5可明顯抑制脂肪分化[5]。這些結(jié)果提示PP5可能通過調(diào)節(jié)GR去磷酸化影響脂肪分化，但目前仍缺乏有力的體內(nèi)實驗證據(jù)。本研究利用PP5基因敲除小鼠和PP5敲除小鼠成纖維細胞，從體內(nèi)和體外兩方面探討敲除PP5基因?qū)χ敬x的影響及其分子機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物及實驗環(huán)境

清潔級雄性PP5敲除(PP5 KO)小鼠為本實驗室保存，PP5敲除小鼠及其野生型(WT)對照小鼠飼養(yǎng)繁殖于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，動物使用合格號為【SYXK(京)2011-0022】。動物實驗方案經(jīng)中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會批準，批準號為ILAS-PG-2014-012。

1.2實驗儀器

電子天平(精度0.01 g，上海民橋電子天平廠)。MRI(7.0T micro MRIV，美國Varian公司)。石蠟切片機(IVS-401，日本Sakura Finetek公司)。冰凍切片機(CM1900，德國Lecia)。光學顯微鏡(BX50，日本Olympus公司)。PCR循環(huán)儀(Applied Biosystem 7500，美國ABI公司)。化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5500，中國天能公司)。

1.3材料

高脂飼料(60 kcal% fat，D12492)購自美國Research Diets公司。異氟寧(上海雅培制藥有限公司)。高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素購自美國Invitrogen公司,用于培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞，使用前按每100 mL培養(yǎng)液中89%高糖DMEM、10% FBS和1%青/鏈霉素混合均勻后使用。磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑購自美國Sigma公司，RIPA裂解液購自中國碧云天生物科技有限公司，使用RIPA 裂解液1 mL/0.1 g組織、蛋白酶抑制劑10 μL/0.1 g組織(1片溶于100 mL三蒸水)、磷酸酶抑制劑1 μL/0.1 g組織的混合液裂解小鼠肝臟組織。地塞米松(DEX)、IBMX和胰島素購自美國Sigma公司，使用終濃度為地塞米松1 μmol /L、IBMX 500 μmol /L、胰島素10 μmol/mL 與DMEM的混合液誘導小鼠胚胎成纖維細胞脂肪分化。Trizol購自美國Invitrogen公司，按1 mL/0.1g組織提取mRNA。mRNA反轉(zhuǎn)使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(SYBR green法)購自中國TaKaRa公司，組織蛋白定量使用BCA蛋白定量試劑盒購自中國碧云天生物科技有限公司，Western blotting 檢測使用p-GR抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，UCP1抗體購自美國Abcam公司，使用比例均為抗體：稀釋液=1:1 000。

1.4實驗方法

1.4.1小鼠高脂飼養(yǎng)和體重測量：隨機選取6周齡雄性PP5 KO和WT小鼠各6只，高脂喂養(yǎng)6周，每周稱量并記錄小鼠體重1次。

1.4.2MRI掃描小鼠體內(nèi)脂肪：取上述高脂喂養(yǎng)6周后的PP5 KO和WT雄鼠各3只， 2%異氟寧/O2(L/min) 對其進行麻醉后使用MRI進行掃描，應(yīng)用IRW軟件(Inveon Research Workplace，Siemens，美國)計算小鼠脂肪體積。

1.4.3肝臟組織HE染色和油紅O染色：隨機選取上述高脂誘導后PP5 KO和WT雄鼠各3只，脫頸處死，肝臟以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后以4 μm厚度切片，隨后進行HE染色。另取1 cm × 1 cm × 0.5 cm大小肝臟經(jīng)冰凍切片后，進行油紅O染色。組織切片染色封片后光學顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.4.4MEF細胞誘導脂肪分化：參考文獻方法[6]，永生化PP5 KO和WT型MEF細胞按2×105個/孔接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中，使用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素)在37℃、5% CO2條件的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度達80%密度時(記為d-2)，繼續(xù)培養(yǎng)2天(記為d0)。在d0時，將培養(yǎng)基更換為含有脂肪分化誘導劑的DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、500 μmol /L IBMX、1 μmol /L DEX、10 μmol/mL insulin)。2 天后(d2)將培養(yǎng)基更換為只含有10% FBS和10 μmol /mL insulin的DMEM培養(yǎng)基，以后每2 d更換1次DMEM 培養(yǎng)基(10% FBS、1%青霉素-鏈霉素至d8。當細胞誘導分化至第8天時將細胞取出經(jīng)油紅O染色后，在光學顯微鏡(BX50，Olympus，日本)下觀察并照像。

1.4.5肝臟mRNA提取及Real-time-PCR檢測：取高脂誘導后PP5 KO和WT雄鼠各3只，脫頸處死，取其肝臟。以TRIzol法提取小鼠肝臟mRNA后，各樣本以500 ng mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以Gapdh作為內(nèi)參，使用SYBR green相對定量法進行PCR擴增反應(yīng)。實驗中用到的引物序列如下表1：

1.4.6Western blotting檢測肝臟蛋白表達：取高脂誘導后PP5 KO和WT雄鼠各3只，脫頸處死，取其肝臟在冰上以RIPA蛋白裂解液(含10%蛋白酶抑制劑、1%磷酸酶抑制劑)提取組織蛋白。蛋白經(jīng)BCA法定量后以60 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后孵育一抗(UCP1，1:1000；p-GR，1:1000)過夜。次日孵育二抗(1:5000)后以ECL法使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)采集熒光信號。

表1　Realtime-PCR檢測引物

2　結(jié)果

2.1PP5 基因敲除小鼠對高脂誘導的體重增加明顯抑制

PP5 KO小鼠在高脂喂養(yǎng)3周后，體重明顯輕于野生型小鼠；高脂誘導5周后，野生型小鼠體重達到(28.61±1.00)g，而PP5基因敲除小鼠體重僅為(23.70±0.72)g，二者相比具有顯著性差異(P=0.0074，圖1)。攝食量測定結(jié)果顯示，PP5 KO小鼠和WT小鼠的攝食量沒有差別，說明敲除PP5并不影響小鼠的攝食量。以上結(jié)果表明PP5基因敲除小鼠能夠抵制高脂誘導的體重增加。

注：高脂飼養(yǎng)后小鼠周體重記錄，n=6。*，P<0.05；**，P<0.01。圖1　敲除PP5基因?qū)π∈篌w重的影響Note. The body weight of mice fed with high fat diet was recorded every week. n =6. *, P<0.05, **, P<0.01.Fig.1　The effect of knocking out PP5 on body weight of the mice.

2.2敲除PP5基因抑制高脂誘導的小鼠體內(nèi)脂肪積累

通過核磁共振成像儀對高脂喂養(yǎng)6周后的WT和KO小鼠體內(nèi)脂肪含量進行測定。圖2A顯示的白色區(qū)域表示脂肪組織，從圖中可以看出WT小鼠的脂肪含量多于KO小鼠。運用Inveon Research Workplace軟件計算白色區(qū)域的絕對脂肪面積，除以體重即是單位體重的絕對脂肪體積，結(jié)果如圖2 B所示，WT小鼠的單位體重的絕對脂肪體積顯著高于KO小鼠(P=0.0476)。這一結(jié)果表明，PP5 KO小鼠體脂含量顯著少于對照組，未出現(xiàn)肥胖表型，提示敲除PP5基因能夠抑制小鼠體內(nèi)脂肪積累。

2.3敲除PP5基因小鼠肝臟脂肪沉積明顯較少

高脂飼養(yǎng)6周后，WT小鼠肝臟切片HE染色顯示有顯著的脂肪堆積(空泡為脂肪組織)，而PP5 KO小鼠肝臟切片中脂肪堆積明顯少于WT，并且其脂肪顆粒較小(圖3 A-D)。脂肪特異性油紅O染色法對高脂誘導后的WT和PP5 KO小鼠肝臟進行分析，結(jié)果與HE染色一致(圖3 E-H)，高脂誘導后WT小鼠肝臟切片出現(xiàn)大量的紅色脂滴，脂肪沉積嚴重，而PP5 KO小鼠肝臟切片與WT相比紅色脂滴明顯減少，并且脂滴較小。這些結(jié)果揭示PP5可能通過調(diào)節(jié)小鼠脂肪細胞的形成或者脂肪分解影響脂代謝。

2.4敲除PP5基因?qū)π∈笈咛コ衫w維細胞脂肪分化的影響

小鼠MEF細胞體外誘導脂肪分化實驗結(jié)果顯示，對體外誘導脂肪分化至第8天的小鼠MEF細胞進行油紅O染色，結(jié)果如圖4所示，與WT MEF細胞相比，PP5 KO MEF細胞在體外誘導脂肪分化后產(chǎn)生的脂滴數(shù)量明顯較少，且脂滴大小也小于WT MEF細胞。這一結(jié)果進一步證實敲除PP5基因脂肪細胞的分化受到抑制。

注：A.小鼠磁共振圖；B.脂肪體積與小鼠體重比統(tǒng)計圖，n =3。*，P<0.05；**，P<0.01。圖2　敲除PP5對小鼠脂肪含量的影響Note. A: MRI photograph of mice. B: Statistic result of fat volume/body weight/ratios. n =3. *, P<0.05; **, P<0.01.Fig.2　The effect of knocking out PP5 on the mouse whole body fat

2.5敲除PP5對小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因的影響

利用real-time PCR技術(shù)檢測了高脂誘導后脂肪形成標記基因包括CD36、AP2、PPARγ2、Glut4及能量代謝相關(guān)基因GR和UCP1的表達。結(jié)果(圖5 A-D)顯示，與WT小鼠相比KO小鼠肝臟中CD36、AP2、PPARγ2和Glut4表達顯著減少，GR表達沒有差異性變化(圖5E)，但解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)表達量卻顯著性升高(圖5 F)。用western blotting技術(shù)檢測了p-GR和UCP1在蛋白水平上的變化。結(jié)果顯示(圖6)，高脂誘導后PP5 KO小鼠肝臟中p-GR和UCP1蛋白表達量顯著升高。這些結(jié)果表明PP5敲除后小鼠能量代謝增強，脂肪分化減弱。

3　討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)在細胞水平敲除PP5可使脂肪分化作用減弱[5]。本研究利用PP5基因敲除小鼠和PP5敲除小鼠MEF細胞，從體內(nèi)和體外兩方面探討敲除PP5基因?qū)χx的影響以及參與這一過程的分子機制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂誘導后PP5 KO小鼠體重較WT小鼠顯著減輕，單位體重脂肪體積顯著低于WT小鼠。進一步通過對高脂飼養(yǎng)小鼠肝臟HE和油紅O染色證實，引起上述表型的原因可能是PP5 KO小鼠脂肪分化減少或者脂肪代謝增強導致。體外誘導MEF細胞脂分化實驗證實，敲除PP5基因具有明顯降低脂分化的能力。通過real-time PCR和western blotting技術(shù)分析脂肪代謝相關(guān)基因表達，發(fā)現(xiàn)PP5 KO脂肪形成標記基因CD36、AP2、PPARγ2、Glut4相對表達量顯著降低，能量代謝相關(guān)基因GR相對表達量無顯著性變化，但磷酸化GR(p-GR)和UCP1的蛋白表達量顯著升高。這些結(jié)果表明PP5基因敲除后小鼠能量代謝增強，脂肪分化減弱。

高脂飲食和運動缺乏的情況下機體會將未能消耗的營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化為脂肪儲存在脂肪組織、肝臟、肌肉中。一旦體內(nèi)能量供應(yīng)不足時，GCs就會促進脂肪和蛋白質(zhì)分解，為機體提供能量。而GR通過介導GCs實現(xiàn)對機體糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和分解代謝等功能的調(diào)節(jié)作用，GCs是全身能量平衡的重要調(diào)節(jié)因子[1]，因而GR作為轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控脂肪分解基因、脂肪形成基因，如CD36和Glut4的表達對機體的物質(zhì)能量代謝起到重要調(diào)控作用。GR與熱休克蛋白90相互結(jié)合，而PP5通過它的TPR結(jié)構(gòu)域與熱休克蛋白90結(jié)合，從而與GR構(gòu)成復合物行使轉(zhuǎn)錄因子功能[7]。PP5作為蛋白磷酸酶能夠使GR去磷酸，這將增強GR的活性[1, 4, 8]。我們的實驗結(jié)果表明當PP5敲除后GR磷酸化水平升高，抑制脂肪形成相關(guān)基因CD36、AP2、PPARγ2、Glut4的表達，在PP5 KO小鼠體內(nèi)揭示了PP5對脂肪形成的抑制作用這與已報道的體外實驗結(jié)果一致，并且當PP5 KO MEF細胞重新獲取PP5之后這種抑制作用減弱[5]。

注：A-D.肝臟石蠟切片HE染色；E-H.肝臟冰凍切片油紅O染色.圖3　 PP5對小鼠肝臟脂肪的影響(10倍，標尺=200 μm；40倍，標尺=50 μm)Note. A-D: HE staining; E-H: Oil red O staining. Fig.3　Effect of PP5 on the mouse liver fat. 10 times, bar=200 μm; 40 times, bar=50 μm.

注：A-F.誘導分化后WT和KO MEF細胞油紅O染色。圖4　敲除PP5基因抑制MEF細胞脂肪分化(10倍，標尺=200 μm；40倍，標尺=50 μm)Note: A-F. Adipocyte deffereniation of WT and KO mouse embryonic fibroblasts.Oil red O staining. Fig.4　Knocking out PP5 prevents the adipogenesis of MEF cells (10 times, bar=200 μm; 40 times, bar=50 μm)

注：n=3。*，P<0.05；**，P<0.01。圖5　肝臟中脂代謝相關(guān)基因表達Note: n=3. *, P<0.05; **, P<0.01.Fig.5　Expression of lipid metabolism-related genes in the mouse livers.

圖6　肝臟中UCP1和p-GR的表達Fig.6　The expression of UCP1 and p-GR in the livers

哺乳動物體內(nèi)的脂肪組織分為白色脂肪和棕色脂肪，白色脂肪主要以甘油三脂的形式儲存能量，而棕色脂肪則通過氧化分解脂肪為機體提供熱量[9]，這種作用主要通過線粒體膜上的解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)完成[10]。已有研究證實與野生型小鼠相比UCP1缺乏的小鼠對高脂誘導型肥胖更加敏感[11]，與此相反，過表達UCP1的小鼠抵抗高脂誘導型肥胖[12]。我們實驗中發(fā)現(xiàn)，當PP5敲除后小鼠UCP1表達量升高且小鼠表現(xiàn)出對高脂誘導型肥胖的抵抗，這一現(xiàn)象此前未見報道，但PP5通過UCP1調(diào)控小鼠能量代謝的具體機制尚不清楚，有待進一步的研究。由于PP5是一種蛋白磷酶，目前尚未有關(guān)于PP5是否能夠影響UCP1磷酸化的報道，而糖皮質(zhì)激素(GCs)能夠抑制UCP1的表達[13]，因此我們推斷PP5 KO中UPC1的增加是一個間接調(diào)控過程， 可能的機理也許是PP5敲除后GR活性增強，大量的GCs與GR結(jié)合從而對UCP1的抑制減弱，UCP1的表達量升高進而增強由UCP1介導的脂分解能量代謝。PP5，GR和UCP1三者之間的關(guān)系還有待進一步的深入研究。

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Influence of protein phosphatase 5 on the lipid metabolism in mice

WANG Jun1, QIU Bin2, LIU Ming2, WANG Chao2,YONG Wei-dong2, XIE Zhong-wen1

(1. College of Tea and Food Sciences, State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University,Hefei 230036, China; 2. Laboratory of Gene and Development, Chinese Academy of Medical Sciences , Beijing 100021)

ObjectiveTo investigate the effect of protein phosphatase 5 (PP5) on lipid metabolism in the PP5 knockout (KO) mice. Methods Male PP5 KO and wild type (WT) mice at the age of 6 weeks were used in this study. In order to study the effect of high fat diet (HFD) feeding, the body weight was measured. The liver histology was examined by HE and oil red O staining. To further verify PP5 functions in the adipogenesis,invitroexperiment was carried out using mouse embryonic fibroblasts (MEF). Western blotting and real-time PCR were performed to quantified the expression of lipid metabolism-related genes in the liver tissues.ResultsCompared with the WT mice, the body weight gain was slower in the KO mice. The size of the lipid droplets was smaller and the quantity was less in the KO mouse liver tissue.Invitrostudy revealed that the KO mouse MEF cells showed less differentiated adipocytes with smaller lipid droplets than the WT MEF cells. This observation was further confirmed by detecting the expression of adipogenesis-related genes in the HFD liver. The markers of adipocyte differentiation, such asCD36,AP2,PPARγ2, andGlut4, were significantly decreased, while energy expenditure-related markers, such as phosphorylation of GR and expression of UCP1, were significantly increased. ConclusionsProtein phosphatase 5 may play a regulatory role in the mouse lipid metabolism through regulating the de-phosphorylation of p-GR and enhancing the expression of UCP1.

Protein phosphatase 5; GR; UCP1; Adipocyte differentiation; Energy metabolism; Mice

國家自然科學基金(81272273)、國家科技重大專項(2014ZX10004002-003-001)資助。

王君(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與發(fā)育生物學。E-mail: junwang138@sina.com。

謝忠穩(wěn)，男，教授，研究方向：營養(yǎng)與代謝生物學，Email: zhongwenxie@ahau.edu.cn；雍偉東，男，研究員，研究方向：生殖與發(fā)育生物學，Email: wyong@cnilas.org。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0079-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.013

2016-04-19